一株枯草芽孢杆菌及包含该菌株的饲料添加剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及功能微生物筛选技术领域，具体设及一株枯草芽抱杆菌及包含该菌株 的饲料添加剂。
【背景技术】
[0002] 随着水产品需求量的增加及水产品贸易的国际化发展，水产养殖业近年来发展突 飞猛进。但是，水产养殖的集约化和高密度规模日益扩大，养殖环境的恶化和疾病的危害给 水产养殖业带来了巨大的经济损失。传统防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用 易产生耐药性菌株问题，并且存在水产动物体内残留的问题，因此寻找抗生素替代品成为 必然。
[0003] 益生菌能够参与动物体内微生物平衡，直接通过增强动物对肠内有害微生物群落 的抑制作用，或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，进而间接起到促进动物生长的作 用，提高动物饲料的转化率。因此，近些年对于益生菌的筛选成为本领域内的研究热点，也 对水产饲料配方的改进具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株新型枯草芽抱杆菌及包含该菌株的水产饲料添加剂。所 述枯草芽抱杆菌度acillussubtillis)筛选自南美白对邮养殖池，能够有效抑制病原菌， 提高水产动物的免疫力和抗病力，促进水产动物生长，应用前景广泛。
[0005] 本发明一方面提供了一株枯草芽抱杆菌SY12度acillussubtillisSY12)，已 于2015年8月10日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、，其保藏编号为 CCTCCNO:12015483ο
[0006] 本发明另一方面提供了包含上述枯草芽抱杆菌的饲料添加剂。
[0007] 所述饲料添加剂还包括多糖、维生素、中草药、酶或乳化剂中的一种或多种的组 么 η〇
[0008] 本发明还提供了上述枯草芽抱杆菌在水产养殖中的应用。 阳009] 本发明的有益效果：
[0010] 本发明筛选到的枯草芽抱杆菌SY12,能有效抑制哈维弧菌和媛弧菌等病原菌，提 高养殖动物的免疫力，减少病害的发生，同时该菌株产蛋白酶和淀粉酶的能力均较强，可作 为饲料添加剂，显著提高养殖动物的消化能力和对饲料的利用率，促进动物生长。
[0011] 所述枯草芽抱杆菌SY12可作为益生菌应用于草鱼和南美白对邮的养殖生产中。 与对照组相比，饲喂本发明所述枯草芽抱杆菌SY12的实验组草鱼的增重率提高了 26. 8% ; 且实验组草鱼血清中溶菌酶、碱性憐酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶的酶活分别提高了 4. 1%、10. 5%、3. 9%、80. 4% ;实验组草鱼消化道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性分别提 高了 23. 2%、70. 1%、6. 2%。；饲喂包含枯草芽抱杆菌SY12的复合添加剂的实验组中南美 白对邮的增重率和特定生长率分别提高了 17. 3%和9.4% ;且实验组对邮血液中血细胞数 和呼吸爆发活力分别提高了 38. 4%和14. 7% ;实验组对邮血清中酪氧化酶、超氧化物歧化 酶和一氧化氮合酶的酶活力分别提高了 42. 9%、3. 8%和21. 4%;实验组对邮消化道中蛋白 酶和淀粉酶的酶活力分别提高了 62. 5%和71. 8%，均取得了显著的技术效果。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1菌株的分离、筛选与鉴定 [001引1、样品
[0014] 采集于青岛市胶州南美白对邮养殖场养殖池水样。 阳01引 2、培养基：
[0016] D2216E海水培养基：蛋白陈5g，酵母浸出物Ig，憐酸铁O.Olg，海水1000ml， 抑7. 6-7. 8,配制固体培养基加入15-20g的琼脂，121°C灭菌20min。 阳017] 2)TSB培养基：膜蛋白腺大豆肉汤30g，氯化钢15g，蒸馈水1000ml，pH7. 4-7. 6,配 制固体培养基加入15-20g的琼脂，121°C灭菌20min。 阳0化]扣MRS培养基：蛋白腺lOg，牛肉膏lOg，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐溫-801ml，憐酸二氨钟2g，巧樣酸二锭2g，乙酸钢5g，硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 15g，蒸馈水1000ml， P册.2-6. 4,加入15-20g的琼脂W配制固体培养基，115°C灭菌20min。
[0019] 4)淀粉水解培养基：蛋白腺lOg，牛肉膏5g，氯化钢5g，可溶性淀粉2g，蒸馈水 1000ml，pH7. 4-7. 6,115Γ灭菌 20min。
[0020] 5)酪素水解培养基：溶液A:酵母膏3g、蛋白腺lOg、琼脂lOg、海水1000ml;溶液 B:酪蛋白lOg、蒸馈水250ml;溶液C:琼脂lOg、蒸馈水250ml;分别将立种溶液m°C灭菌 20min，冷却后先将B液和C液混合，倒入平板形成一薄层，待薄层凝固后倒入A液，制成双 层平板。
[0021] 3、筛选方法
[0022] 取1ml水样，用无菌生理盐水10倍梯度稀释，分别接种于2216E、TSB和MRS固体 培养基上，28°C培养2地-4她。选取均匀清晰的单菌落，划线纯化细菌。单菌落依此命名为SY1、SY2、SY3......、SY16。
[0023] W致病菌一一哈维弧菌和媛弧菌为指示菌，采用平板括抗法筛选益生菌。在涂有 指示菌的平板上点种待筛选的细菌菌液，28°C恒溫培养，4化内观察点种区周围是否出现抑 菌透明区或覆盖区。对病原菌的抑制作用表示为抑菌圈直径与菌落直径的比值，1则没有抑 制作用，1-2表示具有一定的抑制作用，〉2表示抑菌作用较强。具体结果见表1
[0024] 表1潜在益生菌株抑菌情况 阳0巧]
[00%] 从表1的数据可W看出，本发明筛选到的菌株中只有5株菌对哈维弧菌和媛弧菌 均具有一定的抑制作用，其中W菌株SY12的抑菌能力最强。
[0027] 将筛选出的SY1、SY2、SY5、SY8和SY12运5株病原菌括抗菌分别点种于淀粉水解 培养基和酵素水解培养基上，28°C恒溫培养4化形成明显菌落后观察有无透明水解圈。产 酶能力表示为透明圈直径与菌落直径的比值，1表示不产生酶，1-2表示产酶能力一般，〉2 表示产酶能力较强。具体结果见表2 阳〇 2引表2潜在益生菌株产酶能力
[0029]
[0030] 从表2的数据可W看出，本发明筛选到的5株病原菌括抗菌中只有SY8和SY12产 蛋白酶和淀粉酶的能力均较强，而其中又WSY12菌株的综合产酶能力最强。
[0031] 4、菌株鉴定
[0032] 1)菌落形态特征：将上述菌株SY12重新划线培养，其菌落呈现为扁平状，灰白色， 不透明，边缘银齿状。 阳03引 2)提取上述菌株SY12的基因组