专利名称：含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法，以及其作为生物医用材料的潜在应用。
背景技术：
基因治疗是目前用于癌症及先天性免疫系统疾病治疗的一种有效方法。该技术实施的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，进而使基因能够在细胞中获得安全、 高效、可控且稳定的表达。病毒载体因其高风险性、机体免疫反应、不能大规模生产等缺陷在临床应用方面受到限制，因此具有高转染效率的脂质体及其它阳离子聚合物日益受到重视。树枝状大分子是近年发展起来的一类具有三维规整结构、高度支化和纳米尺度的单分散性高分子材料，凭借其独特的分子结构、无免疫原性、可生物降解、易于修饰等特性在基因载体方面显示出重要应用前景。1993年，Haensler等首次尝试将聚酰胺-胺(PAMAM)用于基因转染实验(BioconjugateChemistry 1993,4:372-379)。目前， PAMAM及其衍生物已被广泛用作基因载体研究，在特定条件下，其基因转染效率及细胞毒性方面已优于聚乙烯亚胺(PEI)等常用的基因载体(Cancer Letters 2010,298 :34-49 ； MolecularPharmaceutics 2010,5:1734-1746)。这其中，将树枝状基兀与多臂分子结合制备星型阳离子聚合物成为国内外研究者关注的热点。星形阳离子聚合物由于其发散的分子结构、臂数、臂长及阳离子的分布等参数易于设计和调节，在基因传递方面显示出独特的优势。Uekama等通过化学偶联将β -⑶连接到PAMAM的外围,研究表明连接环糊精分子后的PAMAM抗血衆降解破坏的能力增强，其基因转染能力明显提高(Bioconjugate Chemistry 2003,14 :247-254)。Deng等通过点击化学方法高效合成得到结构规整的星型 β-CD-PAMAM,并将其用于基因与药物的共传递研究(Journal of Materials Chemistry 2011，21，5273-5281)。然而，PAMAM在较高代数或较高浓度下仍显示出明显的细胞毒性，且其降解产物也有较大的毒性，使其在体内实际应用中受到限制。因此，如何得到生物相容性好、结构规整可控的新型基因载体材料，便成为当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。迄今为止，通过点击化学方法合成星型环糊精接枝树枝状聚赖氨酸及其应用尚未见报道。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种含树枝状聚赖氨酸基元(PLLD)的星型阳离子聚合物；该聚合物结构规整、易于调控，分子量分布单一，生物相容性好，可生物降解，在基因传递方面显示出重要应用前景。本发明的另一目的在于提供上述含树枝状聚赖氨酸基元(PLLD)的星型阳离子聚合物的制备方法；该方法首先通过取代反应合成叠氮基团修饰的β-CD，通过连续交替的偶联、脱保护反应合成3代含炔基PLLD ;然后通过点击化学方法将叠氮基团修饰的β -CD
上述含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物的制备方法，包括以下操作步骤··(I)叠氮基团修饰的β-环糊精(β_⑶-N3)的合成a、称取三苯基膦溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后在室温条件下加入碘单质，升温至55 70°C ;再加入干燥的β-环糊精(β-ra)，N2气氛下反应24 48 小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，冰水浴条件下加入甲醇钠溶液; 所得产物在甲醇中沉淀4 7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β -环糊精
与含炔基PLLD偶联，合成得到可用作基因载体的星型阳离子聚合物。本发明的再一目的在于提供上述含树枝状聚赖氨酸基元(PLLD)的星型阳离子聚合物作为基因载体材料在制备基因药物中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物，所述星型阳离子聚合物的分子式如下
权利要求
1.一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物，其特征在于所述星型阳离子聚合物的分子式如下
2.根据权利要求I所述的一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤(I)叠氮基团修饰的β_环糊精的合成a、称取三苯基膦溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，然后在室温条件下加入碘单质，升温至55 70°C;再加入干燥的β -环糊精,N2气氛下反应24 48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无水N，N- 二甲基甲酰胺，冰水浴条件下加入甲醇钠溶液；所得产物在甲醇中沉淀 4 7次，然后真空干燥，得到七(6-碘基-6-去氧)-β -环糊精；b、将步骤a所得七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，N2气氛下升温至50 70°C后反应24 48小时；反应结束后，减压蒸馏除去无 7jC N, N- 二甲基甲酰胺，然后滴加到蒸馏水中进行沉淀，再用去离子水反复洗涤3 5次，室温条件下真空干燥，得到叠氮基团修饰的环糊精；(2)含炔基的树枝状聚赖氨酸的合成CU代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成将干燥的炔丙胺和N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N- 二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护5 20分钟后，再加入I-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯，然后在室温条件下反应12 24小时；反应结束后减压蒸馏除去无水N，N-二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温条件下加入三氟乙酸，反应2 4小时后减压蒸馏除去溶剂，所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到I代含炔基树枝状聚赖氨酸；d、2代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成将步骤c所得I代含炔基树枝状聚赖氨酸与N， N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护 5 20分钟后，加入I-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯， 室温条件下反应24 48小时；反应结束后减压蒸馏除去N，N- 二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温条件下加入三氟乙酸，反应2 4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到2代含炔基树枝状聚赖氨酸；e、3代含炔基树枝状聚赖氨酸的合成将步骤d所得2代含炔基树枝状聚赖氨酸与N， N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护 5 20分钟后，加入I-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯， 室温条件下反应24 48小时；反应结束后减压蒸馏除去N，N- 二甲基甲酰胺，所得产物用乙酸乙酯萃取，过柱分离；将分离产物溶解于二氯甲烷中，室温条件下加入三氟乙酸，反应2 4小时，然后减压蒸馏除去溶剂；所得产物用无水乙醚洗涤后真空干燥，得到3代含炔基树枝状聚赖氨酸；(3)星型阳离子聚合物的合成将步骤b所得叠氮基团修饰的β-环糊精和步骤e所得3代含炔基树枝状聚赖氨酸溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，室温条件下通入N2保护20 30分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40 50°C反应24 48小时；反应结束后，将产物置于透析袋中透析2 3 天，冷冻干燥，得到星型阳离子聚合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(I) (3)所述室温为5 35 0C ；步骤(I) (2)所述无水N，N-二甲基甲酰胺的制备方法按照以下操作步骤将氢化钙加入到N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌6 24小时，然后减压蒸懼，得到无水N，N-二甲基甲酰胺，所述氢化钙的加入量以每500mL N, N- 二甲基甲酰胺中加入I 2克计；步骤a所述干燥的β-环糊精的制备方法按照以下操作步骤将β-环糊精置于真空干燥箱中，50 80°C条件下干燥12 48小时；步骤c所述干燥的炔丙胺的制备方法按照以下操作步骤将氢化钙加入到炔丙胺中搅拌6 24小时，然后减压蒸馏，得到干燥的炔丙胺；所述氢化钙的加入量以每IOmL炔丙胺中加入O. I O. 2克计。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a所述β-环糊精、三苯基膦和碘单质的摩尔比为I : I. 2 I. 5 I. 4 1.6 ;所述无水N，N-二甲基甲酰胺以每100毫升中加入5 20克干燥的环糊精计；所述甲醇钠溶液中甲醇钠的摩尔数为干燥的 β -环糊精摩尔数的I. 5 2. O倍。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤b所述七(6-碘基-6-去氧)-β-环糊精与叠氮钠的摩尔比为I : 8 12;所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 20克七(6-碘基-6-去氧)-β -环糊精计。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤c所述炔丙胺、N，N’- 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、I-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为I : O. 9 I. O I. O I. 2 I. O 1.2 ;所述无水Ν，Ν-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 10克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300 600目的硅胶柱，洗脱液为体积比2 8 I的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分离产物；所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5 10倍。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤d所述I代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、I-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为I : 2. 2 2. 4 2. 4 2. 8 2. 4 2. 8 ;所述无水N，N-二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升中加入5 15克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计； 所述过柱分离是使用硅胶规格为300 600目的硅胶柱，洗脱液为体积比5 12 I的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分离产物； 所述三氟乙酸的使用量为分尚产物质量的5 10倍。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤e所述2代含炔基树枝状聚赖氨酸、N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸、I-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比为I : 4. 2 4. 8 4. 4 5. O 4. 4 5. O ;所述无水N，N- 二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入10 20克N，N’ - 二叔丁氧羰基-L-赖氨酸计；所述过柱分离是使用硅胶规格为300 600目的硅胶柱，洗脱液为体积比12 18 : I的三氯甲烷与甲醇的混合溶液；所述二氯甲烷的使用量以每100毫升溶解5 15克分离产物； 所述三氟乙酸的使用量为分离产物质量的5 10倍；所述3代含炔基树枝状聚赖氨酸的分子式如下
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述叠氮基团修饰的β_环糊精、含炔基树枝状聚赖氨酸、硫酸铜和抗坏血酸钠的摩尔比为I : 8 10 : 4 5 : 10 15 ;所述无水N，N- 二甲基甲酰胺的使用量以每100毫升加入5 10克叠氮基团修饰的 β -环糊精计；所述透析袋的截留分子量为1000 3000。
10.根据权利要求I所述的星型阳离子聚合物作为基因载体材料在制备基因药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物及其制备方法和应用。该方法包括如下操作步骤先通过取代反应在β-环糊精C6位上引入叠氮基团，同时利用炔丙胺与N，N’-二叔丁氧羰基-L-赖氨酸之间的偶联反应以及重复多步的缩合、脱保护反应合成含炔基的树枝状聚赖氨酸，然后将上述两产物通过点击化学方法偶联得到含树枝状聚赖氨酸基元的星型阳离子聚合物β-CD-PLLD。所得聚合物具有结构规整、易于调控、分子量分布单一、生物相容性好、可生物降解等优点，有望在基因治疗领域获得广泛应用。
文档编号C08B37/16GK102604114SQ201210005079
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者张黎明, 曹凯迪, 陈弟虎, 马栋 申请人:中山大学