枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，本 发明特别涉及几种新型的芽孢衣壳蛋白为分子载体将外源蛋白基因与其整合到一起，从而 筛选出能够高通量展示目的蛋白量的分子载体，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖是由两个葡萄糖分子以a，a，1，1一糖苷键构成的非还原性糖，在高温、 高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能稳定细胞膜和蛋白质的结构，有效地保护 细胞膜和蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。在海藻糖的工 业生产中，海藻糖合酶与其它海藻糖合成酶相比具有更大的优势，海藻糖合酶海藻糖合酶 (TreS)是一类分子内转糖苷酶，专一性地以生产原料为更加廉价的麦芽糖为底物，一步转 化生成海藻糖，操作工艺简单、底物价格低廉、应用前景良好。
[0003]芽胞表面展示技术是将外源蛋白基因与含有自身启动子的芽胞衣壳蛋白基因融 合，构建融合基因表达载体，然后将这种载体转化到产芽胞的宿主菌株，得到的重组菌株在 生孢培养基中培养时，外源目的基因就会在外套蛋白基因启动子的启动下表达，并通过与 外套蛋白偶联的作用将外源蛋白展示在芽胞的表面。在面临营养缺乏和其他逆境胁迫时， B.subtilis会自发形成特殊的休眠体一一芽孢，抵御不良环境带来的危害。当外界环境适 宜后，芽孢萌发形成具有正常生理活性的营养体。芽孢一般由核心、皮层、芽孢衣壳和芽孢 外壁组成。芽胞表面展示系统由载体蛋白、目的蛋白和宿主3部分组成，每一部分都是表面 展示系统构建成功的关键。在选定芽胞外套蛋白作为锚定蛋白时不仅要考虑它所处的位置 还要考虑其丰度。
[0004]芽胞杆菌中高效表达外源蛋白的最大障碍是构建的重组表达质粒在宿主菌中通 常不稳定，解决这一问题的最有效途径是使用整合型质粒。整合型质粒只在大肠杆菌中有 复制功能，转入革兰氏阳性细菌如枯草芽胞杆菌中则无此功能，因此只有整合到宿主菌的 基因组才能正常的表达目的基因。该发明所用的芽胞杆菌标记基因是抗生素抗性基因。
[0005] 海藻糖合酶已经被广泛应用于海藻糖的工业生产，并大大降低了海藻糖生产的成 本。但如何进一步提高海藻糖合酶的酶活力和转化率仍然是目前研究的热点。利用生物信 息学的知识，通过饱和突变或定点突变技术对海藻糖合酶基因进行遗传学改造，改变酶活 性中心附近以及与热稳定性相关的氨基酸序列，极有可能获得酶活更高和稳定性更高的海 藻糖合酶。因此，通过构建融合表达载体，将海藻糖合酶基因通过芽孢表面展示技术展示在 芽孢表面，可以通过酶活观察目的蛋白的生成量，成为研究解决上述问题的一种途径。
[0006] 由于不同的芽孢衣壳蛋白的分子结构，以及在芽孢中的组成存在差异，单只不同 的芽孢衣壳蛋白做为分子载体，表面展示外源蛋白的重组芽孢的生物学活性也不同。目前 已经有20多种报道出来的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白，但是部分蛋白可能只起到调控或 是运输其他衣壳蛋白的作用，并不具备作为分子载体表面展示外源蛋白的作用。现如今已 经报道出来用作分子载体的Cot芽孢衣壳蛋白有CotB、CotC、CotG、CotX、CotZ等。但由于 酶受空间结构影响较大，这些Cot芽孢衣壳蛋白与目的蛋白结合后是否会影响目的蛋白的 表面展示，目前还没有研究报道。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示 海藻糖合酶的方法。该方法通过筛选不同的芽孢衣壳蛋白作为载体蛋白，经芽孢表面展示 技术将外源蛋白海藻糖合酶展示在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，筛选出具有高展示量的载体 蛋白。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] -种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法，包括如下步 骤：
[0010] (1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板PCR扩增枯草芽孢 杆菌芽孢衣壳蛋白基因，PCR扩增过程中，在上游和下游引物中分别引入BamHI和Xbal酶 切位点，制得枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot;
[0011] 所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG、 枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotB、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotC、枯草芽孢杆 菌芽孢衣壳蛋白基因CotD、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotH、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳 蛋白基因CotX、枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotY或枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因 CotZ；
[0012] (2)以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增，制得海藻糖合成酶TreS的核苷 酸序列；
[0013] (3)去除步骤（1)制得的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因Cot的终止子，然后采用 融合PCR与步骤（2)制得的TreS基因进行融合，融合PCR过程中，在上游和下游中分别引 入限制性内切酶BamHI和Aatll的酶切位点，制得融合基因Cot-TreS;
[0014] (4)将步骤（3)制得的融合基因Cot-TreS经BamHI和Aatll双酶切后，与同样经 BamHI和Aatll双酶切的表达载体pHTOl连接，制得重组质粒pHT01-Cot-TreS;
[0015] (5)将步骤（4)制得的重组质粒pHT01-Cot-TreS转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 168 (trp)，转化后经涂布含氯霉素的LB平板进行筛选，然后经碘液显色方式进 行转化子鉴定，获得阳性菌株；
[0016] (6)将步骤（5)制得的阳性菌株经DSM培养基35~37°C诱导培养45~50h，制得 表面展示海藻糖合酶的重组芽孢。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为枯草芽孢 杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG;
[0018] 进一步优选的，所述枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的PCR扩增引物，核苷 酸序列如下：
[0019] CotG-F：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
[0020] CotG-R：GCTGGGTCATTCTAGATTTGTATTTCTTTTTGACTACC
[0021] PCR扩增体系如下，总体积50yL:
[0022] 2XHiFi-PCR Master 25 y L，引物CotG-F 2. 5 y L，引物CotG-R 2. 5 y L，Bacillus subtilis 168基因组2.5yL，ddH20 17.5yL;
[0023] PCR扩增程序如下：
[0024] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，48°C退火 30s，72°C延伸IminlOs，共 30 个循环； 72°C继续延伸lOmin。
[0025] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)168；
[0026] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中PCR的扩增引物，核苷酸序列如下：
[0027] TreS-F ：TAAGTATTTTATCTAGAATGACCCAGCCCGACCC
[0028] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
[0029] PCR扩增体系，总体积50 y 1 :
[0030] 2XHiFi-PCR Master 25 y L，引物TreS-F 2. 5 y L，引物TreS-R 2. 5 y L， pET15b-TreS 2. 5 y L, ddH20 17. 5 y L；
[0031] PCR扩增程序如下：
[0032] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸lmin30s，共 30 个循环； 72°C继续延伸lOmin。
[0033] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)来源于 美国模式培养物集存库，保藏编号：ATCC47054。
[0034] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中去除枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的 终止子的步骤如下：
[0035] 在设计引物时，人为的去除枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotG的终止密码子， 插入酶切位点Aatll。
[0036] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中去除TreS基因的终止子的步骤如下：
[0037] 在设计引物时，人为的去除海藻糖合酶基因TreS的终止密码子TGA，插入酶切位 点Aatll〇
[0038] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中融合PCR采用二次融合PCR扩增，扩增引物核 苷酸序列如下：
[0039] CotG-F ：GGATCCATGGGCCACTATTCCCAT
[0040] TreS-R ：CTCACCATGACGTCAACATGCCCGCTGCTGT；
[0041] 第一轮融合PCR扩增体系如下，总体积25 y 1 :
[0042]2XHiFi-PCR Master 12. 5 y L，胶回收产物CotG 2 y L，胶回收产物TreS 2 y L， ddH20 8. 5 y L；
[0043] 第一轮融合PCR扩增程序如下：
[0044] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 4min，5 个循环；72°C继 续延伸l〇min。
[0045] 第二轮融合PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂：
[0046] 2 XHiFi-PCR Master 12. 5 yL，引物CotG-F 1 yL，引物TreS-R 1 yL，ddH20 10. 5 yL；
[0047]第二轮融合PCR扩增程序如下：
[0048] 95°C预变性 5min;95°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 5min30s，共 30 个循环； 72°C继续延伸lOmin。
[0049] 根据本发明优选的，所述步骤（4)中连接体系如下，总体积10yL:
[0050] CotG-TreS4yL，表达载体pHT013yL，5XT4buffer2yL，T4 连接酶 1yL;
[0051] 连接条件为：16 °C连接过夜。
[0052] 根据本发明优选的，所述步骤（6)中的DSM培养基组分如下：
[0053] 0?8wt% 肉汤培养液，0?lwt%KC1，0.025wt%MgS04 ? 7H20,1. OMm Ca(N03)2,10 yM FeS04〇
[0054] 以CotG为分子载体时，每毫升芽孢悬浮液的酶活力为0. 63U/mg，表明CotG可以作 为表面展示海藻糖合酶的分子载体。
[0055] 有益效果
[0056] 1、本发明利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设 计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋 白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示 海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。高效展示在芽孢表面的海藻糖合酶，无抗菌活性，达到食品应 用酶制剂要求，有利于下一步海藻糖的生产制造。
[0057] 2、本方法选择的Cot系列的芽孢衣壳蛋白基因作为表面展示蛋白的分子载体，选 择具有保护性抗原蛋白和具有催化活性的海藻糖合酶基因为目的基因，以具有转化能力、 安全性高且可产生芽孢的枯草芽孢杆菌菌株（如Bacillussubtilis168菌株）作为重组 质粒的转化菌株，可通过测定酶活或其他手段检测芽孢表面展示的海藻糖合酶量。
【具体实施方式】
[0058] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0059] 本方法中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。
[0060] 在以下的实施例中，未详细描述的和各种过程和方法是本领域中公知的常规方 法。所用试剂的来源、商品名称以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后 所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0061] 菌株来源：
[0062] 实施例中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis) 168,购自杭州宝 赛生物有限公司。
[0063] 实施例中的恶臭假单孢菌（Pseudomonasputida)购自美国模式培养物集存库 (Americantypeculturecollection)，菌种编号ATCC47054。
[0064] 表达载体pHTOl购自杭州宝赛生物有限公司。
[0065] 实施例1
[0066] 以CotB为分子载体在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组芽孢的 制备。
[0067] 枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotB基因的获得
[0068] 将培养好的枯草芽孢杆菌菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书 提取枯草芽孢杆菌168基因组DNA。另外根据NCBI数据库中CotB基因的编码序列设计引 物，在上游和下游引物中分别引入BamHI和Xbal酶切位点，引物由生工生物工程（上海）股 份有限公司。采用宝生物工程有限公司的2XHiFi-PCRMaster聚合酶，以提取的枯草芽孢 杆菌基因组DNA为模板扩增CotH。引物核苷酸序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
[0069]CotB-F：GGATCCATGAGCAAGAGGAGAATGAAA
[0070]CotB-R：TGGGTCATAAATTTACGTCTAGATTTCCAGT；
[0071]PCR扩增体系如下，总体积50y1 :
[0072] 2XHiFi-PCRMaster25yL，引物CotB-F2. 5yL，引物CotB-R2. 5yL，Bacillus subtilis168基因组 2.5yL，ddH20 17.5yL;
[0073] PCR扩增程序如下：
[00