靶向组蛋白乙酰化的制作方法
【专利说明】靶向组蛋白乙酰化 发明领域
[0001] 本公开总体上涉及用于乙酰化靶向染色体位置处的组蛋白蛋白质的方式。
[0002] 发明背景
[0003] 已明确确定组蛋白乙酰化与真核细胞中的转录活性相关。已知乙酰化的核心组蛋 白优先地与转录活性染色质相关。乙酰化在组蛋白蛋白质的氨基末端尾部上的赖氨酸残基 处发生，从而中和组蛋白尾部的正电荷并且减少其对DNA的亲和力。因此，组蛋白乙酰化改 变核小体构象，从而增加转录调控蛋白到染色质模板的可接近性。
[0004] 尽管在鉴别大量具有组蛋白乙酰转移酶或组蛋白脱乙酰酶活性的蛋白质和解释 其在调控基因表达中的作用方面有所进展，但目前尚未有修饰特定位置处的组蛋白乙酰化 的方式。虽然丁酸钠用于抑制组蛋白脱乙酰酶活性，从而间接增加组蛋白乙酰化，但这种组 蛋白乙酰化的方法是全局的且非特异性的。对实质上所有位置处的乙酰化进行修饰。因此 需要靶向组蛋白乙酰化。具体地说，需要将组蛋白乙酰化酶(acetylase)活性靶向特定染色 体序列的方式，以使得与目标染色体序列相关的组蛋白蛋白质可被乙酰化。
[0005] 发明概述
[0006] 因此本公开提供用于乙酰化靶向染色体位置处的组蛋白蛋白质的方式。本公开的 一方面提供包含DNA结合结构域和至少一个p300组蛋白乙酰转移酶(HAT)结构域的融合蛋 白。在一个实施方案中，DNA结合结构域是转录激活因子样效应子DNA结合结构域。在另一个 实施方案中，DNA结合结构域是锌指DNA结合结构域。在一个实施方案中，锌指DNA结合结构 域包含约五至约七个锌指。在另一个实施方案中，HAT结构域源自哺乳动物p300蛋白质。在 某些实施方案中，融合蛋白进一步包含至少一个核定位信号、至少一个细胞穿透结构域、至 少一个标记结构域或其组合。在一个实施方案中，融合蛋白的DNA结合结构域是包含约五至 约七个锌指的工程化的锌指DNA结合结构域，并且融合蛋白的HAT结构域源自人p300蛋白 质。在一个实施方案中，融合蛋白的工程化的锌指DNA结合结构域结合位于编码0ct4、Sox2 或PEDF的染色体序列的转录起始位点的上游或下游的特定序列。
[0007] 本公开还提供编码本文所公开的融合蛋白的分离的核酸。
[0008] 本公开的另一方面提供一种用于乙酰化细胞中的靶向染色体位置处的至少一种 组蛋白蛋白质的方法。所述方法包括使所述细胞与融合蛋白或编码所述融合蛋白的核酸相 接触，其中所述融合蛋白包含DNA结合结构域和至少一个p300组蛋白乙酰转移酶(HAT)结构 域。在所述DNA结合结构域与所述靶向染色体位置处的序列结合之后，p300 HAT结构域乙酰 化所述靶向染色体位置处的至少一种组蛋白蛋白质。在一个实施方案中，融合蛋白乙酰化 组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3和/或组蛋白H4。在具体示例性实施方案中，融合蛋白乙酰 化组蛋白H3的赖氨酸18和/或组蛋白H3的赖氨酸27。在另一个实施方案中，位于靶向染色体 序列附近的基因具有增加的转录水平。在各个实施方案中，所述方法中使用的细胞是人细 胞、哺乳动物细胞、非哺乳类脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、干细胞、胚胎或单细胞真核生 物。在一个示例性实施方案中，细胞是人细胞。在另一个实施方案中，融合蛋白的DNA结合结 构域是包含约五至约七个锌指的工程化的锌指DNA结合结构域，并且融合蛋白的HAT结构域 源自人P300蛋白质。在另一个实施方案中，融合蛋白的工程化的锌指DNA结合结构域结合位 于编码Oct4、Sox2或PEDF的染色体序列的转录起始位点的上游或下游的特定序列。
[0009] 本公开的其它方面和重复在以下更详细得描述。
[0010] 附图简述
[0011] 图1示出HEK293细胞中通过融合蛋白ZF(0ct4+181)-p300的靶向组蛋白乙酰化。绘 出在所指示的处理条件下靶位点和靶位点+200bp处的H3K18和H3K27处的乙酰化的倍数增 加。锌指DNA结合结构域ZF(0ct4+181)革E1向0CT4的转录起始位点下游+181bp处的序列。用丁 酸钠 (Nabut)(组蛋白脱乙酰酶抑制剂)处理的细胞用作阳性对照。用p300 HAT结构域(无 ZF 结构域)或GFP转染的细胞用作阴性对照。
[0012] 图2描绘通过融合蛋白ZF(0ct4+181)-p300激活HEK293细胞中的0ct4表达。绘出在 所指示的处理条件下0CT4表达的倍数增加。各条表示重复三次的RT-PCR的0CT4/亲环蛋白A 比率的平均值（土 SD)。表达ZF-p65融合蛋白的细胞用作阳性对照（p65是NF-κΒ转录因子的 组分）。仅表达p65、p300或GFP的细胞用作阴性对照。表达融合蛋白ZF(0ct4+181)-p300的细 胞与阴性对照细胞相比显示0CT4表达的显著激活（>25倍）。
[0013] 图3示出通过融合蛋白ZF (PEDF) -P300激活HEK293细胞中的PEDF表达。绘出在所指 示的处理条件下PEDF表达的倍数增加。各条表示重复三次的RT-PCR的PEDF/亲环蛋白A比率 的平均值（土SD) JNA结合结构域ZF6961靶向PEDF基因。表达ZF6961-p65融合蛋白的细胞用 作阳性对照。仅表达p65、p300或GFP的细胞用作阴性对照。表达融合蛋白ZF6961-ρ300的细 胞具有增加的PEDF表达(P<0.001)。
[0014] 图4示出融合蛋白ZF (PEDF) -GCN5不激活HEK293细胞中的PEDF表达。绘出在所指示 的处理条件下PEDF表达的倍数增加。各条表示重复三次的RT-PCR的PEDF/亲环蛋白A比率的 平均值（土 SD) JF DNA结合结构域靶向PEDF基因。表达ZF-p65融合蛋白的细胞用作阳性对 照。仅表达P65的细胞用作阴性对照。表达融合蛋白ZF-GCN5的细胞未表现出PEDF表达的增 加。
[0015] 图5呈现在存在一系列ZF(0ct4)-p300融合蛋白情况下的0CT4表达。使每个融合蛋 白革巴向位于0CT4的转录起始位点(TSS)的上游约-2.5kb至下游约1.5kb的特定序列。
[0016] 图6示出ZF(0ct4)-p300融合蛋白激活多种细胞中的0CT4表达。绘出在对照条件下 或在存在靶向下游序列的两种不同的融合蛋白的情况下HEK293(6A)细胞和K562(6B)细胞 中的0CT4表达的倍数增加。
[0017] 图7示出HEK293(7A)细胞和K562(7B)细胞中通过ZF(0ct4)-p300融合蛋白的靶向 组蛋白乙酰化。绘出在不存在(对照）或存在ZF(0ct4+286)-p300或ZF(0ct4+420)-p300融合 蛋白的情况下在所指示的位置处H3K27处的乙酰化的倍数增加。对照位置是S0X2TSS的下游 +200 〇
[0018] 图8呈现在存在一系列ZF(Sox2)-p300融合蛋白情况下的S0X2表达。使每个融合蛋 白靶向位于S0X2的TSS的上游-0.5kb至下游约1.5kb的特定序列。
[0019] 图9示出ZF(Sox2)-p300融合蛋白激活多种细胞中的S0X2表达。绘出在对照条件下 或在存在靶向下游序列的两种不同的ZF(Sox2)-p300融合蛋白的情况下HEK293(9A)细胞和 K562 (9B)细胞中的S0X2表达的倍数增加。
[0020] 发明详述
[0021] 本公开提供用于乙酰化特定染色体位置处的组蛋白和其它蛋白质的方式。具体地 说，本公开提供包含DNA结合结构域和表现出组蛋白乙酰化酶活性的至少一个组蛋白乙酰 转移酶(HAT)结构域的融合蛋白。DNA结合结构域能够识别并且结合目标染色体序列中的特 定序列，并且HAT结构域能够乙酰化组蛋白或其它染色体蛋白的赖氨酸残基。因此，本文所 公开的融合蛋白可用于乙酰化与由DNA结合结构域靶向的特定序列相关的蛋白质。靶向蛋 白质乙酰化可用于调控目标染色体序列处的染色体蛋白乙酰化的转录活性或其它作用。
[0022] (I)融合蛋白
[0023] 本公开的一方面提供包含DNA结合结构域和至少一个组蛋白乙酰转移酶(HAT)结 构域的融合蛋白。因为DNA结合结构域识别并且结合特定DNA序列，所以它使融合蛋白靶向 细胞染色体中的特定序列。在与特定序列结合之后，融合蛋白的HAT结构域乙酰化细胞染色 体中与特定序列相关的至少一种蛋白质。
[0024] (a)DNA结合结构域
[0025]本文所公开的融合蛋白包含DNA结合结构域，所述DNA结合结构域含有识别并且结 合DNA的特定序列的至少一个基序。DNA结合结构域可结合双链DNA和/或单链DNA。一般来 说，DNA结合结构域识别并且结合细胞染色体的双链DNA中的特定序列。
[0026]多种DNA结合结构域适合于包含在融合蛋白中。适合的DNA结合结构域的非限制性 实例包括AT钩结构域、碱性亮氨酸拉链结构域、β-折叠结构域、B3结构域、螺旋-环-螺旋结 构域、螺旋-转角-螺旋结构域、同源结构域(homeodomain)、HMG盒结构域、免疫球蛋白折叠 结构域、亮氨酸拉链结构域、类固醇受体结构域、转录激活因子样效应子(TAL)效应子结构 域、翼状螺旋结构域、翼状螺旋转角螺旋结构域以及锌指结构域。DNA结合结构域可源自天 然存在的蛋白质。例如，DNA结合结构域可源自天然存在的转录因子或DNA结合蛋白。或者， DNA结合结构域可以是工程化的或人工多肽或蛋白质。
[0027] (i)锌指DNA结合结构域
[0028]在示例性实施方案中，DNA结合结构域是锌指DNA结合结构域。锌指DNA结合结构域 包含两个、三个或更多个锌指基序（即，"锌指"）的串联重复。每个锌指与锌(或另一种离子） 配位并且与约三个连续核苷酸残基相互作用。多种锌指是已知的，并且可通过这些锌配位 残基(例如，Cys2Hi S2、Cys4和Cys6)的类型和顺序进行分类。
[0029]锌指DNA结合结构域可源自天然存在的蛋白质。或者，锌指DNA结合结构域可被工 程化以识别并且结合任何所选的核酸序列。例如，工程化的CyS2His2锌指的阵列是本领域熟 知的。参见，例如Beer li等人（2002)Nat.Biotechnol .20:135-141 ;Pabo等人（2001) Ann .Rev .Biochem. 70:313-340; Isalan等人（2001 )Nat .Biotechnol · 19:656-660; Segal等 人（2001)Curr.0pin.Biotechnol · 12:632-637;Choo 等人（2000) Curr .Opin. Struct .Biol .10:411-416; Zhang 等人（2000) J. Biol. Chem. 275(43) :33850-33860 ;Doyon等人（2008 )Nat. Biotechnol .26:702-708;以及Sant