含有6-n-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断系统性红斑狼疮试剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了含有6-N-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断或筛查系统性红斑狼疮试剂或试剂盒中的应用。本发明的实验证明人IgM可以识别6-N-甲基赖氨酸，人IgM可以结合含6-N-甲基赖氨酸残基的任意多肽或蛋白质，6-N-甲基赖氨酸对识别6-N-甲基赖氨酸的IgM具有抑制作用，但是非甲基化修饰的赖氨酸却无抑制作用，大多数健康人存在较高水平的此种IgM抗体，而在系统性红斑狼疮患者中此种IgM抗体水平明显降低。含有6-N-甲基赖氨酸残基的抗原可用于制备辅助诊断或筛查系统性红斑狼疮试剂或试剂盒。
【专利说明】含有6-N-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断系统性红斑狼疮试剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有6-N-甲基赖氨酸(又名Ne-甲基-L-赖氨酸，N6-甲基-L-赖氨酸)残基的多肽或蛋白质抗原的新用途，特别涉及含有6-N-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断或筛查系统性红斑狼疮(SLE)试剂或试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]蛋白质翻译后修饰如糖基化、磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化、SUMO化等等是重要的生命现象，影响着基因的表达调控、细胞的活化与抑制、蛋白质的结构和功能各个方面。和本发明相关的是赖氨酸的甲基化修饰，该修饰主要发生在细胞核的组蛋白中，少量的其他一些蛋白如p53，NFkB, STAT3等也会发生赖氨酸甲基化修饰。赖氨酸甲基化修饰有三种形式，即其侧链ε氨基的一、二、三甲基化，这些修饰与基因的沉默和活化密切相关，是近些年来表观遗传学领域的研究重点。各种组蛋白，即连接组蛋白(Η1)，形成核小体的核心组蛋白(Η2Α、Η2Β、Η3和Η4)以及一些组蛋白变体都可以发生赖氨酸甲基化修饰，其中组蛋白Η3的第4、9、27、36和79位，Η4的第20位赖氨酸甲基化修饰最为常见。
[0003]尽管蛋白质翻译后修饰具有重要的作用，但是各种修饰也带来蛋白质分子结构的变化，可为自身抗体提供新的表位。这些新表位可被T细胞或者B细胞的抗原受体识别,进而产生自身反应。不过迄今为止蛋白质翻译后修饰诱导产生自身抗体的研究报道非常少。Plaue等发现泛素化的组蛋白Η2Α和Η2Β是系统性红斑狼疮(SLE)的自身抗原。van derVlag等报道凋亡相关的组蛋白修饰产生优势抗原H2BK12ac、H3K27me3、H4K8ac3、H4K12ac3和H4K16ac3，可被SLE患者和狼疮鼠的自身抗体识别。在一例患有盘状红斑狼疮和慢性淋巴细胞白血病的患者中发现了针对H3K9me3S10ph的抗体。至于蛋白质翻译后修饰在正常人群中是否能产生抗体以及所产生抗体的性质几乎没有报道。
[0004]免疫球蛋白M (IgM)是重要的免疫分子，参与了 B细胞的发育、体液免疫反应和免疫调节各种过程。除了参与常规的免疫防御，IgM还有一个重要的功能，即阻止机体产生病理性的自身免疫反应。动物实验表明缺乏分泌型IgM但是可以分泌其他类型抗体的小鼠将自发产生IgG抗DNA抗体，且肾脏出现IgG和补体沉积。用IgM自身抗体处理的狼疮鼠产生蛋白尿的时间较晚，且肾脏受累较轻，生存期明显延长。仅含高水平的自身反应性IgMdM是缺乏自身反应性的IgG的狼疮鼠肾小球的病理状况可得到明显改善，小鼠生存期明显延长。在人类，已知IgM抗dsDNA抗体水平与肾小球肾病呈负相关。具有高水平的IgM多反应性抗体和IgM抗磷脂酰胆碱抗体的SLE患者症状往往较轻。IgM抗心磷脂抗体和抗dsDNA抗体在肾脏未损伤的患者中水平较高。由此可见，健康人表达的自身反应性IgM不仅不伤害反而有益于机体。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供含有6-N-甲基赖氨酸残基的抗原的新用途。[0006]本发明所提供的新用途是含有6-N-甲基赖氨酸残基的抗原在辅助诊断或筛查SLE试剂或试剂盒中的应用。
[0007]其中，所述的抗原可为含有6-N-甲基赖氨酸残基的多肽或蛋白质。当所述抗原为含有6-N-甲基赖氨酸残基的多肽时，该多肽可交联到载体蛋白上。
[0008]上述应用中，所述抗原为含有6-N-甲基赖氨酸残基的多肽或蛋白质或所述多肽与载体蛋白结合形成的交联物。
[0009]上述应用中，所述的含有6-N-甲基赖氨酸的多肽包括但是不限于表1中SEQ IDN0.1-4中任一所示的多肽。
[0010]在本发明的实施方式叙述中，含有6-N-甲基赖氨酸残基的多肽为SEQ ID N0.1-4中任一所不的多肽。
[0011]上述应用中，用于交联的所述载体蛋白可为不与人IgM特异结合的蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)等。
[0012]上述应用中，所述辅助诊断或筛查SLE试剂或试剂盒可为酶联免疫试剂或酶联免疫试剂盒。
[0013]SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽也属于本发明的保护范围。 [0014]其中，SEQ ID N0.1是由14个氨基酸残基组成的多肽，名称为GGKme，其第3位为6-N-甲基赖氨酸残基。SEQ ID N0.2是由20个氨基酸残基组成的多肽，名称为^3^1(91^，其第9位为6-N-甲基赖氨酸残基。SEQ ID N0.3是由20个氨基酸残基组成多肽，名称为!13^1(91^，其第9位为6-N-甲基赖氨酸残基。和!13^1(91^的氨基酸组成一致但序列不同。SEQ ID N0.4是由20个氨基酸残基组成多肽，名称为其第4位为6-N-甲基赖氨酸残基。
[0015]本发明还提供了辅助诊断或筛查SLE试剂或试剂盒。
[0016]本发明所提供的辅助诊断或筛查SLE试剂或试剂盒为含有6-N-甲基赖氨酸残基的的多肽或蛋白质以及所述多肽与载体蛋白结合形成的交联物，包括SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽与载体蛋白结合形成的交联物。
[0017]其中，所述载体蛋白为不与人IgM特异结合的BSA，交联物用多肽-BSA表示。
[0018]在本发明工作中比较了健康人和SLE患者的IgM针对组蛋白H3氨基末端1_19位多肽的反应。发现大部分健康人存在针对第4位和第9位的赖氨酸一甲基化多肽
HS^^me)的IgM自身抗体，进一步研究显示其表位实际上是6-N-甲基赖氨酸残基。本发明的实验证明人IgM可以识别6-N-甲基赖氨酸,人IgM可以结合含6-N-甲基赖氨酸残基的任意多肽。6-N-甲基赖氨酸对识别含6-N-甲基赖氨酸残基表位的IgM具有抑制作用，但是非甲基化修饰的赖氨酸却无抑制作用。此种与含6-N-甲基赖氨酸残基结合的IgM不与二甲基化或三甲基化赖氨酸反应。大多数健康人存在较高水平的此种IgM抗体，而在SLE患者中此种IgM抗体水平明显降低。因此,含有6-N-甲基赖氨酸的抗原可用于制备辅助诊断或筛查SLE试剂或试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为ELISA方法检测儿童和成人血清样本中IgM针对HSw9Mme和的反应。[0020]图中，Η3η9Κ4ι?θ表示包被的是HS^^me-BSA, Η3η9Κ9ι?θ表示包被的是!KuKgme-BSA。pHC表示儿童健康对照血清(n=62), pSLE表示儿童SLE患者血清(n=62),aHC表示成人健康对照血清(n=75)，aSLE表示成人SLE患者血清(n=75)。各组中的横线表示均值。健康对照与SLE患者间的P值以Student’ s t检验计算。
[0021]图2为ELISA检测抗IgM抗体针对各种多肽的交叉反应。
[0022]图中，表示包被的是ro^-BSA，HSw9K^e表示包被的是HS^19Mme-BSA,H31_19K4me2 表示包被的是 HSuMn^-BSA，HSw9K^eS 表示包被的是 ro^MmeS-BSA，HS1^19Kgme 表示包被的是 HS^Kgme-BSA，H31_19K9me2 表示包被的是 HS^Kgn^-BSA，Η3η9Κ9ι?θ3 表示包被的是 H3H9K9me3-BSA，H3H9K9ac 表示包被的是 H3h9K9_BSA，sH3h9 表示包被的是sro^g-BSA，SHS1^19Kgme表示包被的是sHS^Kgme-BSA。
[0023]图3为ELISA检测用6_N_甲基赖氨酸或赖氨酸竞争IgM针对!^,1(911^和SHS1^19KQme 的反应。
[0024]图中，HS1^19Kgme表示包被的是HS^Kgrne-BSA，SHS1^19Kgme表示包被的是sro^Kgme-BSA。Kme表示的是用6-N-甲基赖氨酸抑制IgM抗体的反应，K表示的是用未修饰的赖氨酸抑制IgM抗体的反应。横坐标表示的是不同的赖氨酸或6-N-甲基赖氨酸的浓度。
[0025]图4为ELISA检测比较IgM针对叫_19、HS1^19Kgme和GGKme多肽的反应。
[0026]图中，表示包被的是ro^-BSA，HSw9Kgme表示包被的是HS^19Kgme-BSA,GGKme表示包被的是GGKme_BSA。横坐标表示的是珠纯化的IgM不同的稀释度。
[0027]图5为ELISA检测血清样本中IgM针对!13^1(911^和GGKme的反应。
[0028]图5中A包被的是HSp19Kgme-BSA,图5中B包被的是GGKme-BSA。aHC表示成人健康对照血清(n=25),aSLE表示成人SLE患者血清(n=25)。各组中的横线表示均值。健康对照与SLE患者间的P值以Student’ s t检验计算。
【具体实施方式】
[0029]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的所有数据均用GraphPad Prism软件(Version 5.01)分析。P值以Student’s t检验计算，P〈0.05时被认为数据间具有显著性差异。
[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031]实施例1.用 HSH9Mme-BSA 和 HSH9Kgme-BSA 辅助诊断 SLE
[0032]1.多肽及其多肽-BSA交联物的制备
[0033]该步骤制备了含有6-N-甲基赖氨酸残基的多肽和。
与氨基酸序列相同但是赖氨酸甲基化修饰位置不同，HSh19Mme是第4位赖氨酸甲基化修饰，HS 1^19Kgme是第9位赖氨酸甲基化修饰。
[0034]上述多肽由北京中科亚光公司米用固相多肽合成法合成，纯度3 90%。其序列如表I所示。每个多肽末端均包含一个半胱氨酸残基，并通过这个半胱氨酸残基与BSA交联形成交联物，即HSh19Mme-BSA和ro^Kgme-BSA。交联方法如下:2mg BSA溶于反应液(0.1MNaH2PO4, NaCl 0.15M, pH 7.2)，终浓度为 8.3mg BSA/ml。0.5mg Sulfo-SMCC (货号 22322，美国Pierce公司)加入BSA溶液，室温放置I小时。加到PDlO柱(货号17-0851-01，美国GE公司)上，用含5mM EDTA的反应液洗脱，接收BSA组分。将活化的BSA加到2mg多肽中，室温放置3个小时。最后透析至PBS中，-80°C保存。
[0035]表1.多肽序列
[0036]
【权利要求】
1.含有6-N-甲基赖氨酸残基的抗原在制备辅助诊断或筛查系统性红斑狼疮试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述抗原为含有6-N-甲基赖氨酸残基的多肽或蛋白质或所述多肽与载体蛋白的交联物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述含有6-N-甲基赖氨酸残基的多肽为SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于:所述载体蛋白为不与人IgM特异结合的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于:所述辅助诊断或筛查系统性红斑狼疮试剂或试剂盒为酶联免疫试剂或酶联免疫试剂盒。
6.SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽。
7.辅助诊断或筛查系统性红斑狼疮试剂或试剂盒，其特征在于:所述试剂或试剂盒含有SEQ ID N0.1-4中任一所示的多肽或所述多肽与载体蛋白结合形成的交联物。
8.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于:所述载体蛋白为不与人IgM特异结合的蛋白质。
【文档编号】G01N33/68GK104007266SQ201310061233
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月27日 优先权日:2013年2月27日
【发明者】张伟, 郭莎, 刘莹, 马友楠, 赵青, 邵跃虎, 吴凤岐, 高瑞通 申请人:中国医学科学院基础医学研究所, 北京爱博生生物技术有限公司, 首都儿科研究所