专利名称：透性化细胞海藻糖合酶及其制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种透性化细胞海藻糖合酶及其制备和用途，该酶能够将麦芽糖转化为海藻糖，也能将海藻糖转化为麦芽糖。本发明还涉及用于制备所述酶的微生物，用所述酶制备海藻糖及含海藻糖的糖类组合物的方法。
背景技术：
海藻糖是由两个葡萄糖分子以α-1，1糖苷键连接而成的非还原性双糖，常态下为白色结晶，爽口甘甜，甜度为砂糖的45％，耐酸耐热，在相对湿度94％以下没有吸湿性。海藻糖广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母及昆虫中，许多物种对外界恶劣环境(脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等)所表现出的抗逆耐受力与它们体内的海藻糖有直接关系，并且外源性的海藻糖同样对生物膜和生物大分子具有良好的非特异性保护作用，这一独特的生物学功能使海藻糖在食品、化妆品、分子生物学、医学、农业等领域拥有广阔的应用前景。如，海藻糖可作为生物制品及活菌制剂的保护剂和稳定剂；也可作为一种能有效改善食品质量和风味的天然食品添加剂；还可用于化妆品中，保护皮肤免受日晒和冷冻伤害，防止皮肤干燥等。因此，迫切需要能够工业化大规模制备海藻糖。
目前已开发出的制备方法主要有提取法、微生物发酵法和酶催化法三种方法。
提取法中以从酵母菌体中提取海藻糖的研究最多，工艺也较成熟。但由于酵母细胞中海藻糖含量有限，一般不超过20％(w/w)，提取工艺复杂，成本高，限制了该技术的进一步发展。
微生物发酵法是指培养海藻糖分泌型的微生物，如微球菌、短杆菌、棒杆菌及节杆菌等微生物，从微生物的发酵液中提取海藻糖，但该法转化率低，且由于发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制较为困难。
酶催化法按所使用的酶可分为磷酸化酶法和非磷酸化酶法两类。磷酸化酶法是以葡萄糖、蔗糖或麦芽糖等为底物，通过某些磷酸化酶的反应生成海藻糖。由于磷酸化酶法需要高能物质UDP、GDP或高浓度磷酸盐，并且酶反应系统是可逆反应，海藻糖产率比较低，此外还存在磷酸化酶不稳定等不利因素，因此磷酸化酶催化法不适于海藻糖的大规模生产。为此，人们又开发了一些非磷酸化酶方法。如，日本专利申请No.362131/92中公开了一种海藻糖的制备方法，通过一种海藻糖基水解酶与能够形成非还原糖(以海藻糖结构作为末端单元，并且有3或更高的葡萄糖聚合度)的非还原糖形成酶一起，作用于由淀粉原料制备的、葡萄糖聚合度为3或更高的还原性淀粉部分水解物，从而利用非还原性淀粉部分水解物制备海藻糖。但是该方法需要2种以上的酶，底物粘度高，所得产物的糖类组分复杂，使得生产成本高。日本株式会社林原生物化学研究所于中国专利CN 1106065A中公开了另外一种海藻糖的制备方法，发明人发现从日本土壤中分离出的脂肪杆菌(Pimelobactersp.)R48和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)H262以及栖热菌属的部分微生物能产生将麦芽糖转化为海藻糖的新型麦芽糖-海藻糖转化酶(即海藻糖合酶)，从而可利用能工业规模生产和稳定供给的麦芽糖制备海藻糖。由于这种酶在催化麦芽糖转化为海藻糖的过程中不消耗高能物质，不需要磷酸，转化率高达70％～80％，并且可作用于高浓度底物，因此这种酶在海藻糖的工业化生产中有着良好的应用前景。但是由于海藻糖合酶属胞内酶，因此，在该专利中先将细胞破碎，再经逐级分离纯化后才使用。这样，每步纯化均伴随不同程度的酶活损失，最终造成酶总活力的损失，并且纯化操作复杂、耗费巨大，效率低，制约了海藻糖合酶在工业生产中的应用。
而采用渗透处理细胞技术生产出透性化细胞海藻糖合酶则有望克服上述缺点。所谓渗透处理细胞技术是指利用物理法(如渗透压法、冻融法、热休克法和超声波处理等)、化学法(表面活性剂法、有机溶剂法、鳌合剂法等)或生物化学法(抗生素法、酶法等)，在一定条件下，对细胞渗透处理一定时间，在不破坏细胞整体结构的前提下，改变细胞壁和膜的通透性的技术。细胞经透性化处理后，小分子底物能自由进出细胞，从而保证了胞内酶催化作用的充分发挥。如，薛璐等人在文献〔食品与发酵工业，2002，28(1)16-18〕中采用该技术对恶臭假单胞菌H76菌株进行了渗透处理，得到透性化细胞海藻糖合酶，其活力可达原细胞的117.8倍。但是如薛璐等人在另一篇文献〔食品科学，2003，24(3)26-29〕中所报道的，该透性化细胞海藻糖合酶的热稳定性不高，60℃保温0.5小时后，相对酶活力接近于零；45℃保温1小时后，剩余相对酶活力也只有61％。并且该透性化细胞海藻糖合酶的pH稳定范围窄，约pH6.6～pH7.4，在pH为5.8或8.6时，保温0.5小时，酶活力即全部丧失。而在实际生产中，酶反应温度低于50℃时，容易染菌，造成生产污染；此外，pH稳定范围窄的酶，不仅其应用受到限制，而且经常会因为反应过程中溶液pH值的波动导致酶活性降低甚至丧失，进而影响生产。
发明内容
为解决上述技术中存在的不足，本发明的第一个目的是提供一种新型透性化细胞海藻糖合酶，它既具备理想的热稳定性，又具备理想的pH稳定性，能够将麦芽糖转化为海藻糖；本发明的第二个目的是提供透性化细胞海藻糖合酶的制备方法；本发明的第三个目的是提供用透性化细胞海藻糖合酶制备海藻糖及含海藻糖的糖类组合物的方法；本发明的第四个目的是提供用于制备透性化细胞海藻糖合酶的微生物。
为了达到上述目的，本发明广泛筛选了能够产生海藻糖合酶的微生物。本发明发现一株亚栖热菌(Meiothermus sp.)，实验室编号为CBS-01的菌株。该菌株已于2004年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，即CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1256。
上述实验室编号为CBS-01的菌株的生物学特性为在琼脂平板上培养时形成的菌落呈圆形，表面光滑，凸起，边缘整齐，呈暗红色，细胞为规则的杆状或丝状，杆状细胞大小通常为0.5μm～0.8μm×3μm～8μm，丝状体长度可变，革兰氏染色阴性，无芽孢，好氧，最适生长温度为55℃～60℃，最适生长pH值为7.5～8.5。根据相关文献，本发明人将该菌株鉴定为亚栖热菌属菌株，并命名为亚栖热菌(Meiothermus sp.)CBS-01。
任何营养培养基，不管是合成的还是天然的，只要该菌株可在其中生长并产生海藻糖合酶，均可用于本发明。任何含碳物质，只要它能被所述菌株利用，均可在本发明中作为碳源使用。例如，麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、糖蜜、淀粉和淀粉水解物等糖类，以及柠檬酸和琥珀酸及其盐等，这些碳源在营养培养基中的浓度可适当选择。可用于本发明的氮源有无机氮化合物，如铵盐和硝酸盐；含氮有机化合物，如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、鱼粉、酵母粉、酵母提取物和牛肉膏等。可用于本发明的无机盐有钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐及锌、铁、铜、钼和钴的其它盐。如果需要，可以添加氨基酸和维生素。
本发明所使用的培养条件是所述微生物菌株可以生长和产生海藻糖合酶的条件，例如温度为40℃～70℃、pH值范围为6～10的需氧条件，优选温度范围为45℃～65℃，优选pH值范围为7～9。培养时间为6小时～150小时，优选12小时～96小时。对营养培养基中溶解氧(DO)的浓度无特别限制，通常DO值为0.5ppm～20ppm即可满足要求，可通过控制通气流量、向通气中补充氧、控制搅拌转速、提高发酵容器的内压等措施，使DO浓度保持在该范围内。所述微生物的培养方式可以是分批培养，也可以是连续培养。
在微生物培养完成后，采用渗透处理细胞技术处理已培养好的含有海藻糖合酶的微生物细胞，回收所得的透性化细胞海藻糖合酶。可采用下述任何一种方法获得透性化细胞海藻糖合酶1、利用物理法(如热休克法、超声波处理等)或化学法(如表面活性剂法、有机溶剂法、鳌合剂法等)或生物化学法(抗生素法、酶法等)或上述方法的组合，对发酵液或发酵液的浓缩液进行处理，使发酵液或浓缩液中的亚栖热菌CBS-01细胞变成透性化细胞，即得透性化细胞海藻糖合酶的粗酶液。该粗酶液可直接使用，或经过浓缩或干燥处理后使用。也可以利用传统的液一固分离方法，从该粗酶液中分离出透性化细胞海藻糖合酶后再使用，或干燥后使用。
2、利用传统的液一固分离方法，例如离心、过滤、板框压滤或膜过滤等方法，从发酵液中分离出亚栖热菌CBS-01细胞，再采用物理法(如热休克法、超声波处理等)或化学法(如表面活性剂法、有机溶剂法、鳌合剂法等)或生物化学法(抗生素法、酶法等)或上述方法的组合对亚栖热菌CBS-01细胞进行处理，使其变成透性化细胞，即得透性化细胞海藻糖合酶。该透性化细胞海藻糖合酶可直接使用，或经过洗涤、干燥(如冷冻干燥、喷雾干燥)处理后使用。
由此获得的本发明的透性化细胞海藻糖合酶具有如下物理化学性质(1)作用能够将麦芽糖转化为海藻糖，也能够将海藻糖转化为麦芽糖；(2)最适温度在pH7.0保温60分钟时，约为50℃～65℃；(3)最适pH在50℃保温60分钟时，约为6.2～7.2；(4)热稳定性在pH7.0保温60分钟时，直到60℃是稳定的；(5)pH稳定性在50℃保温60分钟时，可稳定的pH为4.5～10。
按下述方法测定本发明的透性化细胞海藻糖合酶的活性将1mL液体酶(对固体酶，则先以10mM、pH7.0的磷酸缓冲液稀释后再取1mL)加入到1mL以10mM、pH7.0的磷酸缓冲液配制的20％(w/v)的麦芽糖溶液中，混匀后，将该混合物溶液于60℃保温60分钟，然后于100℃加热10分钟中止该酶促反应。反应混合物冷却后，离心(8000r/min，15分钟)，取上清液，用高效液相色谱法测定生成的海藻糖含量。酶活力单位定义为在上述反应条件下，每分钟形成1μmol海藻糖所需的透性化细胞海藻糖合酶的量为1单位。
高效液相色谱法测定海藻糖的条件如下色谱柱Hypersil NH2，4.6mm×250mm，填料粒径5μm；检测器示差折光检测器；流动相乙腈/水＝75/25(体积比)；柱温室温；进样量20μL；流速1.0mL/min。
本发明的透性化细胞海藻糖合酶可用于转化麦芽糖制备海藻糖，或者用于转化海藻糖为麦芽糖。
在利用本发明的透性化细胞海藻糖合酶制备海藻糖以及含海藻糖的糖类组合物时，任何麦芽糖产品或者含麦芽糖的物质，均可作为本发明的透性化细胞海藻糖合酶的底物，只要当受到本发明的透性化细胞海藻糖合酶的作用时，其中的麦芽糖能转化为海藻糖即可。一般来说，该产品或物质中麦芽糖含量越高越好，优选麦芽糖含量≥50％(干基百分比)者。所述底物的实例是市售麦芽糖和使用常规淀粉水解技术所制得的麦芽糖浆。
对在本发明中酶促反应所使用的底物浓度和透性化细胞海藻糖合酶的浓度没有特别的限制。在本发明酶促反应中可用的反应温度可以是不会使本发明酶迅速失活的温度，优选温度范围为70℃以下。在本发明酶促反应中可用的pH值为4～10，优选pH为5.5～9。本发明酶促反应所用时间根据反应条件和所需转化率而适当选择，通常当酶的用量约0.1单位～100单位/g底物、所需转化率≥20％时，所需反应时间约为0.1小时～100小时。
本发明的方法能以约70％或更高的转化率将麦芽糖转化为海藻糖。对由此获得的酶促反应混合物，采用离心、过滤、板框压滤或膜过滤等方法进行处理，所得不溶性物质中含有透性化细胞海藻糖合酶，可回收重复使用。所得含有海藻糖的溶液用活性炭或脱色树脂脱色，用离子交换树脂脱盐后，即得含有海藻糖的糖类组合物。可将该含有海藻糖的糖类组合物浓缩成糖浆状产物使用，或进一步将糖浆状产物干燥加工成粉状产物使用。
在利用本发明的透性化细胞海藻糖合酶制备海藻糖时，可以直接将上述糖浆状产物浓缩成超饱和溶液，然后再结晶成水合结晶海藻糖和无水海藻糖。也可以先用葡萄糖淀粉酶和/或葡萄糖苷酶处理所得含海藻糖的糖类组合物，使其中的麦芽糖水解为葡萄糖，然后用层析法(如强酸型阳离子交换柱层析法)或膜分离法进行纯化，以获得高海藻糖含量的组份，由此获得的组份再浓缩成超饱和溶液，然后结晶成水合结晶海藻糖和无水海藻糖。
为了制备水合结晶海藻糖，通常将海藻糖纯度至少为60％的海藻糖溶液放入结晶器中，在存在或不存在约0.1％～20％晶种的情况下，于温度95℃或更低，优选10℃～90℃温度范围内，边搅拌边逐渐冷却，即可获得水合结晶海藻糖的糖膏。也可采用连续结晶法。对所得糖膏，可采用常规方法，例如分离、团块粉碎、流动床造粒或喷雾干燥法进行处理。
在进行分离时，通常是对糖膏进行篮式离心，从母液中分离出水合结晶海藻糖。如果需要，可用少量冷水喷淋洗涤所得水合结晶海藻糖，以利于制备高纯度的水合结晶海藻糖。
如用喷雾干燥法，进料糖膏浓度一般约为60％～85％(干基百分比)，结晶度约20％～60％(干基百分比)，所得结晶粉末在吹入约30℃～60℃热空气的条件下再陈化1小时～20小时。
若用团块粉碎法，可将湿度约为10％～25％、结晶度为10％～60％(干基百分比)的糖膏放置几小时至3天左右，使其结晶并固化形成块状，将所得团块磨碎或切碎并干燥，便可制得水合结晶海藻糖。
为了得到无水海藻糖，可将得到的水合结晶海藻糖在70℃～160℃，优选在80℃～100℃的温度下，常压或减压干燥，从而使水合结晶海藻糖转化为无水形式。或者将水分含量低于10％的高海藻含量的溶液置于结晶器中，在晶种存在下于50℃～160℃，优选80℃～140℃的温度下，缓慢搅拌，即可得含无水海藻糖的糖膏，然后再用团块粉碎法、流化床制粒法等常规方法，在相对高温和干燥条件下处理此糖膏，即得无水海藻糖。
海藻糖是稳定的甜味剂，特别是与粘合剂如支链淀粉、羟乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮结合使用时，海藻糖可随意被用作片剂的糖包衣剂。另外，海藻糖有许多特性，如控制渗透压的能力、赋予光泽的能力、保持湿度的能力、基本不发酵性、防止胶凝化淀粉退化的能力以及防止其它多糖结晶的能力等。因此，可随意地将本发明方法制备的海藻糖和含有海藻糖的糖类组合物作为甜味剂、味道改善剂、质量改善剂、稳定剂和填充剂，以混合、捏合、溶解、融化、浸泡、渗透、喷淋、敷、涂、喷、注射、结晶或固化等方法加入多种物质(如食品、烟草、饲料、化妆品和药物等)中。
本发明的优点和积极效果是1、海藻糖合酶工业化应用的障碍是微生物细胞内海藻糖合酶提纯的难度及费用。本发明由于采用渗透处理细胞技术制备透性化细胞海藻糖合酶，其制备过程中勿需经过细胞的破碎、酶的分离提纯等步骤，因而酶的制取成本大大降低。并且，细胞经透性化处理后，整体结构仍完整，但由于壁和膜的通透性被改变，底物可以进入细胞，可保证胞内海藻糖合酶催化作用的充分发挥。
2、本发明的透性化细胞海藻糖合酶，既具备理想的热稳定性(例如，在pH7.0保温60分钟时，直到60℃是稳定的)，又具备理想的pH稳定性(例如，在50℃保温60分钟时，可稳定的pH为4.5～10)。因此，在用于制备海藻糖时，可用pH范围宽，酶反应温度高，不易造成生产污染。
3、本发明的透性化细胞海藻糖合酶因细胞结构对胞内海藻糖合酶具有相当的保护作用，可以避免外界环境对海藻糖合酶的伤害，降低海藻糖合酶变性失活的可能性，延长海藻糖合酶的使用寿命。此外，透性化细胞海藻糖合酶可以被看作是一种不溶性的酶源，与传统方法固定化的酶有相似的用途，并且还可以用已知的各种固定化细胞技术进行固定化。
该透性化细胞海藻糖合酶通过对亚栖热菌属的微生物细胞进行渗透处理而获得，具备理想的热稳定性和pH稳定性，易于通过微生物发酵法大量制备，并用于制取海藻糖。以该酶制备的海藻糖以及含海藻糖的糖类组合物，可广泛用于食品、化妆品和药物组合物中。
图1表示温度对本发明的透性化细胞海藻糖合酶酶活性的影响；图2表示pH值对本发明的透性化细胞海藻糖合酶酶活性的影响；图3表示温度对本发明的透性化细胞海藻糖合酶稳定性的影响；图4表示pH值对本发明的透性化细胞海藻糖合酶稳定性的影响。
具体实施例方式
结合附图及实施例说明利用亚栖热菌CBS-01菌株生产本发明的透性化细胞海藻糖合酶及其用途。
实施例1亚栖热菌CBS-01菌株的培养将含5g/L蛋白胨，1g/L酵母膏，0.7g/L硝酸钠，0.1g/L磷酸氢二钠，0.2g/L硫酸镁和0.1g/L氯化钙的液体营养培养基调到pH为7.5～8.0，取100mL等份的液体营养培养基加入500mL三角瓶中，于120℃高压灭菌20分钟，冷却后接种亚栖热菌CBS01的菌种培养物，然后在约200r/min搅拌条件下50℃～55℃培养约24小时，收集所得培养物用作种子培养物。
将大约3L上述新鲜制备的液体营养培养基放入5L发酵罐中，灭菌，冷却后以约3％(v/v)的接种量接种种子培养物，然后在50℃～60℃，pH7～pH9，搅拌并通气的条件下培养约48小时。培养结束后，检测所得培养物中海藻糖合酶的活性，结果约0.002单位/mL。取部分培养物，在冰浴条件下进行超声波破细胞处理后，再检测酶活性，结果为0.216单位/mL。说明亚栖热菌CBS01产生的海藻糖合酶为胞内酶。
实施例2透性化细胞海藻糖合酶的制备取部分实施例1中所得培养物，加入2％(v/v)氯仿，于60℃以下搅拌处理10分钟～1小时，即得含有透性化细胞海藻糖合酶的处理液。检测所得处理液中海藻糖合酶的活性，结果约0.225单位/mL。与渗透处理前(海藻糖合酶的活性约0.002单位/mL)相比可知，细胞经透性化处理后，表现出的海藻糖合酶的活性可达原细胞的100倍以上。上述处理液可直接使用，或经过离心、过滤、干燥等处理后使用。
另取部分实施例1中所得培养物，离心后得湿菌体，将湿菌体悬浮于水中(每g湿菌体加2mL～20mL水)，加入1％～5％(v/v)甲苯，于60℃以下搅拌处理10分钟～1小时，离心后去除上清，所得沉淀清洗后即得透性化细胞海藻糖合酶。若再经真空冷冻干燥后，可得固体透性化细胞海藻糖合酶。
实施例3透性化细胞海藻糖合酶的性质取部分实施例2中所得透性化细胞海藻糖合酶，按照检测酶活性的方法研究温度和pH对酶活性的影响。图1(温度的影响)和图2(pH的影响)分别显示了这些结果。当在pH7.0保温60分钟时，该透性化细胞海藻糖合酶的最适温度为50℃～65℃；在50℃保温60分钟时，该透性化细胞海藻糖合酶的最适pH为6.2～7.2。将透性化细胞海藻糖合酶加入50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，于不同温度下保温60分钟，冷却后检测缓冲液中的残留酶活性，以确定该透性化细胞海藻糖合酶的热稳定性。将透性化细胞海藻糖合酶分别加入到不同pH的50mM磷酸盐缓冲液中，50℃保温60分钟，冷却后将这些缓冲液的pH调到7.0，并检测各缓冲液中的残留酶活性，以确定该透性化细胞海藻糖合酶的pH稳定性。该透性化细胞海藻糖合酶的热稳定性和pH稳定性的结果分别显示在图3和图4中，由图3、4可见，该透性化细胞海藻糖合酶在温度高至60℃和pH为4.5～10时是稳定的。
实施例4对糖类的作用于麦芽糖水溶液中，加入部分实施例2中所得透性化细胞海藻糖合酶，使麦芽糖最终浓度为5％(w/v)，加酶量为4单位/g麦芽糖，将所得溶液于50℃，pH7.0的条件下进行酶促反应48小时，用高效液相色谱法分析所得反应产物中糖类的组成及含量，其结果列于表1中。
所用高效液相色谱条件如下色谱柱Hypersil NH2，4.6mm×250mm，填料粒径5μm；检测器示差折光检测器；流动相乙腈/水＝75/25(体积比)；柱温室温；进样量20μl；流速1.0mL/min。
于海藻糖水溶液中，加入部分实施例2中所得透性化细胞海藻糖合酶，使海藻糖最终浓度为5％(w/v)，加酶量为4单位/g海藻糖，将所得溶液于50℃，pH7.0的条件下进行酶促反应48小时，用高效液相色谱法分析所得反应产物中糖类的组成及含量，其结果同样列于表1中。
表1来自麦芽糖和海藻糖的产物产物组成及相对含量(％)底物葡萄糖麦芽糖海藻糖麦芽糖 5.524.3 70.2海藻糖 5.121.3 73.6由表1结果可见，本发明的透性化细胞海藻糖合酶能将麦芽糖转化为海藻糖，反之亦然。并且，转化反应的平衡位置倾向于形成海藻糖，即由麦芽糖转化为海藻糖的转化率高于由海藻糖转化为麦芽糖的转化率。
以下实施例A中举例说明了用本发明的透性化细胞海藻糖合酶制得的海藻糖和含有海藻糖的糖类组合物。
实施例A1按照实施例1中所述方法，使用已灭菌的同样的营养培养基，在55℃～65℃，pH7～pH9，通气和搅拌的条件下，用发酵罐将亚栖热菌CBS-01的种子培养物培养约36小时。所得培养物离心后得湿菌体，将湿菌体制成菌悬液(每kg湿菌体加5L水)，于菌悬液中加入2％(v/v)氯仿，45℃～50℃搅拌处理15分钟，离心后去除上清，所得沉淀清洗后即得透性化细胞海藻糖合酶。
于30％(w/v)的玉米淀粉悬浮液(pH约5.5)中，以每吨干物质加1L酶的比例加入诺维信特高耐温淀粉酶CS(Termamyl CS)，110℃液化10min，灭酶，然后将所得淀粉液化液调整到60℃，pH5.0，加入诺维信β-淀粉酶(Novozyme WBA)及诺维信普鲁兰酶(Promozyme D2)糖化48小时，加酶量为每吨干物质加0.7L的β-淀粉酶及1L普鲁兰酶。所得糖化液灭酶后得到含有约85％(干基百分比)麦芽糖的糖溶液，将该糖溶液调整到pH6.5～7.0，按4单位/g干物质的量加入上述方法制备的透性化细胞海藻糖合酶，50℃酶促反应48小时。将反应混合物在100℃灭酶20分钟，冷却，用活性碳按常规方法脱色并过滤，用H-型和OH-型离子交换剂脱盐，浓缩，得到含有约52％(干基百分比)海藻糖的糖浆。
实施例A2按照实施例1中所述方法，将含10g/L麦芽糖，5g/L蛋白胨，1g/L酵母膏，0.7g/L硝酸钠，0.1g/L磷酸氢二钠，0.2g/L硫酸镁和0.1g/L氯化钙的液体营养培养基调到pH为7.5～8，放入发酵罐中，灭菌，冷却后以2％(v/v)的接种量接种亚栖热菌CBS-01的种子培养物，在50℃～60℃，pH7～9，搅拌并通气的条件下培养约72小时。所得培养物离心后得湿菌体，将湿菌体制成菌悬液(每kg湿菌体加10L水)，于菌悬液中加入1％(v/v)甲苯，25℃～30℃搅拌处理40分钟，离心后去除上清，所得沉淀清洗后即得透性化细胞海藻糖合酶。
于20％(w/v)的麦芽糖溶液中，按每g麦芽糖加2单位酶的比例加入上述透性化细胞海藻糖合酶，在pH6.5～7.0，40℃的条件下酶促反应72小时。将反应混合物在100℃灭酶20分钟，冷却，用活性碳按常规方法脱色并过滤，用H-型和OH-型离子交换剂脱盐，得到含有约70％(干基百分比)海藻糖的糖浆。
实施例A3将实施例A2中所得已灭酶的透性化细胞海藻糖合酶的反应混合物，与适量市售葡葡萄糖淀粉酶混合，在pH5.0和50℃下，进行酶促反应24小时～72小时，加热灭酶，脱色、脱盐后，以碱金属型强酸阳离子交换树脂进行层析分离，回收高海藻糖含量的组分，将高海藻糖含量的组分合并后，浓缩、干燥、研磨，可得高海藻糖含量粉末，海藻糖纯度约95％(干基百分比)。
实施例A4将实施例A2中所得含有海藻糖的糖浆于温度50℃～60℃下浓缩至过饱和度约1.1，加入约2％水合海藻糖晶体作为晶种，然后于结晶器内边搅拌边逐渐冷却，以使之结晶。分离晶体，用少量冷水喷淋并洗涤，回收高纯度水合结晶海藻糖，其纯度约98％(干基百分比)。
实施例A5将实施例A2中所得含有海藻糖的糖浆浓缩至过饱和度约1.05，加入约2％水合海藻糖晶体作为晶种，然后于结晶器内逐渐冷却以得到结晶度约为45％的糖膏。将此糖膏进行高压喷雾，得到海藻糖粉末，然后将其注入熟化塔熟化干燥10小时，最后得到粉末状水合结晶海藻糖。
实施例A6将实施例A3中所得高海藻糖含量的组分放入蒸发器中，真空下煮沸得到湿含量约为3％的糖浆。将所得糖浆放在结晶器中，与约2％的无水海藻糖混合，在搅拌条件下于110℃使其结晶并固化形成块状，将所得团块磨碎或切碎并干燥，即得无水海藻糖。
权利要求
1.一种透性化细胞海藻糖合酶，该透性化细胞海藻糖合酶能够将麦芽糖转化为海藻糖，也能够将海藻糖转化为麦芽糖，并具有如下的物理化学特性(1)作用能够将麦芽糖转化为海藻糖，并且也能够将海藻糖转化为麦芽糖；(2)最适温度在pH7.0保温60分钟时，约为50℃～65℃；(3)最适pH在50℃保温60分钟时，约为6.2～7.2；(4)热稳定性在pH7.0保温60分钟时，直到60℃是稳定的；(5)pH稳定性在50℃保温60分钟时，可稳定的pH为4.5～10；其中，所述酶来源于保藏号为CGMCC No.1256的亚栖热菌(Meiothermussp.)CBS-01。
2.一种制备权利要求1所述的透性化细胞海藻糖合酶的方法，该方法包括以下步骤在营养培养基中培养能够产生海藻糖合酶的微生物，所述能够产生海藻糖合酶的微生物为保藏号为CGMCC No.1256的亚栖热菌(Meiothermus sp.)CBS-01；采用渗透处理细胞技术处理已培养好的含有海藻糖合酶的微生物细胞；回收所得的透性化细胞海藻糖合酶。
3.透性化细胞海藻糖合酶制备含海藻糖的糖类组合物的应用。
4.透性化细胞海藻糖合酶制备海藻糖的应用。
5.一种能够产生海藻糖合酶的微生物为保藏号为CGMCC No.1256的亚栖热菌(Meiothermus sp.)CBS-01。
全文摘要
本发明公开了一种透性化细胞海藻糖合酶，该透性化细胞海藻糖合酶能够将麦芽糖转化为海藻糖，也能够将海藻糖转化为麦芽糖；还公开了透性化细胞海藻糖合酶的制备方法及透性化细胞海藻糖合酶制备含海藻糖的糖类组合物的应用和透性化细胞海藻糖合酶制备海藻糖的应用。有益效果是该透性化细胞海藻糖合酶通过对亚栖热菌属的微生物细胞进行渗透处理而获得，具备理想的热稳定性和pH稳定性，易于通过微生物发酵法大量制备，并用于制取海藻糖。以该酶制备的海藻糖以及含海藻糖的糖类组合物，可广泛用于食品、化妆品和药物组合物中。
文档编号C12N9/00GK1648242SQ20041009387
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月8日 优先权日2004年12月8日
发明者张峻, 陈晓云, 齐欣, 蔡国增 申请人:天津市园艺工程研究所