非还原性糖类生成酶及其制备和应用的制作方法

专利名称：非还原性糖类生成酶及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的非还原性糖类生成酶，以及它的制备和应用。更具体地说，涉及这样一种新的还原性糖类生成酶;当其作用于一种或多种具有3个或3个以上的葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物时，生成一种具有海藻糖结构的非还原性糖类，还涉及这种酶的制备，以及能够产生这种酶的微生物。本发明还涉及含有可由这种酶制备的以海藻糖结构为末端单元的非还原性糖类的组合物，含有上述非还原性糖类的还原性比较低的糖类，和/或由这种糖类所制备的海藻糖。
海藻糖或α，α-海藻糖长期以来一直被认为是由葡萄糖单元组成的非还原性糖类。正如在Advance in Carbohydrate Chemistry，18卷，第201-225(1963)中(由美国的Academic Press出版)和在Applied and Environmental Microbiology，第56卷，3213-3215页(1990)中所公开的，海藻糖广泛存在于微生物、蘑菇和昆虫中，但含量较低。由于非还原性糖类包括不会与具有氨基的物质，如氨基酸和蛋白质反应的海藻糖，所以它们即不会引起氨基-羰基反应，也不会改变含有氨基酸的物质。因此，非还原性糖类被认为可以使用而不用担心会引起不理想的褐变和变质。因为上述原因，就迫切需要建立一种制备这种还原糖的方法。
在海藻糖的传统制备方法中，和在日本专利公开号No.154，485，75中所公开的，采用的微生物，或者如日本专利公开号No.216，695 83中提出的，同时采用麦芽糖酶-和麦芽糖磷酸化酶将麦芽糖转化成海藻糖。然而，前一种方法不适于工业规模的制备，因为海藻糖在作为原材料的微生物中的含量以干固体物计(d.s.b.)低于15w w%(“w/w%”的表达形式在说明书中可简化为“%”，除非另有说明)，且分离和提纯步骤复杂。而后一种方案具有如下缺点(ⅰ)因为海藻糖是通过葡萄糖-1-磷酸生成的，作为底物的麦芽糖不能以较高的浓度使用;(ⅱ)因为磷酸化酶促反应体系是可逆反应，所以目的产物海藻糖的产量较低;(ⅲ)要保持该反应体系的稳定和顺利延续其酶促反应实际上是困难的。
关于海藻糖的制备，在“Food Chemicals"，No.88，67-72页(1992年8月)上题为“Current Status of Starch Application Development and Related Problems”的章节中的标题为“Oligosaccharides”的专栏中有报道“尽管海藻糖具有广泛的用途，但是通过直接糖转移反应或水解反应的酶促制备海藻糖的方法在本领域被认为从科学上来讲是不可能的。”因此，以淀粉为材料酶促制备海藻糖的方法被认为从科学上讲是极为困难的。
业已知道，由淀粉材料，如液化淀粉、环状糊精和麦芽寡糖制备的淀粉的部分水解产物通常以还原性末端基团为末端单元。在说明书中，这种淀粉的部分水解产物被称为“非还原性的淀粉部分水解产物”。这种还原性淀粉部分水解产物的还原能力通常表达为以其干固体物重计的“葡萄糖当量(DE)值”。业已知道，还原性淀粉部分水解产物中那些具有较高的DE值的产物通常具有较低的分子量和粘度，以及较高的适宜甜度和反应性，且易与含有氨基的物质如氨基酸和蛋白质反应，使其品质发生不理想的褐变、发臭和变质。
还原性淀粉部分水解产物的这些不利特性根据其DE值有所变化，且还原性淀粉部分水解产物与其DE值之间的关系是极为重要的。甚至在本领域中一直认为要打破这种关系是不可能的。
打破这种关系的唯一途径是一种在较高的氢压下通过氢化还原性淀粉部分水解产物将其还原性末端基团转化成羟基而将这种水解产物制成非还原性糖类。不过，这种方法需要高压灭菌锅并耗费大量的氢和能源，而且还需要较高的水平的控制或安全设施以免发生灾难。还原性部分淀粉水解产物与所得产物不同，因为前者由葡萄糖单元组成，而后者，即所得淀粉部分产物的糖醇则是由葡萄糖和山梨醇组成，当将其用在人体上时可能导致出现消化紊乱或腹泻症状。因此，迫切需要建立一种降低甚至消除还原性淀粉部分水解产物的还原能力而又不改变以葡萄糖单元作为其组分糖的状况的方法。
本发明的目的是要提供一种新的非还原性糖类及其应用，并由还原性淀粉部分水解产物来制备，以使打破传统上认为的还原性部分淀粉部分水解产物和其DE值之间的关系，并揭示这种非还原性糖类的新用途。
为达上述目的，本发明人广泛筛选了能产生一种新的非还原性糖类生成酶的微生物，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时，可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。
结果，从日本冈山市和Soja市的土壤中分别分离出了根瘤菌属(Rhizobium)的新微生物，命名为“Rhizobium Sp.M-11”，和节杆菌属(Arthrobacter)的新微生物，命名为“Arthrobacter Sp.Q36”;并发现上述微生物能产生非还原性糖生成酶，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时，能生成具有海藻糖结构的非还原性糖类，而且当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时容易制备出所需要的非还原性糖类。
我们还发现，通过先将这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物再将所得非还原性糖类用葡萄糖淀粉酶或α-葡萄糖苷酶处理可很容易地制备出海藻糖。这样，本发明人完成了这一发明。此外，我们还从常规微生物中广泛筛选了能产生这种酶的微生物。
结果发现，短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微珠菌属(Micrococcus)、弯曲杆菌(Curtobacterium)和土杆菌属(Terrabacter)的微生物与根瘤菌属和节杆菌属的微生物一样能产生这种非还原性糖类生成酶，并且我们完成了这一发明。另外，我们建立了制备含有这种非还原性糖类及含非还原性糖类的还原性较低的糖类和/或由这种糖类制成的海藻糖的组合物如食品、化妆品和药品的制品方法，而且我们完成了这一发明。


图1表示温度对由根瘤菌属的Rhizobium SP.M-11菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图2表示pH值对由根瘤菌属的Rhizobium SP.M-11菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图3表示由Rhizibium SP.M-11菌获得的非还原性糖类生成酶的热稳定性。
图4表示由Rhizibium SP.M-11菌获得的非还原性糖类生成酶的pH稳定性。
图5表示温度对由节杆菌属的Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图6表示pH值对由Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的活性的影响。
图7表示由Arthrobacter SP.Q36菌获得的非还原性糖类生成酶的热稳定性。
图8表示由Arthrobacter SP.Q36获得的非还原性糖类生成酶的pH稳定性。
本发明涉及一种新的非还原性糖类生成酶，以及它的制备和应用。本发明还涉及能够产生这种酶的微生物，用这种酶所制备的非还原性糖类含有所说非原性糖类的相对低还原性糖类，由这些糖类制备的海藻糖、以及含有这些糖类和海藻糖的之一和两者的组合物。
本发明人广泛筛选了能够产生一种新的非还原性糖类生成酶的微生物，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时能生成具有海藻糖结构的非还原性糖类，最终发现了目标微生物。
现在，本发明人首先阐述该根瘤菌属微生物，即本发明的“Rhizobium Sp.M-11”菌的鉴定试验。该试验是按照在“Bisebutsu-no-Bunvui-to-Dotei”(微生物分类和鉴定)中所述方法进行的。该书由Takej Hasegawa编辑，由日本科协出版社出版，日本，东京(1985)。结果如下A.形态学当在27℃在营养琼脂中培育时细胞的特征一般呈0.6～0.8×1.0～1.5μm的杆状;
一般单独存在，但偶尔也以偶联或接合形式存在;
不表现出多形性;
具有游动性、不产孢子性和鞭毛;
不耐酸;
革兰氏染色阴性;
胞襄无;
异染粒有;
能积累多-β-羟丁酸。
B.培养特性(1)当在27℃在营养琼脂板中培养时所形成的菌落的特征形状在培养24小时之后圆形菌落的直径为1.5mm左右;
边缘完整;
突出物平均或半球形;
光泽有;
表面光滑;
颜色乳白色半透明;
(2)在27℃温度下，在含有葡萄糖和胰蛋白胨的琼脂板上培养时所形成菌落的特征乳白色半透明菌落具有类粘蛋白;
(3)在27℃温度下，在含有酵母抽提物和甘露醇的琼脂板上培养时所形成菌落的特点形状培养5天后，圆形菌落的直径为3mm左右;
颜色乳白色半透明菌落具有类粘蛋白;
(4)在27℃温度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和刚果红的琼脂板上培养时所形成菌落的特征呈浅桃红色且基本上不吸收刚果红;
(5)在27℃的温度下，在含有酵母抽提物、甘露醇和2w/v% NaCl的琼脂板上生长;
(6)在27℃温度下，在营养琼脂斜面上培养时所形成菌落的特征生长令人满意;
形状丝状;并且(7)在27℃温度下在营养明胶上穿刺培养时不会液化明胶。
C.生理特性(1)硝酸还原作用阳性(2)反硝化作用阴性(3)甲基红测验阴性(4)VP-测验阴性(5)吲哚生成阴性(6)硫化氢生成阳性(7)淀粉水解阴性(8)柠檬酸的利用阳性(9)无机氮源的利用利用了铵盐和硝酸盐;
(10)色素的生成未生成可溶的色素;
(11)脲酶阳性(12)氧化酶阴性(13)过氧化氢酶阳性(14)生长条件在pH5.5～9.0和温度4～35℃范围内生长;
(15)需氧情况需氧;
(16)碳源的利用和酸的生成碳源 利用 酸生成D-葡萄糖 + +D-半乳糖 + +D-果糖 + +L-阿拉伯糖 + +D-木糖 + +L-鼠李糖 + +麦芽糖 + -蔗糖 + +乳糖 + -海藻糖 + -棉子糖 + +甘露醇 + -糊精 + -半乳糖醇 + -(17)对氨基酸的脱羧酶测验对L-赖氨酸，L-精氨酸和L-鸟氨酸呈阴性;
(18)氨基酸的利用利用L-谷氨酸钠、L-天冬氨酸钠、L-组氨酸和L-脯氨酸;
(19)DNase(脱氧核糖核酸酶)阴性;
(20)3-酮乳糖的生成阴性;以及
(21)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)的Mol%61%。
参考《柏捷氏细菌分类学手册》第1卷(1984)对这种微生物和已知微生物的细菌学特征进行了比较。结果证实这种微生物确系根瘤菌属的一种微生物。这种微生物在某些特性上类似于草木犀根瘤菌种(Rhizobium melitoti)，但它们在以下方面是不同的本发明微生物利用麦芽糖、乳糖和甘露醇但不生成酸，它能产生一种非还原性糖类生成酶，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时会生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。没有出版物报道过具有这种特性的这样一种微生物。
基于这些结果，本发明人将这种微生物命名为“Rhizobium Sp.M-11”，并于1992年12月24日将其保藏在工业科学技术机构的发酵研究所，Ibaraki，日本。微生物的保藏于当天被接受，并由该研究所以FERM BP-4130的入藏号保存。
除了上面所鉴定的微生物之外，根瘤菌属的其它菌株及其突变体也可适当地用于本发明中，只要它们能够产生这种非还原性糖类生成酶。
对节杆菌属的一种微生物，即本发明的Arthobacter Sp.Q 36菌的鉴定试验得出了以下结果。该试验与Rhizobium Sp.M-11菌的鉴定类似，也是按照在“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物分类与鉴定)一书中所记载的方法进行的。该书由Takej Hasegawa编辑，由日本科协出版社出版，日本，东京(1985)。结果如下
A.形状学(1)当在27℃温度下在营养琼脂中培养时细胞的特征通常呈0.5～0.7×0.8～1.6μm的杆状;
单独存在;
表现出多形性;
不具备游动性、鞭毛和不产孢子性;
不耐酸;
革兰氏染色阳性;
胞襄无;
(2)当在27℃的温度下在EYG琼脂中培养时细胞的特征呈杆状球形环。
B.培养特性(1)在27℃温度下，在营养琼脂板上培养时所形成菌落的特征形状培养3天之后圆形菌落的直径为2-2.5mm左右;
边缘完整;
突出物半球形;
光泽湿润的光泽;
表面光滑;
颜色半透明和白色或淡黄色;
(2)在27℃温度下，在营养琼脂板上进行斜面培养时细胞的特征生长率令人满意;
形状丝状(3)当在27℃温度下，在含有酵母抽提物和胨的琼脂板上进行斜面培养时细胞的特征生长率令人满意;
形状丝状;
(4)当在27℃温度下肉汤和明胶中进行穿刺培养时细胞的特征液化肉汤和明胶。
C.生理特性(1)硝酸还原作用有(2)反硝化作用无(3)甲基红测验阴性(4)VP-测验阳性(5)吲哚的生成阴性(6)硫化氢的生成阳性(7)淀粉水解作用阴性(8)纤维素水解作用阴性(9)柠檬酸的利用阳性(10)无机氮源的利用利用了铵盐和硝酸盐(11)色素的生成阴性(12)脲酶阳性(13)氧化酶阴性(14)过氧化氢酶阳性(15)生长条件在pH5-10和温度4-37℃的范围内生长(16)需氧情况需氧(17)碳源的利用和酸的生成碳源 利用 酸的生成D-葡萄糖 + -D-半乳糖 + -D-果糖 + -L-阿拉伯糖 + -D-木糖 + -L-鼠李糖 + -麦芽糖 + -蔗糖 + -乳糖 + -棉子糖 + -甘露糖 + -糊精 + -半乳糖醇 + -(18)氨基酸的利用利用L-谷氨酸钠、L-天冬氨酸钠、L-缓氨酸和L-脯氨酸;
(19)脱氧核糖核酸酶(DNase)阴性;
(20)3-酮乳糖的生成阴性;
(21)细胞壁的主要二氨基酸赖氨酸;
(22)DNA中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶的Mol%63%。
参考《柏捷氏细菌分类学手册》，第2卷(1984)，对这种微生物和已知微生物的细菌学特性进行了比较。结果发现，这种微生物被证实为节杆菌属的微生物。这种微生物具有这样一个特征它能产生一种非还原性糖类生成酶，当这种酶作用于还原性淀粉部分水解产物时能生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。还没有出版物记载过这样一种酶。
基于上述结果，本发明人将这种微生物定命为“Arthobacter Sp.Q36”菌，并于1993年6月3日将其保藏在工业科学技术机构的国立生物科学与人体技术研究所，Ibarak，日本。该微生物的保藏已于当天被接受，并由该研究所以FERM BP-4316的入藏号保存。
除上述微生物之外，节杆菌属的其它菌株及其突变体也可适当的用于本发明，只要它们能够产生这种非还原性糖类生成酶。
任何微生物均可用于本发明，只要它能够产生这种酶。例如，除上述Rhizobium Sp.M-11(FERM BP-4130)和Arthrobacter Sp.Q36(FERM BP-4316)之外，迄今已知的其它微生物，如以下种的微生物Brevibacterium helovolum(ATCC 11822)，水生黄杆菌(Flavobacterium aquatitle)(IFO 3772)，藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)(IFO 3064)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 186)，耻垢分技杆菌(Mycobacterium Segmatis)(ATCC 19420)，Terrabacter tumescens(IFO 12960)以及它们的突变体也可有利地用于本发明。
任何一种营养培养基均可用于本发明，只要这种微生物能在其中生长并产生这种非还原性糖类生成酶例如，合成的和天然的营养培养基均可用作这种营养培养基。任何含碳的物质均可用作本发明的碳源，只要它能够被这种微生物利用这种碳源的例子有糖类，如葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘糖醇、山梨醇、糖蜜和还原性淀粉部分水解产物;还有有机酸类，如柠檬酸和琥珀酸。营养培养基中这种碳源的浓度是适当选择的。例如，在采用还原性淀粉部分水解产物时，鉴于微生物的生长，理想的浓度以干固体物计通常为20%或更低，更具体地说为5%或更低，可用于本发明的氮源有，例如无机化合物，象铵盐和硝酸盐;还有含氮的有机物质，象尿素、玉米浆、酪蛋白、胨、酵母抽提物和牛肉膏。可用于本发明的无机成分有，例如，钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐，还有镁、锌、铁、铜、钼和钴的其它盐类。如有必要，也可将氨基酸和维生素适当地结合使用。
可用于本发明的微生物是在好氧条件下培养，通常温度为4-40℃，20～37℃较理想;pH为4-10，pH 5-9较理想。用于本发明的培养时间定的要比这种微生物开始生长的时间长一些，10-100小时较好。营养培养基中的溶解氧(DO)浓度不受特殊限制，但通常在0.5～20ppm范围内。通过控制通气、搅动、充氧气和提高发酵罐的内部压力的方式可将DO浓度维持在该范围内。培养可以分批方式或连续方式进行。
在结束微生物培养之后，回收这种酶。由于在细胞和无细胞的上清液中都发现了这种酶，因此，可将这些细胞和上清液作为粗制酶加以回收。所得培养物也可原封不动地用作粗制酶。传统的液体-固体分离方法可在本发明中用作从培养物中去除细胞的方法。例如，直接将所得培养物离心的那些方法，还有用预涂滤器过滤培养物的方法，或通过采用平板滤器或系列纤维(follow fibers)的膜过滤分离细胞的方法均可适当地采用。尽管这样所获得的无细胞滤液可以原封不动的用作酶溶液，但在用之前可将其浓缩。可用于本发明的浓缩方法有，例如用硫酸氨盐析，用丙酮和乙醇沉淀，也可用膜如平板滤器和系列纤维浓缩。
无细胞滤液及其浓缩物可进行常规固相化处理。这种常规方法的例子有利用离子交换剂的结合法，利用树脂和膜的共价键结合和吸收法，以及利用高分子量物质的内含法。从所得培养物中分离出的细胞可以用作粗制酶而不加任何处理，或者在使用前将其固定。例如，通过将这种细胞与藻酸钠混合并将所得混合物滴入氯化钙溶液中以使所滴入的液体凝胶化成颗粒从而将其固定。因此所获得的颗粒可以通过用聚乙烯亚胺或戊二醛处理而被固定。细胞提取物在本发明中也可用作粗制酶溶液。例如，通过从用超声波破碎、利用玻璃珠和氧化铝的机械破碎和frehch-press破碎方法处理过的细胞中提取这种酶来制备含有这种酶的透明的粗制酶溶液;并对所得到的提取物进行离心或膜过滤处理。
由此所获得的粗制酶溶液可以原样使用或者在用常规方法提纯之后再使用。例如，纯化的酶制剂在电泳时只出现一条谱带，这种纯化酶的制备是透析经硫酸铵盐析和浓缩所制成的粗酶制剂并用采用“DEAE Toyopearl
”(一种阴离子交换树脂)的阴离子交换柱层析、采用“Butyl Toyopearl
”(一种疏水树脂)的疏水性柱层析、和采用“Toyopearl
HW-55”(一种用于凝胶过滤的树脂)的凝胶过滤层析法连续地纯化透析溶液。上述树脂都是Tosoh公司的产品(日本、东京)。
由此所获得的这种非还原性糖类生成酶具有以下物理化学特性(1)作用当作用于具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的一种或多种还原性淀粉部分水解产物时，生成以海藻糖结构为末端单元的非还原性糖类;
(2)分子量通过十二浣基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得约为76，000±87，000道尔顿;
(3)等电点(PI)在利用两性电解质进行等电电泳时约为3.6±4.6;
(4)最适温度当在pH7.0条件下培养60分钟时约为35-40℃;
(5)最适pH当在40℃温度下培养60分钟时约为pH6.4-7.2;
(6)热稳定性当在pH7.0条件下培养60分钟时在大约35-40℃温度下都是稳定的;
(7)pH 稳定性当在25℃温度下培养16小时时，pH稳定在5.5～11.0的范围。
这种非还原性糖生成酶的活性测定如下将1ml酶溶液加入4ml用50mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)配制的1.25w v%的麦芽戊糖中，并将该混合液在40℃保温60分钟。将该反应混合液加热至100℃处理10分钟以终至该酶促反应，并用去离子水将该反应混合物精确地稀释10倍，接着用Somogyi-Nelson′s方法测定该稀释溶液的还原力。作为对照，对曾被加热至100℃处理10分钟以使其失活的酶溶液进行类似的处理。该酶的一个活性单位被定义为在1分钟内消除1微摩尔麦芽戊糖的还原力所需要的酶量。
可用作这种酶的底物的还原性部分淀粉水解产物是那些通过用淀粉酶或酸部分水解淀粉状物质，如淀粉、支链淀粉和直链淀粉所制备的产物。通过用淀粉酶水解所获得的这种还原性淀粉部分水解产物，包括那些用淀粉酶如α-淀粉酶、麦芽三糖生成酶、麦芽四糖生成酶、麦芽戊糖生成酶和麦芽已糖生成酶水解淀粉状物质所制备的具有直链和支链结构的水解产物，如在由Dergamon出版社出版的Handbook of Amylases and Related Enzymes一书中所公开的(日本，东京，1988)。在制备还原性淀粉的部分水解产物时，将脱支酶如支链淀粉酶和异淀粉酶与淀粉酶结合使用是有利的。可将一种或多种麦芽糖低聚糖如麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽己糖和麦芽庚糖任意用作还原性淀粉的部分水解产物。
在本发明中被用作底物的还原性淀粉部分水解产物的浓度没特殊限定。尽管即便底物溶液的浓度低至0.1%时这种酶促反应也能发生，但是，当底物溶液的浓度为2%或更高时这一酶促反应会进行的更好，最好采用浓度为5～50%的底物(d.s.b.)。在这样的浓度下，具有海藻糖结构的非还原性糖类可以令人满意的高产率顺利形成。含有不可溶的底物的悬浮液也可物于本发明。本发明酶促反应的温度可以这样确定，在该温度下这种酶不会失活，即反应温度可达到约55℃，最好采用40～50℃范围内的温度。用于本酶促反反应的pH控制在5～10的范围，最好在6-8之间。该酶促反应的反应时间是根据酶促反应条件适当选择的。
所得到的含有非还原性糖类的反应混合物的还原力远低于用作底物的还原性淀粉部分水解产物的还原力。例如，在以麦芽庚糖为底物时，其原有还原力减少约93%，或者说其还原力相对原有还原力而言下降至约7%。
所得的反应混合物以常规方法过滤和离心分离，以便除去不溶性物质，并用活性碳将所得溶液脱色，用H型和OH型的离子交换剂脱盐，然后浓缩成浆状制品。这种浆状制品可适当地干燥成粉状制品。如有必要，可方便地将这种粉状制品制备成具有最大可能纯度的非还原性糖类，是通过采用一种或多种方法提纯这种粉状制品进行制备的，例如，柱层析分级分离，象离子交换柱层析，采用活性碳和硅胶的柱层析;采用有机酸如丙酮和乙醇的分离法;以及用碱处理分解和除去残留的还原性糖类。
更具体地说，离子交换柱层析方法可适当地在本发明中被用作工业规模制备这种目标糖类的方法。具有改进的纯度的目标非还原性糖类可用采用强酸性阳离子交换树脂的柱层析法(如在日本专利公开号23，799/83和72，598/83中所述)除去伴随糖类而制成。在这种情况下，可以使用固定床、移动床和半移动方法中的任何一种。
如有必要，可用淀粉酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶水解这种具有海藻糖结构的非还原性糖类或含有这种非还原性糖类的还原性较低的糖类，以控制其甜度和还原力或降低其粘度;并且所得的产物还可以用各种处理方法进一步处理，在处理过程中，残留的还原性糖被氢化成糖醇而失去其还原力。
更具体地说，通过将葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于这种非还原性糖类或含有这种糖的还原力较低的糖类可很容易地制备海藻糖。通过用葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于这种糖类生成海藻糖和葡萄糖混合物，并对这种混合物进行上述的纯化处理，如离子交换柱层析以除去其中的葡萄糖可以获得高海藻糖含量的部分。该高海藻糖含量部分可适当加以提纯并浓缩成浆状制品，而且，如有必要，可将这种浆状制品浓缩成过饱和溶液，接着结晶成有水或无水结晶海藻糖，并回收所得晶体。
为了制备有水结晶海藻糖，将纯度约为60%或更高的大约为65-90%的海藻糖溶液放入结晶器内，在95℃或更低温度下，最好是在10-90℃的温度范围内，在有0.1～20%的晶种的情况下逐步冷却并搅拌，以获得一种含有有水结晶海藻糖的糖膏。常规方法，如分离方法、团块粉碎法、流化床粒化法和喷雾干燥法可在本发明中用于制备有水结晶的海藻糖糖膏或含有这种糖的结晶糖类。
在分离时，通常对糖膏进行蓝式离心处理，从母液中分离有水结晶海藻糖，而且，如有必要，可用少量冷水喷雾洗涤该有水结晶海藻糖，以便制备纯度更高的有水结晶海藻糖。在喷雾干燥时，通过一台高压泵从喷嘴中喷出浓度为70～85%(d.s.b.)结晶度为20～60%(d.s.b.)的糖膏，并用60～100℃的热空气(这一温度不会熔化所得结晶粉)干燥所得产物;老化所得结晶粉1-20小时，同时吹送30～60℃的热空气，可很容易地制备没有或基本上没有吸湿性的结晶糖类。在团块粉碎时，通过将含水量为10～20%，结晶度约为10～60%(d.s.b.)糖膏静置0.1-3天以使所有的内容物结晶化并固化成块状，然后粉碎或切碎所得团块，可很方便地制备没有吸湿性或基本上没有吸湿性的结晶糖类。
尽管可以通过干燥将有水结晶海藻糖转化成无水形式的结晶来制备无水结晶海藻糖，但是，一般是通过提供一种含水量不到10%的高海藻糖含量的溶液，将这种溶液放入结晶器内，在有晶种存在的情况下将该溶液保持在50～160℃，最好在80～140℃温度范围内并搅拌，以得到含有无水结晶海藻糖的糖膏，通过常规方法如团块粉碎、流化床粒化和喷雾干燥进行结晶并分碎该无水结晶海藻糖来制备这种海藻糖的。
根据本发明，所得到的非还原性糖类和含有这种糖的还原性较低的糖类与还原性淀粉部分水解产物相比具有较低的还原力和较高的稳定性，正因为如此，这种糖类可以与其它材料特别是氨基酸和含有氨基酸的物质如低聚肽和蛋白质混合并加工而无须担心导致该材料出现不理想的褐变、发臭和变质。与还原性淀粉部分水解产物不同，这种糖类具有较低的还原力和粘度，而且，这种糖中那些具有较低葡萄糖聚合度的糖与水解产物相比具有更为令人满意的品质和更为适中的甜度。
这种非还原性糖类由淀粉酶，如胰腺所产生的α-淀粉酶水解成分子量较低的非还原性低聚糖或麦芽寡糖，而且这种低聚糖易于被α-葡糖苷酶和肠酶水解成葡萄糖和海藻糖分子。所得海藻糖易于被海藻糖易于被海藻水解成葡萄糖。因此，当口服这种非还原性糖类和含有这种糖的还原性较低的糖类，以及海藻糖时，它们可以作为人体的能源。这种糖类和海藻糖基本上不含被牙齿所带的微生物发酵，这使得它们可被用作牙齿所带的保护性增香剂。
这种非还原性糖类和含有这种糖的还原性较低的糖类、以及海藻具有令人满意的稳定性和甜度，其结晶形式可任意与粘接剂如出芽短梗孢糖、羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮一起用作糖衣材料。这种糖类和海藻具有如下特性渗透压控制能力，填料赋予能力，光泽赋予能力、保湿能力，粘度赋予能力，基本上无发酵力，防止凝胶化淀粉退化的能力和防止其它糖类结晶的能力。
无水结晶海藻糖可适当用作食品、化妆品、药品及其材料和中间制品的干澡剂，并可方便地制成具有令人满意的稳定性和品质的粉状、粒状和片状组合物。
因此，这种非还原性糖类和含有这种糖的还原性较低的糖类、以及由这种糖制备成的海藻糖可以在各种组合物中，如食品、烟草、香烟、饲料、宠物食品、化妆品和药品中被适当用作甜味剂、增味剂、质量改善剂、稳定剂、赋形剂和干燥剂。
这种还原性糖类和含有这种糖的还原性较低的糖类以及由这种糖所制备的海藻糖可原封不动地用作甜度调味剂。如有必要，可将其与适量的一种或多种其它甜味剂共同使用，例如粉状糖浆、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、异构化糖、蜂蜜、械糖、低聚异麦芽糖、半乳糖低聚糖、果糖低聚糖、乳蔗糖(Lactosucrose)、山梨醇、麦芽醇、乳醇、二氢查尔酮、卡哈苡苷、α-糖基卡哈苡苷、雷包丁苷(rebaudioside)、甘草甜、L-天冬氨酰L-苯丙氨酸甲酯、糖精和丙氨酸和/或填料如糊精、淀粉和乳糖。
这种非还原性糖类和含有这种糖的还原性较低的糖类以及由这种糖制成的粉状或结晶海藻糖可以原样使用，但如有必要，也可在使用之前将其与赋形剂、填充剂和粘合剂混合，制成颗粒、球状、杆状(Shot-rods)、板状、方块状和片装。
这种非还原性糖类、含有这种糖的还原性较低的糖类和由这种糖制备成的海藻糖具有如下特征(ⅰ)具有与酸腐味、酸味、咸味、苦味、收敛性酸味和美味物质很好地调和的甜味;(ⅱ)具有很高的耐酸、耐热性。因此可很有利地将其用作食品和一般甜味剂、增味剂和品质改善剂。
这种非还原性糖类、含有这种糖的还原性较低的糖类和由这种糖制备成的海藻糖可用在如下调味剂中，如氨基酸、肽、酱油、粉状酱油、“miso”、“funmatsu-miso”(miso粉)、“moromi”(精制日本精酒)、“hishio”(精制酱油)、“furikake”(调味鱼粉)、蛋黄酱、调味品、醋、“Sanbai-zu”(糖酱、酱油和醋)、“funmatsu-sushi-su”(用于鱼片生粉团的醋粉)、“Chuka-no-moto”(中国菜的即用佐料)、“tentsuyu”(一种深油层日式油炸食物的酱)、“mentsuyu”(用于日本细条面的酱)，酱，番茄酱、“yakiniku-no-tare”(用于日本烤肉的酱)、咖喱增稠作料、即用煮锅调料、即用酱混配料、“dashi-no-moto”(即用原混合配料)、核酸调味品、混合调味剂、“mirin”(日本甜清酒)、“Shin-mirin”(一种合成mirin)，餐桌用糖和调咖啡用糖。
而且，这种非还原性糖类、含有这种糖的还原性较低的糖类和由这种糖制备成的海藻糖。可自由地用于给以下食品增加甜味“wagashi”(日本饼)如“Senbei”(一种稻米薄饼)、“arare-mochi”(米糕块)、“Okoshi”(小米-大米糕)、“mochi”(稻米膏)、“manju”(一种带有豆酱的甜点心)、“uiro”(一种甜的米冻胶)、“an”(一种果酱)、“yokan”(一种豆子的甜冻胶)、“mizu-yokan”(一种软的赤豆冻胶)、“kingyo-ku”(一种yokan)、果冻、pao de castella和“amedama”(一种日本太妃)糖果如甜点心、饼干、薄饼、家常小甜饼、馅饼、布丁、奶油乳酪、乳蛋糕乳酪、奶油松饼、蛋奶烘饼、松软蛋糕、油炸发面圈、巧克力、口香糖、焦糖和结晶蔗糖;冰冻甜点心如冰淇淋和舍伯特氏冰镇稀释果汁饮料糖浆如“kajitsu-no-syrupzuke”(一种制成罐头的水果)和“korimitsu”(用于创冰的糖浆)糊如面粉糊、花生糊、水果糊和水果酱加工过的水果和蔬菜如果酱、橘子酱、“syrup-zuke”(一种腌水果)和“toka”(蜜饯)泡菜和腌制食品如“fukujin-zure”(红色腌罗卜)、“bettara-zuke”(一种腌制新鲜整萝卜)、“senmai-zuke”(一种腌制鲜萝卜条)和rakkyo-zuke”(腌青葱)泡菜和腌制食品的预混合物如“takuan-zuke-no-meto”(腌萝卜的预混合物)和“hakusai-zuke-no-moto”(腌泡鲜白葡萄的预混合物)肉制品如火腿和香肠鱼肉制品如鱼肉火腿和鱼肉香肠、“Kamaboko”(汽蒸鱼肉膏)、“chikuwa”(一种鱼肉膏)和“tenpura”(一种日式深油层炸鱼肉膏)“Chinmi”(调味品)如“uni-no-shiokara”(咸海胆肠)、“ika-no-shiokara”(咸柔鱼肠)、“Su-konbu”(加工过的昆布)、“Saki-surume”(干柔鱼条)和“fugu-no-mirin-boshi”(一种干燥的用mirin调味的胀鱼)“tsukudani”(在酱油中熬制的食物)如紫菜、食用野生植物、干柔鱼、鱼类和贝类家常菜如“nimame”(煮豆)、土豆色拉和“konbu-maki”(昆布卷)奶制品罐装和瓶装食品如肉类、鱼肉、水果和蔬菜的罐装食品酒精饮料如合成日本清酒、葡萄糖和裂酒;软饮料如咖啡、茶、可可、果汁、碳酸饮料、酸奶饮料和含有乳酸菌的饮料;即用食品如即用布丁混合物、即用热糕混合物和“sokuseki-shiruco”(一种赤豆汤与稻米糕的即用混合物)和即用汤混合物以及饮料如婴儿食品、治疗食品、补充营养的食物，肽类食物和冷冻食物;还可将其用于改善上述食品的味道和品质。
这种非还原性糖类、含有这种糖的还原性较低的糖类和由这种糖制备成海藻糖还可用于饲养动物如家畜、家禽、蜜蜂、家蚕和鱼类的饲料和宠物饲料以改善其适口性。这种糖类和海藻糖可以以糊剂和液体形式用作其它制品如烟草、香烟、牙膏、口红、胭脂、唇膏、内服药、药片、锭剂、鱼肝油滴剂、口香片、口服清凉剂、含漱剂、化妆品和药品的增甜剂、增味剂、品质改善剂和稳定剂。
这种非还原性糖类，含有这种糖的还原性较低的糖类和这种糖制备成的海藻糖还可用作易失去其有效成份和活性的生物学活性物质的品质改善剂和稳定剂，以及作为含有这种生物学活性物质的保健食品和药品的品质改善剂和稳定剂。这种生物学活性物质的例子有淋巴因子，如α-、β-和γ-干扰素、肿瘤坏死因子α-(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、巨噬细胞移动抑制因子、菌落刺激因子、转移因子和白细胞介素-2激素，如胰岛素、生长激素、促乳素、促红细胞生成素、卵胞刺激激素素;生物制品，如BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、活脊髓灰质炎疫苗、天花疫苗、破伤风类毒素、竹叶青属抗毒素和人体免疫球蛋白;抗生素，如青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素和硫酸卡那霉素;维生素，如VB1、VB2、L-抗坏血酸、鱼肝油、类胡萝卜素、麦角甾醇和维生素E酶，如脂酶、弹性蛋白酶、尿激酶、蛋白酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶和乳糖酶;提取物，如人参提取物，龟提取物、小球藻提取物、芦荟提取物和蜂胶提取物;活性微生物，如病毒、乳酸杆菌和酵母;以及其它生物学活性物质。如王浆。使用这种非还原性糖类、合有这种糖的还原性较低的糖类和由这种糖制备成的海藻糖，可将上述生物学活性物质适当地制备成具有令人满意的高稳定性和品质的保健食品和药品，无须担心其有效成分和活性的损失和失活。
如上所述，将这种非还原性糖类、含有这种糖的还原性较低的糖类和或由这种糖制备成的海藻糖掺入上述组合物的方法包括常规方法，如混合、揉捏、溶解、熔融、浸泡、渗透、喷洒、涂敷、包覆、喷雾、喷射、结晶化和固化。这种糖类和海藻糖常以0.1%或更高的用量，最好以1%或更高的用量(d.s.b.)掺入上述组合物。
下面的实施例将更详细地阐述本发明。
首先，解释由一种新的微生物Rhizobium Sp.M-11所产生的非还原性糖类生成淀粉酶的生产、提纯和特性其次，对由Arthrobater Sp.Q36微生物所产生的非还原性糖类生成酶做类似上述有关Rhizobium Sp.M-11的说明。第三，对由迄今已知的微生物所产生的非还原性糖类生成酶进行说明。
实施例1由Rhizobium Sp.M-11生产非还原性糖类生成酶将由2.0w/v%的麦芽糖、0.5w/v%的胨、0.1wv%的酵母提取物、0.1w/v%的Na2HPO4、0.1w/v%的KH2PO4和水组成的液体营养培养基调至pH7.0。将大约100ml等份的该营养培养基放入500ml的三角瓶中，在120℃高压灭菌20分钟以实现消毒，冷却，接种Rhizobium Sp.M-11(FERE BP-4130)的培养物原液，在以130rpm搅拌条件下、在27℃培养24小时。将所得培养物合并用作菌种培养物。
将大约20L新制备的与上述培养中所用培养基相同的营养培养基放入一个30L的发酵罐、灭菌、冷却至30℃，用1w/v%的菌种培养物接种，在30℃、pH6.0-8.0，和好氧条件下搅拌培养24小时。所得培养物具有大约1.5单位/ml的酶活性。将一部分培养物离心使细胞与培养上清液分离，将细胞悬浮在50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中使其达到该部分的原有体积，随后分析细胞悬浮液和培养物上清液的酶活性，结果分别为0.6单位/ml和0.9单位/ml。
实施例2酶的提纯将大约18L实施例1中所获得的培养物用“Mini-Rabo”(一种由Dainippon药品有限公司出售的超高压细胞破碎装置，日本，东京)处理，以便破碎细胞。所得混合物以10，000rpm的速度离心30分钟获得约16L上清液。向该上清液中加入(NH4)2SO4并使其溶解;达到0.2的饱和度，所得溶液在4℃放置1小时，并以10，000rpm的速度离心30分钟，获得上清液。
将(NH4)2SO4溶解在该上清液中得到0.6的饱和度，所得溶液以10，000rpm的速度离心30分钟获得沉淀物。将所得沉淀物溶解在10mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中，所得溶不要溅出槽外。为了防止变形，可在集液管的两侧的槽口沿横向上各镶嵌滑轨板10，尔后再电焊；滑轨板的截面可为“人”字型或矩型，滑板的数量由所形成的篦子直径而定，要在管8两侧对称布置。折板1的截面如似坐椅，为使各折板连成遮液帘子，在各中部的(靠)背板间镶嵌连杆3，可先在连杆上制成相应的凹槽与背板沿镶后再电焊；此连杆是带动遮液帘子产生往复位移的传动杆，它要由塔外电动或气动、人工控制的动力设备来控制。为防变形可在连杆3的两侧的各折板上背板间可再定位横梁2，也可各对称布置2个以上横梁；可采用板状或杆状梁，同时横梁与每条折板1的坐(平)板间可连有加强柱4；坐板可为倾斜面，与水平夹角可为25°－45°。上述由折板连成的遮液帘子要坐在由条形槽连成的篦子上并能滑动，帘子的每条折板下沿可有与滑轨板装配的相应开口槽，其余部分制成锯齿，锯齿的夹角可为120°－160°。图4是转动式遮液帘子。在承托环11上于塔内壁固定承托环19。承托环19上排与条形槽7的一沿壁对应平行的转动板13，转动板两端有转轴14坐入用螺钉16固在承托环19上的开口轴承17上。转动板的转动角度由调节精度要求确定。当转动板与垂线成最大角度时，转动轴的轴线分转动板的上部份能遮住条形槽或条形槽间的空隙，下部份处在空隙或条形槽上口1／4至3／4处。开口轴承上插有开口销15防止转轴跳出。转动板13与连杆3间有十字头连接，十字头上滑道18的端部与转动板13焊连。滑道18可以用板材或棒材制成
形，转动板插入开口嵌焊。十字头转<p>表1酶活性 比活 产率纯化步骤 (单位) (单位/mg蛋白质) (%)培养物 26,800 100细胞破碎厉的上清液 20,300 0.10 76用(NH4)2SO4盐析后的透析液 16,100 0.32 60离子交换柱的洗脱物 11,300 5.5 42疏水柱洗脱物 5,730 98 21凝胶过滤柱洗脱物 3,890 195 15由表1中凝胶过滤柱获得的洗脱液形式的纯化酶制剂，通过7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其纯度，在凝胶上只出现一条蛋白质谱带，这表明该制剂是纯度较高的电泳均一性酶。
实施例3酶的特性将实施例2中所得到的纯化酶制剂用10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳处理，通过与标记蛋白质(由日本Bio-Rad实验室出售，日本，东京)比较表明其分子量约为77，000-87，000道尔顿。
将纯化的酶制剂用含有2v/v%“Ampholine”(一种由Pharmacia LKB Biotechnology AB提供的两性电解质，瑞典，乌普萨拉)的聚丙烯酰胺凝胶进行等电点电泳。将所得凝胶切成片，并确定含有这种酶的凝胶片的pH值，以证实这种酶的PI值约为3.6-4.6。
按照用以分析酶活性的方法研究温度和pH对酶的影响。这些结果分别示于图1和2中。当在pH7.0、反应60分钟时，该酶的最适温度为40℃;而在温度为40℃、反应60分钟时，该酶的最适pH为7.0。这种酶的热稳定性是这样确定的将其放在50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)中在不同的温度下保温60分钟，冷却缓冲并分析每种缓冲液中的残余酶活性。这种酶的pH稳定性是这样测定的将其放在具有不同的pH的50mM的磷酸的缓冲液中在25℃保温16小时，将各缓冲液的pH调整至7.0，分析每种缓冲液中的残余酶活性。有关热稳定性和pH稳定性的结果分别示于图3和4中。这种酶在40℃左右的温度下和pH 6-9的条件下是稳定的。
实施例4非还原性糖类的制备制备一种含有20%葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽己糖或麦芽庚糖的水溶液作为底物，并使其以2单位/g底物(d.s.b.)的比例与实施例2所得纯化酶混合，所得混合物在40℃、pH7.0的条件下酶促反应48小时。将反应混合物脱盐并用“Wakobeads WB-T-330柱”进行高效液相色谱(HPLC)分析(上述层析柱是由Wako Purre化学工业有限公司出售，日本，东京)。HPLC过程是在环境温度下进行的，以流速0.5ml/分的水为洗脱液，并用“RI-8012”(一种由Tosoh公司出售的差示析光计，日本，东京)分析反应产物。
结果示于表2中。
表2在HPLC上的 百分比底物 产物 洗脱时间(分) (%)葡萄糖 葡萄糖 33.4 100.0麦芽糖 麦芽糖 28.5 100.0麦芽三糖 PI 23.3 35.0麦芽三糖 25.9 65.0麦芽四糖 PII 21.6 85.6麦芽四糖 24.1 14.4麦芽戊糖 PIII 19.7 92.7麦芽戊糖 22.6 7.3麦芽已糖 PIV 18.7 93.5麦芽已糖 21.4 6.5麦芽庚糖 PV 17.8 93.4麦芽庚糖 21.0 6.7注表中符号“PⅠ”、“PⅡ”、“PⅢ”、“PⅣ”和“PⅤ”表示相应的底物麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽己糖和麦芽庚糖所生成的新糖类。
正如从表2中可以看出的，每种反应物基本上都是由残余底物和新生成的糖类PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ组成，基本上没有检测到其它糖类。它表明，具有4个或4个以上葡萄糖聚合度的PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ的产率较高，即产率为85%或更高(d.s.b)，而葡萄糖聚合度为3个或3个以上的PI的产率比较低。它还表明，在葡萄糖和麦芽糖中没有生成新糖类。
为了纯化每种反应混合物中新生成的糖类，将它们在“XT-1016(Na+-形式，4%的聚合度)”(一种碱金属强酸性阳离子交换树脂，东京有机化学工业有限公司出品，日本，东京)上进行柱层析。将这种树脂装入3根套层不锈钢柱中，每根柱的内径为2.0cm，长1m，并将3根柱串接在一起，向树脂中加入5v/v%的含该糖类反应混合物，柱内温度保持在55℃，以0.13的SV(空间流速)流速用55℃热水洗脱，以获得含有97%或更多新糖类(d.s.b.)的高纯度糖类馏分。将该馏分在真空中干燥，以得到新糖的高纯度制剂。PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ的产率相对其原料糖的产率分别约为9%、65%、82%、80%和77%(d.s.b.)。PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ的纯度分别为97.5%、98.6%、99.5%、98.4%、和98.4%(d.s.b.)。
这些新糖类的还原力用Somogyi-Nelson′s方法进行测定并用DE(葡萄糖当量)表示。所得结果示于表3。
表3糖制剂 纯度(%) DEPⅠ 97.5 0.83PⅡ 98.6 0.35PⅢ 99.5 0.10PⅣ 98.4 0.27PⅤ 98.4 0.23
从表3中的结果可以看出，每种糖制剂仅表现出很微弱的还原力。估计这些微弱的还原力是因为来自底物的残余还原性麦芽糖低聚糖引起的，由此可得出这样的结论新生成的糖类基本上是无还原性的糖类。
实施例5梅拉德反应将含有1%甘氨酸和10%的实施例4中的一种PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ或PⅤ糖制剂以及50mM磷酸缓冲液(pH7.0)的溶液在100℃保持90分钟，随后冷却所得溶液，测定其在480nm波长下在1-cm比色杯中的吸光度。作为对照，将麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽己糖和麦芽庚糖作为糖制剂材料进行类似处理、并测定其在480nm波长下的吸光度。结果示于表4中。
表4色度糖制剂 (480nm) 判断PⅠ 0.027 本发明PⅡ 0.018 本发明PⅢ 0.012 本发明PⅣ 0.016 本发明PⅤ 0.015 本发明麦芽三糖 0.623 对照麦芽四糖 0.475 对照麦芽戊糖 0.369 对照麦芽已糖 0.318 对照麦芽庚糖 0.271 对照由表4可以看出，新生成的非还原性糖类PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ只表现出因梅拉德反应所致的很微小的着色，即其色度仅为其相应麦芽糖低聚糖材料的3-6%。这一结果表明由这种酶所生成的非还原性糖类基本上不发生梅拉德反应。
实施例6葡糖淀粉酶的酶促水解将实施例4中非还原性糖类PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ的50mg等分试样分别溶于1ml 50mM的乙酸盐缓冲液(pH4.5)中，并与1个单位的葡糖淀粉酶(Sei-Kagaku-Kogyo有限公司出品)相混合，在40℃进行6小时的酶促水解。在HPLC分析时在每种所得混合物中检测的糖类都是葡萄糖和海藻糖，其分子比率示于表5中。
糖制剂 葡萄糖 海藻糖 分子比率(%) (%) (葡萄糖/海藻糖)PⅠ 36.2 63.8 1.07PⅡ 52.0 48.0 2.06PⅢ 61.4 38.6 3.02PⅣ 68.3 31.7 4.09PⅤ 72.9 27.1 5.11由表5中结果可以看出，(ⅰ)非还原性糖PⅠ被水解成1mole的葡萄糖和1mole的海藻糖;(ⅱ)PⅡ被水解成2mole的葡萄糖和1mole的海藻糖;(ⅲ)PⅢ被水解成3mole的葡萄糖和mole的海藻糖;(ⅳ)PⅣ被水解成4mole的葡萄糖和1mole的海藻糖;(ⅴ)PⅤ被水解成5mole的葡萄糖和1mole的海藻糖。
就葡糖淀粉酶的酶促机制而言，这种非还原性糖类具有由1mole或1mole以上的葡萄糖与1mole的海藻糖通过α-1，4键或α-1，6键结合组成的糖结构非还原性糖PⅠ是一种具有3个葡萄糖聚合度(DP3)的非还原性糖，由1mole葡萄糖与1mole海藻糖结合组成;PⅡ，一种具有DP4的非还原性糖，由2mole葡萄糖与1mole海藻糖结合组成;PⅢ，一种具有DP5的非还原性糖，由3mole葡萄糖与1mole海藻糖结合组成;PⅣ，一种具有DP6的非还原性糖，由4mole葡萄糖与1mole的海藻糖结合组成;PⅤ、一种具有DP7的非还原性糖类，由5mole葡萄糖与1mole海藻糖结合组成。这表明，当β-淀粉酶以与葡糖淀粉酶类似方式作用于这种非还原性糖类时，PⅠ和PⅡ不水解，而PⅢ、PⅣ和PⅤ分别被水解成1mole麦芽糖和1mole PⅠ、1mole麦芽糖和1mole PⅡ、2mole麦芽糖和1mole PⅠ。
基于上述结果，可得出这样的结论这种非还原性糖类生成酶的酶促反应是一种不改变所用底物分子量的分子内反应，即一种不改变其葡萄糖聚合度的分子内反应。结论是，非还原性糖类PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ是相应的α-糖基海藻糖类(Gn-T，其中符号G是指葡萄糖残基符号“n”是指一个或多个整数;符号“T”是指α，α-海藻糖残基);α-葡糖基海藻、α-麦芽糖基海藻糖、α-麦芽三糖基海藻糖、α-麦芽四糖基海藻糖和α-麦芽戊糖基海藻糖。
实施例7酶促水解以实施例4中的非还原性糖PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ或PⅤ为底物，用得自猪胰脏的α-淀粉酶样品、得自稻米的α-葡糖苷酶样品或鼠肠丙酮粉(这些酶均是Sigma化学公司的产品，美国，圣·路易丝卅)进行处理，所得每种水解产物用HPLC分析以了解其糖组成。α-淀粉酶的酶促反应如下将10mg底物溶解在1ml 50mM的磷酸缓冲液中(pH6.9)，将所得溶液与1单位α-淀粉酶混合，将所得混合物在37℃温育18小时。α-葡糖苷酶的酶促反应是在与α-淀粉酶的酶促反应相同的条件下进行的，只是以50mM乙酸缓冲液(pH4.0)为缓冲液。鼠肠丙酮粉的酶促反应是在以与α-淀粉酶酶促反应相同的条件下进行的，只是缓冲液用的是50mM顺丁烯二酸缓冲液(pH6.0)。由α-淀粉酶、α-葡糖苷酶和鼠肠丙酮粉所得糖的组成情况示于表6、7和8中。
表6水解产物的糖类组成糖类 PⅠ PⅡ G3 G2 G1PⅠ 97.3 0 2.3 0.4 0PⅡ 0 98.8 0.4 0.8 0PⅢ 61.0 4.8 0 33.0 1.2PⅣ 47.2 3.3 40.4 7.5 1.6PⅤ 10.2 44.9 35.3 8.6 1.0注表中符号“G3”、“G2”和“G1”分别表示麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。
表7α-葡糖苷酶的水解产物的糖类组成糖类 葡萄糖 海藻糖 其它糖类(%) (%) (%)PⅠ 36.5 63.0 0.5PⅡ 52.1 47.6 0.3PⅢ 61.7 38.1 0.2PⅣ 69.5 30.2 0.3PⅤ 71.4 28.3 0.3表8鼠肠丙酮粉的水解产物的组成糖类 葡萄糖 海藻糖 其它糖类(%) (%) (%)PⅠ 37.2 62.4 0.4PⅡ 52.5 47.1 0.4PⅢ 62.0 37.6 0.4PⅣ 68.8 30.8 0.4PⅤ 73.4 26.5 0.1从表6中可以看出，糖制剂PⅠ和PⅡ基本上不被α-淀粉酶水解，而糖制剂PⅢ、PⅣ和PⅤ则可由α-淀粉酶水解成低分子量的低聚糖;PⅠ、PⅡ、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。
从表7和8中结果可以看出，与例6中葡萄糖淀粉酶类似，糖类制剂PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ由α
葡糖苷酶和鼠肠酮粉水解成葡萄糖和海藻糖分子。
向所得α-葡糖苷酶或鼠肠丙酮粉的水解产物中加入1个单位的得自猪肾的海藻酶(Sigma化学公司的酶制剂，圣·路易丝卅，美国)，接着在HPLC上分析这种糖的组成，以揭示由糖制剂PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ和PⅤ生成的海藻糖被海藻糖酶水解成葡萄糖分子。
这些观察结果总结如下(1)这种非还原性糖类生成酶作用于具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的一种或多种还原性淀粉部分水解产物可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类而又不改变其葡萄糖聚合度;
(2)非还原性糖PV主要由α-淀粉酶水解成非还原性糖PⅡ和麦芽三糖，而非还原性糖PⅡ由葡糖淀粉酶水解成1mole藻糖和2mole葡萄糖。
基于这些结果，可得出这样的结论这种非还原性糖类生成酶是一种新酶，它能在分子内作用将还原性淀粉部分水解产物的还原性末端单元转化为一种非还原性末端单元海藻糖结构。
实施例8急性毒性试验以7周龄的dd-品系小鼠为试验对象，给小鼠口服非还原性糖类制剂PⅠ、PⅡ、PⅢ、PⅣ或PⅤ对其进行急性毒性试验。结果发现，这些糖剂是毒性较低的安全物质，并且，即使给它们服用最大可能的剂量时也没有小鼠死亡。尽管不是很准确，这种糖类制剂的LD50值为50g/Kg或更高。
实施例9由Arthrobacter SP·Q36生产非还原性糖类生成酶与实施例1相似，用Arthrobacter SP·Q36(FERM BP-4316)菌种培养物代替Rhizobium SP·M-11(FERM BP-4130)，由发酵罐培养72小时。所得培养物中非还原性糖类生成酶的酶活性大约为1.2单位/ml。与在实施例1中相似，测试由所得培养物制备的细胞悬浮液和上清液的活性，结果分别约为0.5和0.7单位/ml.
实施例10酶的提纯采用大约18L用实施例9方法所获的培养物，以与实施例2类似方法纯化。所得非还原性糖类生成酶每个纯化步骤的结果制成表9。
表9提纯步骤 用酶*活性 比活 产率(单位) (单位/mg蛋白质) (%)培养 21,600 100细胞破碎后的上清液 17,500 0.14 81用(NH4)SO4盐析后的透析溶液 15,700 0.41 73离子交换柱洗脱物 12,600 6.5 58疏水柱洗脱物 8,820 98 41凝胶过滤柱洗脱物 5,290 201 24注符号“＊”表示一种非还原性糖类生成酶。
以表9中凝胶过滤洗脱物形式获得的纯化酶制剂用实施例2类似的电泳方法分析其纯度，发现仅一条蛋白质带，这表明这种酶制剂是一种在电泳时具有单一谱带的较高纯度的酶。
实施例11酶的特性用SDS-PAGE测定实施例10中所获纯化酶制剂的分子量，结果约为76，000-86，000道尔顿。用与实施例3相似的等电电泳法确定该酶制剂的PⅠ所得PⅠ约为3.6～4.6。以与实施例3相似的方式分析温度和pH对酶制剂的影响，以及酶的热稳定性和pH稳定性。有关温度、pH、热稳定性和pH稳定性的结果分别示出图5、6、7和8中。
从上述诸图中可以看出，该酶制剂的最适温度约为40℃;最适pH约为6.5-7.0;热稳定性在40℃左右;pH稳定性大约为6.0-9.5。
实施例12非还原性糖类的制备采用实施例10所获得的纯化酶制剂，按照实施例4和6的方法实验非还原性糖类的制备和结构的确定。结果发现，当其作用于具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的一种或多种还原性淀粉部分水解产物时，这种酶能生成一种或多种以海藻糖结构为末端单元且具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的非还原性糖类。
实施例13由已知微生物制备非还原性糖类生成酶以及这种酶的特性将那些已被证实能产生这种非还原性糖类生成酶的、已知微生物中列于表10中的微生物，以与实施例1类似方法用发酵罐在27℃培养72小时，只不过有一种微生物-耻垢分枝杆菌(Mycobacterium Smegma-tis)(ATCC19420)是在37℃培养。将18L每种所得培养物用细胞破碎装置处理，所得上清液用(NH4)2SO4盐析、透析并用离子交换柱层析，以得到部分纯化的酶制剂，随后分析其特性。
结果制成表10。
表10离子交换柱洗 最适 最适 热稳 PH微生物 脱物的酶活 温度 pH 定性 稳定性(单位) (℃) (℃)Brevibacterium 约 约 高达约 约helovolum 2,700 35 6.5 35 5.5-11.0(ATCC 11822)Flavobacterium 约 约 高达约 约aquatile 216 35 6.5-6.9 35 6.0-9.5(IFO 3772)micrococcus 约 约 高达约 约luteus 1,730 35 6.4-6.8 35 6.5-8.0(IFO 3064)Micrococcus 约 约 高达约 约roseus 1,340 35 6.8-7.2 35 6.0-11.0(ATCC 186)Curtobacterium 约 约 高达约 约citreum 1,290 30 6.4-6.8 35 6.5-7.8(IFO 15231)Mycobacterium 约 约 高达约 约smegmatis 358 35 6.5 35 6.0-9.0(ATCC 19420)
Terrabacter 约 约 高达约 约tumescens 1,050 35 6.5-7.0 35 6.0-9.5(IFO 12960)Rhizobium Sp. 约 约 高达约 约M-11 11,300 40 7.0 40 6.0-9.0(FERM BP-4310)Arthrobacter 约 约 高达约 约Sp.Q36 12,600 40 6.5-7.0 6.0-9.5(FERM BP-4316)按照实施例12的方法，采用由这些已知的微生物制得的部分纯化酶制剂制备非还原性糖类，对其结构的分析发现，与来自Rhizobium Sp.M-11的非还原性糖类生成酶相似，当每种酶制剂作用于一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物时，生成以海藻糖结构为末端单元的具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的非还原性糖类。
实例14非还原性糖类生成酶的部分氨基酸序列实例14(1)含有N-末端的氨基酸序列将一部分用实施例2方法得到来自Rhizobium Sp.M-11的纯化酶制剂，和一部分用实施例10方法得到的来自Arthrobacter Sp.Q36的纯化酶制剂用蒸馏水透析，并将所得每种制剂的80μg蛋白质用作样品，测定其含有N-末端的氨基酸序列。该氨基酸序列用“蛋白质测定仪 Model 473A”(Applied Biosytem，Inc.的一种装置，福斯特市，美国)分析，以弄清其N-末端的10个氨基酸残基。这些酶制剂的含有N-末端的氨基酸序列示于表11中。
表11来源 含有N-末端的部分氨基酸序列Rhizobium Sp.M-11 缬氨酸(或甲硫氨酸)-精氨基-苏氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸-Arthrobacter Sp.Q36 甲硫氨酸-精氨酸-苏氨酸-脯氨酸-缬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸从表11可以看出，来自Rhizobium Sp.M-11的酶制剂的含有N-末端的部分氨基酸序列与来自Arthrobacter Sp.q36的含有N-末端的部分氨基酸序列的不同点在于前者的N-末端氨基酸残基是缬氨酸或甲硫氨酸，而后者为甲硫氨酸，但是它们在所分析的10个氨基酸残基中有8个是相同的。更具体地说，它们在位于N-末端起第二个氨基酸残基的精氨酸和位于N-末端起第四个氨基酸残基的脯氨酸之间的三个氨基酸残基组成的序列是完全一致的;而且在位于N-末端起第六个氨酸残基L-丝氨酸与第十个氨基酸残基L-亮氨酸之间的五个氨基酸残基组成的序列也是一样的。这说明这些酶制剂的含有N-末端的序列是部分相同的X1-精氨酸-苏氨酸-脯氨酸-X2-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-精氨酸-亮氨酸(其中“X1”指缬氨酸或甲硫氨酸，“X2”指丙氨酸或缬氨酸)。
实施例14(2)内部部分氨基酸序列将一部分用实施例2方法得到的来自Rhizobium Sp.M-11的纯化酶制剂，和一部分用实施例10方法得到的来自Arthrobacter Sp.Q36的纯化酶制剂用10mM的Tris-HCL缓冲液(pH9.0)透析，所得产物分别用同一种新配制的缓冲液稀释至大约1mg/ml的浓度。向所得溶液的1ml等分式样中加入10μg“赖氨酰内肽酶”(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的产品，日本，东京)，并在30℃反应22小时以生成肽。所得混合物用反相高效液相色谱(反相HPLC)处理，以分离肽差。用于分离来自Rhizobium Sp.M-11的酶制剂的肽的反相HPLC装置是直径4.6mm、长250mm的“CAPCELLPAK C18”(Shisendo有限公司的产品，日本，东京)流速0.6ml/分;温度为环境温度;洗脱时间60分钟;以含有0.1v/v%三氟乙酸和乙腈的浓度在16-48v/v%之间的梯度，线性梯度溶液为洗脱液。用于在反相HPLC分离来自Arthobacter Sp.Q36的酶制剂的装置和条件为直径2.1mm、长150mm的“μ-Bondapak C18柱”(Waters Chromatography Div.，Millipore Corp.，Milford，USA);流速0.9ml/分;温度为环境温度;洗脱时间60分钟;以含有0.1v/v%三氟乙酸和乙腈的浓度在30-55v/v%的梯度、线性梯度溶液洗脱。通过监视210nm波长的吸光度检测从柱上洗脱的肽。在分离并存的肽类之后，从来自Rhizobium Sp.M-11的酶制剂中回收到滞留时间分别为37、40、42的三种名为R37、R40、R42的肽，从来自Arthrobacter Sp.Q36的酶制剂中回收到滞留时间分别为17、22和40的三种名为A17、A22和A40的肽，随后真空干燥所得到的肽，并将其溶解在具有不同浓度的0.1～0.5%乙腈的200μl的等分溶液中。由此获得的每种肽的样品用蛋白质测序仪分析其10个氨基酸残基的氨基酸顺序。所分析的内部部分氨基酸顺序示于表12中。
表12来源 肽 内部部分氨基酸序列R37 Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Arg-Tyr-Rhizobium Sp. R40 Leu-Val-Glu-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro-M-11 R42 Glu-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Tyr-Ala-Val-Ala-A17 Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Phe-Arg-Tyr-Arthrobacter A22 Leu-Val-Glu-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro-Sp.Q36 A40 Glu-Gly-Arg-Glu-Ser-Arg-Tyr-Ala-Glu-Ala-从表12可以看出，来自Rhizobium Sp.M-11的酶制剂的肽R37的部分氨基酸序列与肽A17的氨基酸序列完全一致，而肽R40与肽A22的氨基酸序列完全一致。就肽R42和A40而论，在所分析的10个氨基酸残基中有7个残基是相同的;即肽R42和A40具有部分相同的氨基酸序列Glu-Gly-Arg-X3-Ser-X4-Tyr-Ala-X5-Ala(其中“X3”指Gly或Glu;“X4”指Pro或Arg;“X5”指Val或Glu)。
随后的实施例A说明这种非还原性糖类、含有这种糖的还原性较低的糖类和海藻糖的制备实施例B说明含有一种或多种这些糖类和海藻糖的组合物。
实例A-1按照实施例1中所述方法，将Rhizobium Sp.M-11(FERMBP-4130)的菌种培养物接种在营养培养基中，并用一发酵罐培养36小时。在培养结束后，将所得培养物过滤，用SF-膜过滤除去细胞，获得大约18L滤液，然后用UF-膜浓缩成约1L含有17.7单位/ml这种糖类生成酶的浓缩溶液。
将6%的马铃薯淀粉悬浮液(d.s.b.)加热凝胶化，调整至pH4.5和50℃，与异化淀粉酶(Hayashibara Biochemical Laboratories Inc.，的产品Okayama，日本)以2，500单位/克淀粉的比例混合，并酶促反应20小时。所得混合物的pH调至6.0在120℃高压灭菌10分钟，冷却至45℃，与150单位/g淀粉的“Termamyl 60L”(一种由Novo Industri A/S出售的α-淀粉酶，哥本哈根，丹麦)混合并酶促反应24小时。
将反应混合物在120℃高压灭菌20分钟，冷却至45℃，以1单位/g淀粉的用量与上述非还原性糖类生成酶混合，酶促反应96小时。所得混合物在95℃保持10分钟，冷却并过滤。所得滤液以常规方法用活性碳脱色，并用H-形或OH-形的离子交换树脂脱盐纯化。将所得溶液浓缩成70%的糖浆，产率约为91%(d.s.b.)。
该产品表现出DE18.8的还原力，并含有8.3%PⅠ、5.5%PⅡ、37.7%PⅢ、1.4%PⅣ和1.3%PⅤ(d.s.b.)。该产品具有适中的高质量甜度，以及适当的粘度和保温能力。因此，可将其适当用作食品、化妆品和药品的增甜剂、增味剂、质量改善剂、稳定剂和填充剂。
实施例A-2将实施例A1中所获糖溶液作为供料液采用装有“XT-1016(Na+-形，聚合度4%)”(一种碱金属强酸性阳离子交换树脂，东京有机化学工业有限公司出品，东京，日本)的柱分级分离。该方法如下将树脂装入4根内径为5.4cm的夹层不锈钢柱，并将4根柱串接在一起使凝胶床的总厚度达20m。将柱子加热至柱内温度55℃，加注5v/v%的糖类溶液同时保持55℃的温度，通过向柱中注入55℃的热水对糖溶液进行分级分离，除去富含葡萄糖和麦芽糖的馏分，随后回收富含非还原性糖的馏分。将富含非还原性糖的馏分合并、纯化、浓缩、真空干燥并粉碎，以获得含有非还原性糖类的粉状制品，产率61%(d.s.b.)。
该制品表现出DE5.7的还原力，含有9.3%PⅠ、7.4%PⅡ、55.5%PⅢ、2.1%PⅣ和1.9%PV(d.s.b.)。与例A-1中产品类似，该产品也具有适中的高质量甜度，以及适当的粘度的保水力，因此使其能够适当用作食品、化妆品和药品的甜味剂、增味剂、质量改善剂、稳定剂和填料。
实例A-3将33%的玉米淀粉悬浮液(d.s.b.)与CaCO4混合达到0.1%(d.s.b.)的最终浓度，将所得混合物调至pH6.5，并以每克淀粉0.2%(d.s.b.)的用量混入“Teramyl 60L”(一种由No Vo Industri A/S生产的α-淀粉酶，哥本哈根，丹麦)，在95℃酶促反应15分钟。反应混合物在120℃高压灭菌10分钟，冷却至55℃，以每克淀粉5个单位的比例与麦芽糖生成淀粉酶(Hayashibara Biochemical Laboratories Inc.出品，Okayama，日本)混合，酶促反应6小时。所得混合物以每克淀粉30个单位的比例与“α-淀粉酶 2A”(Ueda Chemjcal Co.Ltd.出品，Osaka，日本)混合，并在65℃酶促反应4小时。反应混合物在120℃酶促反应10分钟，冷却至45℃，以每克淀粉2单位的比例与例A-1中所获非还原性糖类生成酶混合，并酶促反应64小时。所得混合物在95℃保持10分钟，冷却并过滤，得到滤液，以常规方法用活性碳使其滤液脱色，用H-和OH-形的离子交换树脂使其脱盐纯化，随后浓缩所得溶液，得到70%的糖浆，产率约为90%(d.s.b.)。
所得产品表现出DE10.5的还原力，并含有3.7%PⅠ、43.7% PⅡ、1.2% PⅢ、1.1% PⅣ和0.6% PⅤ(d.s.b.)。该产品具有适中的高品质甜度，以及适当的粘度和保水力，因此使得它能够适当用作食品、化妆品和药品的甜味剂、增味剂、品质改善剂、稳定剂和填充剂。
实例A-4由实施例A-3方法所得到的作为补充液的糖溶液按照实施例A-2方法进行柱色谱，不同的是，采用“50W-X4(Mg++-形)”(一种强酸性阳离子交换树脂，Dow chemical Co.出品，Midland.Michigan，美国)作为分离树脂，以提高非还原性糖PⅡ(DP4)的含量并获得富含PⅡ非还原性糖类的馏分。将该馏分提纯、浓缩并喷雾干燥，以获得富含非还原性糖类的粉状制品，产率约为40%(d.s.b.)。
该产品含有8.5% PⅠ、68.0% PⅡ和1.4% PⅢ(d.s.b.)的非还原性糖，并表现出DE3.5，且基本上没有或较低的还原力。与实施例A-3中的产品相似，该产品具有适中的高品质和甜度，以及适当的粘度和保水力，这使其能够适当用作食品、化妆品和药品的甜味剂、增味剂、品质改善剂、稳定剂和填充剂。
实施例A-5向20%的麦芽戊糖水溶液(Hayasibara Biochemical Laboratories Inc.出品，Okayama，日本)中加入1.0单位/克麦芽戊糖量的实施例A-1方法制备的非还原性糖类生成酶，并在45℃酶促反应48小时。该酶促反应的结果将约93%(d.s.b.)的麦芽戊糖转化为非还原性糖PⅢ。将反应混合物在95℃保温10分钟，冷却并过滤，得到滤液并以常规方法用活性碳脱色，用H-和OH-形的离子交换树脂脱盐并浓缩。为了提高非还原性PⅢ(DP5)的含量，所得浓缩物以与实施例A-2类似的柱色谱法、采用碱金属强酸性阳离子交换树脂分离得到富含PⅢ的馏分。将该馏分提纯、浓缩并喷雾干燥，以获得含有高纯度非还原性糖类的粉状制品，产率约为55%(d.s.b.)。
该产品含有99.0%的PⅢ非还原性糖(d.s.b.)，并表现出低于0.2的DE值，其还原力极低。该产品具有较轻的甜度，并可适当用作食品、化妆品和药品的甜味剂、增味剂、品质改善剂和稳定剂。
实例A-6将40份重量的“PINE-DEX ＃4”(Matsutani Chemical Inc.出品的一种淀粉部分水解产物，东京，日本)溶解在60份重量的水中，并将所得溶液加热至45℃，调至pH 6.5，将每克淀粉部分水解产物与1单位的由实施例A-1方法制备的非还原性糖类生成酶混合，酶促反应96小时，同时保持45℃的温度和pH 6.5。随后，将反应混合物加热至100℃保持10分钟，以使残余的酶失活，稀释至大约20%(d.s.b.)的浓度，将每克淀粉部分水解产物与10单位的“GLUCOZYME”(由Nagase Biochemicals，Ltd.出品的葡糖淀粉酶，Kyoto，日本)，酶促反应40小时，随后加热所得混合物使残余的酶失活。由此获得的混合物以常规方法用活性碳脱色，用离子交换树脂脱盐，浓缩至大约60%的浓度(d.s.b.)。
由此获得的糖溶液含有29.5%的海藻糖(d.s.b.)。该糖溶液按照实施例A-2的方法进行柱色谱，不同的是将“CG6000(Na+-形)”(一种强酸性阳离子交换树脂，由日本Organo Co.，Ltd.出品，东京，日本)用作分离树脂，接着回收富含海藻糖馏分。该馏分含有大约90%海藻糖(d.s.b.)。将该馏分浓缩成约75%的溶液，然后放入结晶器中，与作为晶种的约2%(d.s.b.)的有水结晶海藻糖混合并逐步冷却，得到结晶度约为45%的糖膏。该糖膏由装在喷雾塔上的喷嘴以150Kg/cm2的压力喷雾。在喷雾步骤中，糖膏由从喷雾塔顶部吹送来的85℃的热空气同步烘干，所得的结晶粉由装在塔底部的金属线网织的输送带收集并逐步离开喷雾塔，同时一般40℃的气流向上吹过金属线网。所得结晶粉被注入老化塔中老化10小时，以完成结晶和干燥。随后回收粉状有水结晶海藻糖。
该产品基本上未表现出吸湿性并具有令人满意的可处理性，因而使其能够适当用作食品、化妆品和药品的甜味剂、增味剂、质量改善剂、稳定剂和填充剂。
实施例A-7通过搅拌将1份重量的马铃薯淀粉与6份重量含有0.01%“NEO-SPIIASE”(一种由Negase Biochemicals，Ltd.出品的α-淀粉酶，Kyoto.日本)/克淀粉的水混合，将所得悬浮液调整至pH6.0，加热至85-90℃，在此温度下同时凝胶化和液化。随后，马上将所得产物加热至120℃保持5分钟以保持DE值在1.0以下，迅速冷却至55℃，调整至pH7.0，每克淀粉与150单位“PullulANASE(EC3.2.1.41)”(由Hayashibara Biochemical Labovatories，Inc.出的一种酶，Okayama，日本)和8单位的实施例A-3所述的麦芽糖生成酶混合，在pH7.0、50℃条件下酶促反应36小时。
将反应混合物高压灭菌120℃10分钟，冷却至45℃，以每克淀粉2单位的比例与按实施例13中方法从Brevibacterium helovolum ATCC 11822中制备的非还原性糖类生成酶混合，并进行酶促反应64小时。该反应混合物加热至95℃10分钟，冷却并过滤。将所得过滤液用活性炭以常规方式脱色，用H-和OH-形离子交换树脂脱盐并纯化。将所得溶液浓缩并喷雾干燥以获得一种粉状非还原性糖类，收率大约90%，d.s.b.。该产物表现出一种DE11.2，含有2.9%PⅠ，61.5%PⅡ，和0.8%PⅢ，(d.s.b.)，并具有中等的高品质甜味，以及满意的粘度和保湿能力，并且这些特性使得该产品可适宜地用作如食品、化妆品和药物的组合物中的甜味剂、调味剂、品质改善剂和稳定剂。
实施例A-8将一种微生物Arthrobacter Sp.Q36(FERM BP-4316)的种菌培养物接种到一种营养培养基中，并按照实施例9中的方法在一个发酵罐中培养72小时。将所得培养物离心以去除细胞，再用一种UF膜将所得上清液浓缩10倍，获得一种含有约15.2单位/ml本发明非还原性糖类生成酶的酶溶液。
按照实施例A-3的方法，用α-淀粉酶样品(NoVo Industri A/S出品，哥本哈根，丹麦)、麦芽糖生成淀粉酶样品(Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.出品，Okayama，日本)和α-淀粉酶样品(Ueda Chemical Co.，Ltd，出品，Osaka，日本)处理30%的玉米淀粉悬浮液。将所得混合物在120℃高压灭菌，冷却至45℃，将每克淀粉与2单位由上述方法制备的非还原性糖类生成酶混合，并酶促反应64小时。将反应混合物在100℃保持10分钟以使残余的酶失活。按照实施例A-6的方法，所得溶液用葡糖淀粉酶(Nagase Biochemicals，Ltd.，出品，Kyoto，日本)处理，脱色、脱盐并浓缩成大约60%的溶液。由此获得的糖溶液含有约25%(d.s.b.)的海藻糖。这种糖溶液由采用强酸性阳离子交换树脂的柱色谱进行分离，获得富含海藻糖的馏分。合并这些馏分，并放入一容器中减压熬煮成水分含量为4.0%的糖浆。将该糖浆放入结晶器中，并混入作为种品的无机结晶海藻糖1%(相对糖浆的d.s.b.)，随后在95℃结晶无水结晶海藻糖5分钟，同时搅拌。将所得产物转移到铝质容器中在100℃老化6小时，以使其结成团块。所得团块由切割机粉碎，并进行流化床干燥，以获得含水量约为0.3%的粉状无水结晶海藻糖。
该产品可适当用作有水物质如食品、化妆品和药品及其材料和中间制品的脱水剂，并可作为高品质、甜度适中的甜味剂。
实施例B-1甜味剂向一份重量的用实施例A-4方法获得的富含非还原性糖类的粉状制品中均匀混入0.01份重量的“α G sweet”(α-糖基蛇菊苷，Toyo Sugar Refining Co.，Ltd.的产品，东京，日本)和0.01份重量的L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(Ajinomoto Co.，Ltd.产品)，将该混合物装入颗粒机得到粒状甜味剂。该制品具有令人满意的甜度，其增甜能力比蔗糖高2倍，而热量仅为蔗糖的1/2。
该产品具有令人满意的稳定性，当它同甜度较高的增甜剂混合时即不会对后者有影响又不会使之分解，因此，可将其用作专供肥胖者和糖尿病患者那些限于低热摄入量者食用的低热食品的低热增甜剂。
当牙载微生物对其起作用时，该产品极少产生酸和不溶性葡聚糖，这使得它能用于保护牙齿的食物。
实例B-2硬糖果将100份重量的55%蔗糖溶液与30份重量的含有用实施例A-3方法所得非还原性糖类的糖浆混合，将所得混合物在真空中加热浓缩至水分含量低于2%。该浓缩液与1份重量柠檬酸和足量的柠檬香料及着色剂混合，所得混合物以常规方法成形，得到所需产品。
该产品是一种优质硬糖，具有令人满意的味道和咀嚼性能，而且不用担心变形和引起蔗糖结晶化。
实例B-3香口胶将3份重量的树胶基加热软化至熔化，所得产物与4份重量的蔗糖和3份重量的用实施例A-6方法所得的有水结晶海藻糖粉混合，并进一步与足量的香料和着色剂混合。所得混合物以常规方法滚动搅拌，成形并包装，以获得需要的产品。
该产品是一种具有令人满意的织地和味道的口香胶。
实例B-4增甜炼乳将3份重量的用实施例A-1方法所获得的含有非还原性糖类的糖浆和1份重量的蔗糖溶解在100份重量的鲜奶中，所得溶液由一平底加热器加热消毒，并浓缩成70%的溶液，随后将产物无菌包装成所需产品。
该产品具有适中的甜度和令人满意的味道，可适当用作婴儿食品、水果、咖啡、可可和茶的调味剂。
实施例B-5合有乳酸菌的饮料将175份重量的脱脂牛奶、80份重量的用实施例A-2方法所获高含非还原性糖量的粉和50份重量的在日本专利公开号281，795/92中所公开的高乳蔗糖(Lactosucrose)含量的粉溶于1，200份重量的水中，将得溶液在65℃加热30分钟消毒，冷却至40℃，以常规方法与30份重量的作为促酵物的乳酸菌混合并在37℃培养8小时，得到含有乳酸菌的饮料。
该产品是一种含有乳酸菌、具有令人满意的味道和香味的饮料。这种含有低聚糖类的产品可稳定维持乳酸菌并促进双歧杆菌的生长。
实例B-6果汁粉剂饮料将33份重量通过喷雾干燥制备的橙汁粉与用实施例A-2方法所获得的50份重量的富含非还原性糖类的粉、10份重量的蔗糖、0.65份重量的无水柠檬酸、0.1份重量的苹果酸、0.1份重量的L-抗坏血酸、0.1份重量的柠檬酸钠、0.5份重量的葡聚糖和足量的香料粉在搅拌条件下混合均匀。将所得混合物粉碎，送入流化床制粒机内粒化30分钟，向其喷洒用实施例1方法所获作为粘接剂的含有非还原性糖类的糖浆，同时向内容物吹送40℃的空气。对所获颗粒称重并包装，获得所需产品。
该产品含有30%(d.s.b.)的橙汁。该产品在相当长的时期内都是稳定的，不会产生不良的味道和气味。
实施例B-7乳蛋糕乳脂将100份重量的玉米淀粉，100份重量由实施例A-3方法得到的含有非还原性糖类的糖浆，80份重量的麦芽糖，20份重量的蔗糖和一份重量的盐均匀混合。所得混合物与280份重量的鸡蛋混合，并逐渐加入1000份重量的沸牛奶。加热由此得到的混合物，同时不停搅拌，当该混合物中的玉米淀粉完全胶凝化使所有内容物呈半透明状时停止加热，随后冷却所得产物并加入适量的香草香料。将所得混合物称重、注塑并包装，以得到所需产品。
该产品具有光滑的表面和光泽，还有适中的味道和甜度。
实施例B-8An(豆糊)以10份重量的红豆为原料用常规方法加水煮熟，随后除去豆子的收敛性和粗糙度，以及水溶性杂质，获得约21Kg的“adzuki-an”。向所得产物中加入14份重量的蔗糖、5份重量用实施例A-3方法得到的含有非还原性糖类的糖浆和4份重量的水，将所得混合物沸煮，与少量的色拉油混合，小心搅拌，以免粘贴豆子。这样，获得了产量约为35Kg的理想产品。
该产品不会发生因煮沸所致的褪色，具有令人满意的味道和香味，这使可用作豆酱面包、豆酱馅面包、汤元、豆酱馅薄脆饼、果汁饮料和冰淇凌的材料an。
实施例B-9面包将100份重量的小麦粉、2份重量的酵母、5份重量的糖、1份重量由实施例A-7方法获得的含有非还原性糖类的粉和0.1份重量的无机酵母食品以常规方法与水拌和，在26℃发酵2小时，进一步老化30分钟，随后焙烤所得产物。
该产品是一种优质面包，具有令人满意的色调和膨胀度，以及令人满意的弹性和适中的甜度。
实施例B-10火腿向1000份重量的火腿肉片中加入15份重量的盐、3份重量的KNO3并研磨均匀，将所得肉片堆积起来并在冷藏室中放置过夜。随后，先将所得肉片在由500份重量的水、100份重量的盐、3份重量的KNO3、40份重量用实施例A-7方法获得的含有非还原性糖的粉和适量薄荷组成的盐溶液中放在冷藏室浸泡7天，然后用常规方法用冷水冲洗，包扎、熏制、蒸煮、冷却并包装，以获得所需产品。该产品是一种具有理想的色调、味道和香味的优质火腿。
实施例B-11粉状肽将40%“Hinute S”(一种食用大豆的肽溶液，Fuji Oil CO.出品，东京，日本)与2份重量的由实施例A-6方法制备的含有水结晶海藻糖的粉混合，将所得混合物放入塑料容器中，在50℃温度下真空干燥，粉碎得到粉状肽。该产品具有令人满意的味道和香味可适当用作甜味食品如预混合物、果汁冻和冰淇凌的材料，还可用作婴儿食品、口服和插管喂食形式的治疗营养液的材料。
实施例B-12蛋黄粉由鲜蛋制得的蛋黄用平底加热器在60-64℃加热消毒，所得液体以1份重量该液体4份重量由实施例A-8方法制得的粉状无水结晶海藻糖的比例使两者混合。将所到混合物转移到一容器中，放置过夜使其结块，同时无水结晶海藻糖也转化成有水结晶海藻糖。由此获得的团块用切碎机粉碎，得到蛋黄粉。
该产品可适当用作甜味食品如预混合物、果汁冻、冰淇凌和乳化剂的材料，还可用作婴儿食品、口服和插管喂养液的材料。该产品还可用作皮肤精炼油和头发恢复剂。
实例B-13化妆品乳膏将2份重量的聚氧乙烯乙二醇-硬脂酸酯、5份重量的单硬脂酸甘油酯、自乳化、2份重量实施例A-2方法获得的富含非还原性糖类的粉、1份重量的α-糖基芸香苷、1份重量的液体凡士林，10份重量的三-2-乙基己酸甘油酯，以及适量防腐剂以常规方法加热溶解。所得溶液与2份重量的L-乳酸、5份重量的1，3-丁二醇和66份重量的纯化水混合，所得混合物由匀浆器乳化并与适量的香料搅拌混合，以得到化妆品乳膏。
该产品表现出抗氧化剂的活性并具有较高的稳定性。这使其可适当用作优质防晒霜、皮肤嫩化剂和皮肤增白剂。
实施例B-14固体药品以常规方法向将固定了抗人体干扰素-α抗体的柱中加注天然人体干扰素-α制剂(由Cosmo Bio.出品，东京，日本)，以吸附干扰素-α，并注入以牛血清白蛋白为稳定剂和缓冲液，随后除去多余的白蛋白。此后，用含有5%(d.s.b)用实施例A-5方法得到的高纯度非还原性糖类的生理盐水洗脱干扰素-α，同时改变生理盐水的pH。
将所得洗脱液进行膜过滤。所得滤液用20倍体积的“FINETOSE ”(由Hayashibara Shoji Znc.出品的一种无水结晶麦芽糖，Okayama，日本)脱水，随后粉碎脱水的产品，并用制片机将其制成每片含有约150单位的天然人体干扰素-α的片剂，每片重200mg。
该产品可作为含片由病人口服，剂量为1-10片/成人/天，并可适当用于治疗素性疾病、变态反应、风湿病、糖尿病和恶性肿瘤。更特别地是，该产品可以适当用作艾滋病(AIDS)和肝炎的治疗剂，此类患者的发病率明显上升。由于将这种非还原性糖和无水结晶麦芽糖掺在该产品中作为天然人体干扰素-α的稳定剂，所以其活性即使在环境温度下也可保持较长时间。
实施例B-15糖衣片剂以重150mg的粗制片剂为核心，用由40份重量的实施例A-6方法得到的粉状有水结晶海藻糖、2份重量平均分子量为200.000的葡聚糖、30份重量的水、25份重量的滑石和30份重量的二氧化钛组成的溶液包衣，直至总重量达到230mg。所得产物用由65份重量的同一种新制备的粉状有水结晶海藻糖、1份重量的葡聚糖和34份重量的水组成的溶液进一步包衣，并用液体蜡上光，得到具有令人满意的光泽和外观的糖衣片剂。该产品具有较高的抗冲击性能，并且能较长时间地保持其高品质。
由上述内容可以看出，这种新的非还原性糖类生成酶能在较为温和的酶促反应条件下以令人满意的高产率将还原性淀粉部分水解产物转化成非还原性糖类，而不会改变还原性淀粉部分水解产物的葡萄糖的聚合度。这种非还原性糖类易于分离和提纯，而且含有这种糖的还原性较低的糖类以及由这种糖制成的海藻糖具有令人满意的稳定性、品质和适中的甜度。当口服时，这种产品可被身体吸收并用作能源。这种非还原性糖类、含有这种糖的还原性较低的糖类以及由这种糖制成的海藻糖可适当用作组合物如食品、化妆品和药品的增甜剂、增味剂、品质改变剂、稳定剂和填充剂。
因此，本发明提供了一种以工业规模和较低费用生产非还原性糖类的新技术，这种糖不易获得，尽管其需求量极大。该方法以由淀粉制备的还原性淀粉部分水解产物这一廉价、丰富的资源为原料制备这种非还原性糖，以及含有这种糖的还原性较低的糖类和由这种糖制成的海藻糖。本发明对于淀粉-、酶-、和生物科学这些领域有着重大影响;而且对于其它领域，特别是食品工业、化妆品工业和药品业，以及林业、渔业、农业、畜牧业和化学工业都有重大影响。因此，本发明对这些领域的影响是不可估量的。
尽管说明了目前被认为是本发明的优选的实施例，但是，应当清楚，可对其做出各种改变，因此，在所附的权利要求中所限定的保护范围内的所有此类改进均视为落在本发明的实质和范围之内。
权利要求
1.一种酶，当其作用于还原性淀粉部分水解产物时生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。
2.如权利要求1所述的酶，其特征在于上述非还原性糖类的海藻糖结构位于其末端单元，而上述还原性淀粉部分水解产物是一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性淀粉水解产物。
3.如权利要求1所述的酶，其特征在于它来自一种微生物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述微生物是根瘤菌属(Rhizobium)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Curtobacterium属、分枝杆菌属(Mycobacterium)和Terrabacter属及其突变体中的一员。
5.如权利要求1所述的酶，它具有如下物理化学特性(1)作用当作用于一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物时，生成具有海藻糖结构的非还原性糖类(2)分子量在用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)时，约为76，000-87，000道尔顿;(3)等电点(PI)在用两性电解质等电电泳时约为3.6＝4.6;(4)最适温度在pH7.0、培养60分钟时约为35-40℃;(5)最适pH在40℃培养60分钟时约为6.4-7.2;(6)热稳定性在pH7.0培养60分钟时，在高达35-40℃的温度下是稳定的;(7)pH稳定性当在25℃培养16小时时，在pH5.5-11.0范围内是稳定的。
6.如权利要求1所述的酶，它具有下列一种或多种部分氨基酸序列(1)X1-Arg-Thr-Pro-X2-Ser-Thr-Tyr-Arg-Leu-(其中符号“X1”表示Val或Met，“X2”表示Ala或Val);(2)Gly-Val-Glu-Asp-Thr-Ala-Phe-Phe-Arg-Tyr-;(3)Leu-Val-Glu-Leu-Thr-Met-Pro-Gly-Val-Pro;(4)Glu-Gly-Arg-X3-Ser-X4-Tyr-Ala-X5-Ala-(其中符号“X3”表示Gly或Glu;“X4”表示Pro或Arg;“X5”表示Val或Glu)。
7.如权利要求2所述的酶，其特征在于所述非还原性糖类是一种由下式所表示的α-糖基海藻糖Gn-T其中，符号“G”表示葡萄糖残基;“n”一个或多个整数;“T”表示α，α-海藻糖残基。
8.一种制备权利要求1中酶的方法，包括在一种营养培养基中培养一种能产生这种酶的微生物;和从所得培养物中回收这种酶。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述微生物是根瘤菌属、节杆菌属、短杆菌属、黄杆菌属、微球菌属、Curtobacterium属、分枝杆菌属和Terrabacter属及其突变体中的一员。
10.一种能产物权利要求1所述酶的微生物，它是从根瘤菌属和节杆菌属中选择的。
11.如权利要求10所述的微生物，其特征在于上述根瘤菌属的微生物是Rhizobium Sp.M-11(FERM BP-4130)及其突变体。
12.如权利要求10所述的微生物，其特征在于上述节杆菌属微生物是Arthrobacter Sp.036(FERM BP-4316)及其突变体。
13.一种降低还原性淀粉部分水解产物的还原力的方法，包括用权利要求1所述酶作用于含有一种还原性淀粉部分水解产物的溶液的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于上述还原性淀粉部分水解产物是一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物。
15.一种具有海藻糖结构的非还原性糖类。
16.如权利要求15所述的糖类，其特征在于上述非还原性糖类中的海藻糖结构位于其末端单元。
17.如权利要求16所述的糖类，它是下式所示的α-糖基海藻糖Gn-T其中，符号“G”表示葡萄糖残基“n”表示一个或一个以上整数“T”表示α、α-海藻糖残基。
18.如权利要求15所述的糖类，它可以这样获得(a)将权利要求1所述的酶作用于一种含有还原性淀粉部分水解产物的溶液，以生成非还原性糖类(b)将所述非还原性糖类与未被转化的还原性淀粉部分水解产物一起回收，或是回收所述非还原性糖类而没有未被转化的还原性淀粉部分水解产物。
19.如权利要求18所述的糖类，其特征在于上述还原性淀粉部分水解产物是一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物。
20.一种含有权利要求15所述的非还原性糖类的组合物。
21.如权利要求20所述的组合物，它是一种食品。
22.如权利要求20所述的组合物，它是一种化妆品。
23.如权利要求20所述的组合物，它是一种药品。
24.一种可用以下方法获得的海藻糖(a)将权利要求1所述的酶作用于一种含有还原性淀粉部分水解产物的溶液，以生成具有海藻糖结构的非还原性糖类;(b)将葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于所得非还原性糖类，以生成海藻糖;(c)回收所得海藻糖。
25.如权利要求24所述的海藻糖，其特征在于步骤(b)还包括一个结晶上述海藻糖的步骤。
26.如权利要求25所述的海藻糖，其特征在于所述海藻糖是有水或无水结晶海藻糖。
27.如权利要求24所述的海藻糖，其特征在于对在步骤(b)中所得混合物采用强酸性阳离子交换树脂进行柱层析，以提高海藻糖的含量。
28.如权利要求24所述的海藻糖，其特征在于上述非还原性糖类的海藻糖结构位于其末端单元。
29.如权利要求28所述的海藻糖，其特征在于上述海藻糖是如下式所示的α-糖基海藻糖Gn-1其中，符号“G”表示葡萄糖残基“n”表示一个或多个整数，“T”表示α，α-海藻糖残基。
30.如权利要求24所述的海藻糖，其特征在于上述还原性淀粉部分水解产物是一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物。
31.一种可通过如下方式获得的含有海藻糖的组合物(a)将权利要求1所述的酶作用于一种含有还原性淀粉部分水解产物的溶液，生成具有海藻糖结构的非还原性糖类;(b)将葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于所得到的非还原性糖类，生成海藻;(c)将所得海藻糖掺入一种产品。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于步骤(b)还包括一个结晶上述海藻糖的步骤。
33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于上述海藻糖是有水或无水海藻糖。
34.如权利要求31所述的组合物，其特征在于步骤(b)中所得到的混合物还要用强酸性阳离子交换树脂进行柱层析，以提高海藻糖的含量。
35.如权利要求31所述的组合物，其特征在于上述非还原性糖类的海藻糖结构位于其末端单元。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于所述具有海藻糖结构的非还原性糖类是由下式所示的α-糖基海藻糖Gn-T其中，符号“G”表示葡萄糖残基;“n”表示一个或多个整数，“T”表示α，α-海藻糖残基。
37.如权利要求31所述的组合物，其特征在于所述还原性淀粉部分水解产物是一种或多种具有3个或3个以上葡萄糖聚合度的水解产物。
38.如权利要求31所述的组合物，它是一种食品。
39.如权利要求31所述的组合物，它是一种化妆品。
40.如权利要求31所述的组合物，它是一种药品。
全文摘要
公开了一种新的非还原性糖类生成酶及其制备和应用。这种酶可从Rhizobium sp.M-11(FERMBP4130)和Arthrobacter sp。Q36(FERMBP-4316)等微生物的培养物中获取，当其作用于还原性淀粉部分水解产物时可生成具有海藻糖结构的非还原性糖类。当葡萄糖淀粉酶和α-葡萄苷酶作用于这种非还原性糖类时，易于产生海藻糖。这种非还原性糖类和海藻糖可广泛应用于食品、化妆品和药品中。
文档编号A61K8/00GK1091470SQ9312174
公开日1994年8月31日 申请日期1993年12月28日 优先权日1992年12月28日
发明者丸田和彦, 久保田伦夫, 杉本利行, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原生物化学研究所