一种枯草芽孢杆菌及其在玉米炭疽病生防中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种枯草芽抱杆菌及其应用，尤其设及一种枯草芽抱杆菌及其在玉米 炭痘病生防中的应用。
【背景技术】
[0002] 玉米炭痘病由禾生炭痘菌(Colletotrichum graminicola)引起，主要危害玉米叶 片，病斑梭形至近梭形，中央浅褐色，四周深褐色，大小2~4X1~2(mm)，病部生有黑色小粒 点，即病菌分生抱子盘，后期病斑融合，致叶片枯死。禾生炭痘菌的分生抱子盘散生或聚生， 黑色；刚毛暗褐色，具隔膜3~7个，顶端浅褐色，稍尖，基部稍膨大，大小60~119X4~6(μ m);分生抱子梗圆柱形，单胞无色，大小10~15X3~5(皿）；分生抱子新月形，无色，单胞，大 小17~32 X 3~5 (皿）。
[0003] 玉米炭痘病在欧美各国普遍发生，造成严重减产。该病在我国的东北Ξ省和云南 等地有分布，曾在吉林省严重发生。我国生产中缺乏相应的抗炭痘病种质资源，因此玉米炭 痘病在我国东北春玉米区发生呈逐年加重趋势，也威胁着黄淮海玉米产区。
[0004] 目前，玉米炭痘病的防治主要是化学防治，多采用广谱性化学药剂，例如甲基硫菌 灵、苯菌灵等。中国专利申请CN103563945A公开了一种含化挫酸菌醋和丙硫菌挫的杀菌组 合物及其应用。该杀菌组合物W化挫酸菌醋和丙硫菌挫为主要有效成分，其中化挫酸菌醋 与丙硫菌挫的重量比为1~70:1~50。该杀菌组合物可W用于防治农作物的多种真菌性病 害，包括叶枯病、诱病、白粉病、霜霉病、疫病、炭痘病、疮痴病、褐斑病、立枯病、灰霉病、黑 星病、青霉病等。广谱性化学药剂的危害早已得到共识，寻找具有强括抗作用的微生物防治 植物病害是最理想的植保手段之一。
[0005] 目前，用于玉米炭痘病生防的微生物鲜有报道，已报到的括抗微生物也只是起辅 助防治作用，例如假单胞杆菌在玉米炭痘病生防中的应用就是一种辅助性的防治手段。目 前，尚没有对玉米炭痘病菌具有强抑制作用的微生物的报道。
[0006] 由于已知的能够抑制玉米炭痘病菌的微生物的括抗作用不能满足病害防治需要， 且此类微生物的种类屈指可数。因此，筛选对玉米炭痘病菌具有生防作用的微生物，尤其是 筛选定植能力和对玉米炭痘病菌具有强括抗作用的微生物，对于实现玉米炭痘病的生物防 治意义重大。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种新型微生物，其对玉米炭痘病菌具有强括抗作用并易于 定植。
[000引本发明的另一个目的是提供上述新型微生物在玉米炭痘病生防中的应用，W显著 提升玉米炭痘病生防效果。
[0009]本发明的再一个目的是提供一种生防制剂，其使用方便，并可W显著提升玉米炭 痘病生防效果。
[0010] 本发明提供的一种枯草芽抱杆菌的16S rDNA含有如SEQ ID N0:1所示的序列。
[0011] 根据本发明所述的枯草芽抱杆菌，优选地，所述枯草芽抱杆菌保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏号为CGMCC No. 11489。
[0012] 本发明提供的一种枯草芽抱杆菌在玉米炭痘病生防中的应用为，利用W上所述的 枯草芽抱杆菌抑制玉米炭痘病菌。
[0013] 根据本发明提供的所述应用，优选为，将含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂施于玉米 叶片上，使所述枯草芽抱杆菌在玉米叶片上定植，抑制玉米炭痘病菌。
[0014] 根据本发明的所述应用，优选地，所述菌剂为含有所述枯草芽抱杆菌的悬浮液。
[0015] 根据本发明的所述应用，优选地，所述悬浮液中的枯草芽抱杆菌的浓度为108~ 1〇12个/毫升。
[0016] 根据本发明的所述应用，优选地，所述悬浮液中含有0.01~0.15重量％的助悬剂。
[0017] 根据本发明的所述应用，优选地，将含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂施于玉米植株 上的方法为，将含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂制成枯草芽抱杆菌的浓度为1〇6~i〇iMV毫 升的喷液进行喷雾。
[0018] 所述枯草芽抱杆菌的形态为芽抱。
[0019] 本发明提供的一种生防制剂为本发明的上述应用中的所述悬浮液。
[0020] 本发明提供的枯草芽抱杆菌为玉米炭痘病的生防提供了具有强括抗作用并易于 定植的新型微生物。本发明提供的枯草芽抱杆菌在玉米炭痘病生防中的应用，是一种高效 稳定的玉米炭痘病生防方法，其利用了所述枯草芽抱杆菌在玉米叶片上易于定植且对玉米 炭痘病菌具有强括抗作用的特点，能够更好地满足农业生产中防治玉米炭痘病的要求。
【附图说明】
[0021] 图1-1、1-2和1-3分别为所述枯草芽抱杆菌的菌落W及油镜和电镜下的菌体形态；
[0022] 图2为枯草芽抱杆菌D1的16S rDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图；
[0023] 图3为枯草芽抱杆菌D1的16S rDNA系统发育树；
[0024] 图4-1和图4-2分别为用于检验枯草芽抱杆菌D1对玉米炭痘病生防作用的试验中 对照和处理条件下玉米炭痘病菌菌落形态；
[0025] 图5-1和图5-2分别为芽抱杆菌对玉米炭痘菌分生抱子萌发影响实验的对照和处 理的显微图像。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图W及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并 不限于此。
[0027] 本发明所述的"生盼'是植物保护领域的常用术语，即，"生物防治"的简称。
[0028] 在没有特别说明的情况下，本发明所述的枯草芽抱杆菌可W为营养体，也可W为 芽抱。
[0029] 本发明提及的"D1"为本发明的枯草芽抱杆菌在研发过程的代号，为了表述方便， 本发明继续沿用。
[0030] <枯草芽抱杆菌〉
[0031] 本发明提供的一种枯草芽抱杆菌的16S rDNA含有如SEQ ID NO:1所示的序列。
[0032] 本发明提供的一种枯草芽抱杆菌，是从河南新乡的玉米炭痘病发生田的玉米叶片 表面分离、筛选和培养而得的菌株，其对于玉米炭痘病具有稳定而显著的括抗效果，经微生 物学形态分类与分子鉴定，属于枯草芽抱杆菌。
[0033] 所述枯草芽抱杆菌接种于LB培养基平板上，30°C，培养24小时。菌落呈淡黄色半透 明，表面稍粗糖，有隆起，边缘不规则。显微观察细菌菌株D1菌体呈杆状，两端纯圆，长2.1- 3. Ιμπι，宽0.7-0.祉m。图1-1、1-2和1-3分别为所述枯草芽抱杆菌的菌落W及油镜和电镜下 的菌体形态。
[0034] 所述枯草芽抱杆菌的16S rDNA的扩增方法为:挑取少量菌落，置于PCR管中，加入 20化去离子水，95°C处理10分钟，冷却后作为PCR模板，用于扩增16S rDNA序列。
[00巧]扩增所用引物为细菌16S rDNA序列通用引物27F和1492R。正向引物为如SEQ ID N0:2所示的引物(27F)，反向引物为如SEQ ID N0:3所示的引物（1492R)。
[0036] PCR扩增体系为20化：模板化L，引物1和2各化L，Taq酶0 . ：3yL，Buff er化L，dNTP 1.化L，其余用dd水补足。扩增条件：94°C3min，94°C30s，55°C30s，72°C90s，30循环，72°C 5min"PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小为1500bp左右，凝胶成像参见附图2所示。
[0037] 经序列分析D1的16S rDNA序列长度约为1500bp。将D1的16S rDNA序列进行BLAST 比对分析，结果显示D1菌株与B. subtil is的相似度最高，达到了99 %。
[0038] 将得到的16S rDNA序列与GenBank的核巧酸数据库进行化AST比对，获得相近的 16S rDNA序列，用MEGA5.0的化iglibor-joining法构建系统进化树。参见图3所示，D1菌株与 B. subtil is的进化距离最短，位于同一分支，是B. subtil is的近似种。结合形态特征和分子 鉴定，将D1菌株确定为枯草芽抱杆菌(B.subtilis)。
[0039] 本发明提供的枯草芽抱杆菌已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2015年10月13日，保藏号是CGMCC No. 11489,分类命名为枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis。
[0040] <枯草芽抱杆菌在玉米炭痘病生防中的应用〉
[0041] 本发明提供的枯草芽抱杆菌在玉米炭痘病生防中的应用为，利用W上所述的枯草 芽抱杆菌抑制玉米炭痘病菌。具体操作手段为，将含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂施于玉米 叶片上，使所述枯草芽抱杆菌在玉米叶片上定植，控制玉米炭痘病菌。
[0042] 将含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂施于玉米叶片上的时期可W为任一时期;优选为 六叶期W后，且在吐丝期之前为好;更优选为六叶期到十叶期，运个时期的玉米植株具有了 易于承载菌剂的叶片面积，而且炭痘病一般不会发展到严重的程度，所W利用发挥较好的 防控效果。
[0043] 将含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂施于玉米植株上的方法可W采用本领域通常采 用的喷施法，即，利用喷雾设备将含有所述枯草芽抱杆菌的喷液喷到玉米植株上。所述喷液 的枯草芽抱杆菌的浓度可W参照普通生防菌喷液的浓度，例如可W为106~i〇iMV毫升，优 选为107~109个/毫