升。所述喷液的喷施量可W为2~20升/亩，优选为5~10升/亩，W多次喷 施为佳。
[0044] 所述喷液可W直接由各种形式和浓度的含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂配置而成。 所述悬浮液中的所述枯草芽抱杆菌的浓度，可W为ΙΟ8~1〇12个/毫升，优选为ΙΟ8~i〇iMV 毫升。所述悬浮液中可W含有0.01~0.15重量％的助悬剂。所述助悬剂可W为本领域常用 的各种助悬剂，例如可W选自吐溫、簇甲基纤维素、海藻酸钢、明胶、甘露醇、山梨醇等，优选 为吐溫，更优选为吐溫80。在本发明的一个优选实施方式中，用W配置所述喷液的菌剂为由 所述枯草芽抱杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的悬浮液。所述悬浮液中助悬剂的重量百 分数优选为0.02~0.1重量％，更优选为0.03~0.08重量％。
[0045] 用W配置所述喷液的菌剂中的枯草芽抱杆菌可W为其营养体或芽抱。优选为芽 抱，芽抱代谢相对静止，抗逆能力强，能够长期保存，利于开发为菌剂。所述枯草芽抱杆菌的 芽抱可W采用如下方法而获得:利用LB或NA培养基，在30~32°C溫度下培养枯草芽抱杆菌3 ~5天，大量产生枯草芽抱杆菌的芽抱。
[0046] <生防制剂〉
[0047] 含有所述枯草芽抱杆菌的菌剂就是本发明要保护的生防制剂。所述生防制剂通常 为含有枯草芽抱杆菌的悬浮液，优选地，所述悬浮液含有0.01~0.15重量％的助悬剂。所述 悬浮液可W由所述枯草芽抱杆菌与含有助悬剂的无菌水配成的。所述悬浮液中的所述枯草 芽抱杆菌的浓度，可W为1〇7~ΙΟ"个/毫升，优选为1〇8~1〇"个/毫升。所述悬浮液中助悬剂 的重量浓度优选为0.02~0.1重量％，更优选为0.03~0.08重量％。所述助悬剂可W为本领 域常用的各种助悬剂，例如可W选自吐溫、簇甲基纤维素、海藻酸钢、明胶、甘露醇、山梨醇 等，优选为吐溫，更优选为吐溫80。
[0048] 用W配置所述喷液的菌剂中的枯草芽抱杆菌可W为其营养体或芽抱。优选为芽 抱，芽抱代谢相对静止，抗逆能力强，能够长期保存，利于开发为菌剂。所述枯草芽抱杆菌的 芽抱可W采用如下方法而获得:利用LB或ΝΑ培养基，在30~32°C溫度下培养枯草芽抱杆菌3 ~5天，大量产生枯草芽抱杆菌的芽抱。优选的保存溫度为23~28°C，更优选为24~26°C。
[0049] 下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0050] W下实施例设及到的各种培养基都是本领域常用的标准培养基，例如：
[0051] LB液体培养基为膜蛋白腺l%(w/v)，酵母提取物0.5%(w/v)，氯化钢l%(w/v)， PH7.0-7.2。
[0052] LB固体培养基（简称LB培养基）是在上述LB液体培养基的基础上添加了琼脂1.5- 2%(w/v)，即为膜蛋白腺l%(w/v)，酵母提取物0.5%(w/v)，氯化钢l%(w/v)，pH7.0-7.2。 [005；3] 实施例1
[0054] 本发明的枯草芽抱杆菌对玉米炭痘病菌抑制作用的鉴定：
[0055] 纯化后的枯草芽抱杆菌(D1菌株），单菌落接种在LB培养基上，30°C培养2地。挑取 一接种环接入装有lOOmL的LB液体培养基的250mLS角瓶中，在30°C，200巧m/min的条件下 振荡培养2地。菌悬液经1200化pm离屯、，再经孔径0.22化细菌过滤器过滤。吸取ImL滤液加入 到19mL的43°C左右的PDA培养基中，混匀，待培养基冷却后，接入直径5mm玉米炭痘病菌菌 饼，25°C培养。无菌水为对照。每个处理3次重复。培养7d后，采用十字交叉法测量菌落直径。 计算抑制率。
[0化6] 抑制率=[(对照菌直径一处理菌直径)/(对照菌直径一菌饼直径）]X 100%。
[0化7] 参见图4-1和图4-2,在对照处理下，玉米炭痘病菌生长快速，生长7天的菌落直径 为8.84cm，而加入菌株D1发酵液的PDA培养基上，玉米炭痘病菌生长缓慢，菌落直径为 2.23cm，因此计算抑菌率为79.3 %。
[005引 实施例2
[0059] 本发明的枯草芽抱杆菌D1对玉米炭痘病菌分生抱子萌发的抑制实验:
[0060] 将玉米炭痘菌在PDA培养基上培养4d，无菌水冲洗并收集分生抱子，配成浓度1〇6 个/血抱子悬浮液。取80化抱子悬浮液与20化的D1菌株发酵液混合，置于预先涂有石蜡的凹 玻片上，25°C培养，24h，观察抱子萌发状况。W无菌水为对照。
[0061] 参见图5-1，在对照处理下，分生抱子正常萌发，产生芽管，顶端生成黑色附着胞。 参见图5-2,在本发明的枯草芽抱杆菌D1发酵液处理下，分生抱子也能萌发，但分生抱子顶 端膨大成球形，未形成附着胞。运种情况下，玉米炭痘菌不能侵染玉米叶片。
[006。 实施例3
[0063 ]本发明的生防制剂(悬浮液菌剂)的制备方法：
[0064] LB培养基，培养3d，30-32°C，即可产生大量芽抱。用含有0.05重量％的吐溫80的无 菌水将芽抱配制成悬浮液，浓度为1〇8个/mL，保存。
[0065] 其他保存溫度的对比试验：
[0066] 分别在4°0、20°0、25°0、30°0保存1个月、2个月，检测枯草芽抱杆菌菌体活力，发现 25°C条件下，菌体活力最强，未见衰退，且保存期1个月和2个月菌体活力无显著差别，因此 选择该条件为芽抱的保存条件。
[0067] 实施例4
[0068] 在玉米植株上测试本发明的枯草芽抱杆菌在玉米炭痘病生防中的应用的效果。
[0069] 该测试为溫室盆栽试验，尽量排除外界干扰条件。溫室位于中国农业科学院植物 保护研究所。玉米品种为Mol7,对炭痘病高感;营养基质为草炭:赔石按照2:1比例混合。将 玉米种子种于营养鉢中，待六叶期，将实施例3得到悬浮液稀释10倍，通过喷雾法喷到玉米 叶片上，24h后，再通过喷雾法将玉米炭痘菌分生抱子接种到玉米叶片，浓度为106个/mL。对 照为无菌水，然后接种同样的玉米炭痘分生抱子悬浮液。对照30株玉米，处理30株玉米。每 株玉米喷洒枯草芽抱杆菌菌剂10倍稀释液2mU玉米炭痘菌分生抱子悬浮液2mL和无菌水 2mLmL。溫室环境溫度为2^30°C，相对湿度80%。培养14(1检查玉米叶片发病情况，统计病情 指数，计算防效。利用本发明实施例3的悬浮液处理的玉米叶片炭痘病发病率病情指数为 14,而对照下病情指数为39,实施例3的悬浮液的平均防效为64.1%。
[0070]
[0071] 实施例5
[0072] 枯草芽抱杆菌D1在玉米叶片定植能力检测：
[0073] 实施例4的试验中，调查玉米炭痘病病情指数的同时，采回玉米叶片，分离叶片表 面细菌，并鉴定是否存在枯草芽抱杆菌。用无菌水刷洗玉米叶片表面微生物到1.5mL离屯、管 中，1200化pm离屯、3min，弃上清后，加入无菌水后重悬，将悬浮液涂布在LB培养基表面，30°C 培养24h，待细菌菌落长出后，纯化菌落，并进行16S rDNA鉴定。经鉴定，从玉米叶片表面能 够分离出枯草芽抱杆菌，占所有分离细菌总数的18.5%。由此可见，枯草芽抱杆菌在玉米叶 片的定植能力很好，能够持续的发挥生防效果。
[0074] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技 术人员可w想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的16S rDNA含有如SEQ ID N0:1 所示的序列。2. 根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 11489。3. -种枯草芽孢杆菌在玉米炭疽病生防中的应用，其特征在于，利用权利要求1或2所 述的枯草芽孢杆菌抑制玉米炭疽病菌。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂施于玉米 叶片上，使所述枯草芽孢杆菌在玉米叶片上定植，抑制玉米炭疽病菌。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌剂为含有所述枯草芽孢杆菌的悬浮 液。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述悬浮液中的枯草芽孢杆菌的浓度为108 ~1012个/毫升。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述悬浮液中含有0.01~0.15重量％的助 悬剂。8. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂施于玉米 植株上的方法为，将含有所述枯草芽孢杆菌的菌剂制成枯草芽孢杆菌的浓度为1〇 6~101° 个/毫升的喷液进行喷雾。9. 根据权利要求4~8任一项所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的形态为芽 孢。10. -种生防制剂，其特征在于，为权利要求5或6所述的应用中所述的悬浮液。
【专利摘要】本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在玉米炭疽病生防中的应用。本发明的枯草芽孢杆菌的16S？rDNA含有如SEQ？ID？NO:1所示的序列。本发明的枯草芽孢杆菌对玉米炭疽病菌具有强拮抗作用并易于定植在玉米叶片，因而能够更好地满足农业生产中防治玉米炭疽病的要求。CGMCC No.1148920151013
【IPC分类】A01P3/00, C12R1/125, C12N1/20, A01N63/00
【公开号】CN105543121
【申请号】CN201510787255
【发明人】田雪亮, 刘文德, 王国良
【申请人】河南科技学院, 中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年11月17日