专利名称：人蛋白赖氨酸甲基转移酶set9融合蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体应用DNA重组技术构建了人蛋白赖氨酸甲基化转移酶(protein lysine meth yltransferases, PLMTs 或 PKMTs) SET9 融合蛋白的高效原核表达系统，建立了通过基因工程大肠杆菌发酵制备重组人SET9融合蛋白的方法。
背景技术：
SET9又称组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶、组蛋白H3-K4甲基转移酶，是一种蛋白修饰酶，能将S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)所供甲基转移至革巴蛋白赖氨酸残基上使其甲基化，引起蛋白质结构和功能改变并产生相关生物效应。SET9全长为366个氨基酸，C端含保守的SET结构域，分子量大约为50KD，其表达基因位于第四号染色体4q28。SET9能使组蛋白H3第4位赖氨酸(lysine 4 of histone 3，H3K4)单甲基化，在调控染色质结构和基因表达中起着至关重要的作用。此外，更重要的是SET9能使p53与TAF10等一些转录因子、肿瘤抑制因子、膜相关受体等非组蛋白单甲基化，调节蛋白稳定性与转录活性(表I)。SET9对非组蛋白赖氨酸的甲基化作用会产生复杂的生物学效应，如甲基化P53的K372位点可增加p53稳定性及其对靶基因的活化作用；甲基化衍生因子(eIongation factor，E2FI)的K185位点可抑制该蛋白的乙酰化和磷酸化，并激活蛋白泛素化，抑制凋亡；还可使成视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRb)、雌激素受体a (estrogen receptor a，ER a )等蛋白甲基化，影响它们的生物学效应。研究表明乳腺癌细胞中SET9下调会导致雌激素(ER)在其靶基因部位的募集反应受损，从而减弱ER驱动的转录反应。可见SET9介导的非组蛋白赖氨酸甲基化作用异常与肿瘤或其他疾病发生机制有关。因此，SET9是一种非常有前景的生物化学蛋白修饰酶，与染色体结构维持、细胞周期及凋亡调控等有关。SET9及其底物可作为肿瘤等疾病诊疗中的标志物或靶点，促进有关试剂或新药的研发。目前提纯SET9蛋白主要通过组氨酸(His)标签或GST标签进行融合蛋白表达与纯化。组氨酸(His)标签的融合蛋白表达存在不可溶性问题，纯化时需要变性，因此，只有经过复性过程才能获得活性蛋白，从而增加了提取活性SET9蛋白的困难。一般经GST标签提纯的蛋白都用于抗体制备、蛋白检测、ELISA等试验。随着科学研究的深入，对具有蛋白赖氨酸甲基转移酶活性的SET9蛋白的需求会越发迫切。表I现有报道关于SET9单甲基化的非组蛋白底物与涉及的生物学功能
权利要求
1.人蛋白赖氨酸甲基转移酶SET9融合蛋白的制备方法，其特征在于将SET9基因片段连接至含可编码谷胱甘肽S-转移酶读码框架的载体质粒，再转化宿主菌，宿主菌经诱导表达后通过Glutahione Agarose吸附柱纯化。
2.人蛋白赖氨酸甲基转移酶SET9融合蛋白的制备方法，其特征在于步骤为 a.以pCMV-SET9为模板，PCR扩增含SET结构域的SET9基因片段上游引物SET9_f 序列为5’ -ACCGAATTCCATGGATAGCGACGAC-3’，下游引物 SET9_r 序列为5’ -CTCCTCGAGTCATTACTTTTGCTGGGTGGCCTG-3’，反应体系为5u L 10 X PCRBuffer, 0. 25 u L 2. 5u/u LPfu,2u LIOmM dNTP, 0. 5 u L IOuM SET9-f, 0. 5 u LlO u MSET9-r, I u L pCMV-SET9, dH20 补足体系至.50 u L ;反应条件为94°C变性13分钟，进入循环94°C变性I分钟，60°C退火I分钟，72°C延伸2分钟，共35次循环，末次循环后72°C延伸10分钟，得SET9-PCR产物如SEQ ID No. I所示； b.将SET9-PCR产物连接至pGEX-6P-3上将原核表达载体pGEX_6P_3转入大肠杆 菌MC1061菌株，挑取单个菌落培养，用质粒提取试剂盒大量提取质粒DNA，溶解于50 ii L的去离子水中，-20°C贮存；用EcoR I和Xho I将SET9-PCR产物及pGEX_6P_3表达载体分别做双酶切，然后进行连接得PGEX-SET9重组质粒；其中，酶切反应体系4iiL IOxBuffer Y+/TANG0 , 2u L 20U/ u LXhoI，2u L IOU/ u LEcoRI，30 u LSET9-PCR 产物或 12u LPGEX-6P-3，dH20补足体系至40 ii L ;酶切反应条件37 °C，3小时；PCR产物纯化试剂盒回收；用碱性磷酸酶处理上述酶切产物5uL 10XCIPBuffer，37ii LSET9-PCR酶切产物或 37iiL pGEX-6P-3 酶切产物，I ii L AlkalinePhosphatase, dH20 补足体系至 100 y L ;孵育反应条件37°C，2小时；再75°C，10分钟；连接反应体系2iiL 10XT4DNA LigaseBuffer, I u L900ng/ u L碱性磷酸酶处理的pGEX_6P_3，I u L300ng/ u L碱性磷酸酶处理的SET9-PCR, 14 u LdH2O, 2u L 400u/ u LT4DNA Ligase,前四项加入 eppendof 管后 65°C 孵育 3分钟，然后立即置于冰上，加入连接酶，连接反应条件4°C，过夜；连接产物pGEX-SET9重组质粒转化至MC1061中，挑取克隆，提质粒进行酶切鉴定，再将pGEX-SET9、pGEX-6P-3进行质粒大提； c.用pGEX-SET9重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板，37°C恒温培养过夜；挑取单一GST-SET9融合蛋白表达阳性菌落接种在IOmL含氨苄青霉素100mg/L抗性的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，次日按I :60的体积比例转接于400mL含氨苄青霉素100mg/L抗性的培养基中，于37°C剧烈振荡培养至.0D600nm约为0. 5 0. 8，加入IPTG至终浓度为ImM以诱导GST-SET9表达，继续培养5. Oh,离心收取细胞，置_70°C冷冻过夜，次日用5mLPBST重新悬浮细胞，于4°C温度下超声破碎细菌，再利用Glutathione Agarose吸附柱提纯得人蛋白赖氨酸甲基转移 酶SET9融合蛋白。
全文摘要
人蛋白赖氨酸甲基转移酶SET9融合蛋白的制备方法，将SET9基因片段连接至含可编码谷胱甘肽S-转移酶读码框架的载体质粒，再转化宿主菌，宿主菌经诱导表达后通过GlutathioneAgarose吸附柱纯化。利用大肠杆菌BL21(DE3)表达菌的T7RNA聚合酶基因可受IPTG诱导表达、该菌没有膜结合性蛋白分解酶活性则可抑制表达的融合蛋白质分解等优点，本发明将重组载体pGEX-SET9转入BL21(DE3)表达菌，成功地构建了GST-SET9融合蛋白的原核表达系统，并提纯了高活性的融合蛋白。可用于非组蛋白甲基化效应、SET9抗体开发等实验室研究。
文档编号C12N15/70GK102719456SQ20121019250
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者余卫平 申请人:东南大学