一株产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一株生产心天冬氨酸α-脱簇酶的菌株，W及 利用该菌株生产的心天冬氨酸α-脱簇酶发酵液催化制备β-丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] β-丙氨酸是天然存在的唯一 β型非蛋白氨基酸，用于合成肌肤、泛酸巧、己柳氮及 帕米憐酸钢等医药产品，用途非常广泛。目前0-丙氨酸主要采用化学合成法，成本高、条件 及生产环境不友好等缺点，开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会 效益。心天冬氨酸α-脱簇酶化-aspa;rtatea-deca;rboxylase，EC4.1.1.11，PanD)是泛酸生物 合成途径中的关键酶，催化k天冬氨酸脱簇基生成β-丙氨酸，利用该酶W廉价的k天冬氨 酸为原料可W实现0-丙氨酸绿色高效的工业生产。
[0003] PanD 在大肠杆菌（Escher i ch ia CO 1 i )、结核分枝杆菌（My cobacterium tuberculosis)、沙口氏菌（Salmonella typhimurium)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutami州m)及幽口螺杆菌化elicobacter pylori)等微生物中均有存在，目前研究较多 的是大肠杆菌和结核分枝杆菌。国内外研究者利用上述菌株做了很多研究工作，如美国NSC 技术有限公司扩增表达了E. coli来源的化nD基因，测得该酶酶活为0.115mmol/g · h， 畑opra等人扩增了致病菌Mycobacterium tuberculosis来源的化nD基因并在E. coli BL2UDE3)中表达，粗酶液酶活达到0.035mmol/g .h，高丽娟等将E. coli D册α来源的panD 在E. coli BL2UDE3)中表达构建工程菌，酶活为224.9611/1;洪敏等将E. coli D册a panD 连接到祀T28c( + )载体，转化E. coli化21(DE3)，经诱导培养重组菌酶活为186 U/L发酵 液。W上报道受限于较低的酶活力，距离工业化应用尚有较大的距离。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供从葡萄园中分离得到的一株高效生产心天冬氨酸α-脱簇酶 的菌株，并应用该菌株产生的心天冬氨酸α-脱簇酶酶法制备β-丙氨酸的方法。
[0005] 本发明所提供的产心天冬氨酸α-脱簇酶的菌株是从烟台地区葡萄园±壤中分离 得到，运是一株心天冬氨酸α-脱簇酶分泌能力极高的菌株，培养方法简单，生长速度快，不 易变异，可W直接用于酶法制备0-丙氨酸。将其编号为化nD37,保藏于中国普通微生物菌种 保藏管理中屯、，保藏日期为2015年2月2日，分类命名为特基拉芽抱杆菌（Bacillus 16911116邮18化11〇37)，保藏编号为：〔610：齡.10506。该菌株的168扣魁基因序列已递交 到了GenBank数据库。在ht1:p: //www. ncbi . nlm. nih. gov/网站上用blast程序与已登录细菌 菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明菌株化nD37与Bacillus tequilensis相似度 最高，达到99%。
[0006] 本发明所述菌株的レ天冬氨酸α-脱簇酶的发酵生产及用于催化制备β-丙氨酸的 方法如下： 1、培养基配制 (1)固体保藏培养基：酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g/L，化Cl 5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0，121°C高压蒸汽灭菌20min; (2)液体种子培养基:酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g/L，化Cl 5 g/L，pH 7.0，12rC高压蒸汽灭菌20min;(3)发酵培养基:葡萄糖20 g/L，蛋白腺20 g/ L，天冬氨酸 2 g/L，MgS〇4 0.2 g/L，硫酸锭 3 g/L，K此PO4O.5 g/L，pH 7.0，115°C高压 蒸汽灭菌20min; 2、 菌株活化:挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒溫培养箱30°C培养14~20h; 3、 液体种子制备:挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500mlS角瓶中，八 层纱布封口，于30°C，160~20化/min摇床振荡培养12~24h，得液体种子； 4、 液体发酵:按5~10%接种量向发酵培养基接入液体种子，转速200~70化/min，溶氧 控制20~50%，抑7.0~7.5,溫度25~37°C，通气培养24~4她，得到心天冬氨酸α-脱簇酶的 发酵液； 5、 催化制备β-丙氨酸:将心天冬氨酸α-脱簇酶的发酵液置于转化罐中，每lOOmL发酵液 投放心天冬氨酸1~3g，用盐酸调抑至6.0~8.0，溫度35~45°C，敞口散气，维持转速在50~ 100 r/min，反应5~lOh。
[0007] 本发明的优点在于： 1、 本发明提供的特基拉芽抱杆菌，不同于W往的心天冬氨酸α-脱簇酶产生菌种，尚未 有该菌株产心天冬氨酸α-脱簇酶的报道，进一步拓宽了 β-丙氨酸生产的菌种渠道； 2、 本发明所提供的特基拉芽抱杆菌化nD37遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本 低，产生的心天冬氨酸α-脱簇酶酶活力高，可直接利用该菌株发酵液直接转化β-丙氨酸，工 业应用具有优势； 3、 心天冬氨酸α-脱簇酶可W自然渗透细胞外，催化合成β-丙氨酸时无需加入表面活性 剂、有机溶剂等透膜剂，避免引入外源杂质，有利于提取分离操作。
【具体实施方式】
[0008] 为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进 一步阐述。
[0009] 实施例1:特基拉芽抱杆菌菌株分类 1) 菌种特性 在保藏培养基上菌落呈乳白色、近圆形、表面干燥、不透明、有權皱、无光泽、边缘不规 则成裂叶状、易挑取;通过显微镜观察，菌体呈杆状，单个不成链，革兰氏阳性，培养4她后观 察芽抱着生在菌体侧端位置或游离存在，不膨大，楠圆形或柱形； 2) 菌株鉴定 经DNA提取、PCR扩增和测序获得的16S rDNA基因序列长度为1459 bp，在GenBa址上进 行BLAST比对，得出该菌株与特基拉芽抱杆菌Bacillus tequilensis(JX412373)碱基相似 性达99%，序列信息详见说明书核巧酸和氨基酸序列表； 3) 菌种保藏 本项发明所述的特基拉芽抱杆菌化nD37(Bacillus tequilensis F*anD37)，已于2015 年2月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号：CGMCC No. 10506，保藏单位地址:北京市中国科学院微生物研究所。
[0010] 实施例2 1) 菌株活化:挑取菌种至固体保藏培养基:酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g/L，化Cl 5 g/ L，琼脂20 g/L，pH 7.0,划线接种于恒溫培养箱30°C培养20h; 2) 液体种子制备:挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500mlS角瓶中，液 体种子培养基组分:酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g