一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌，属于基因工程 领域。
【背景技术】
[0002] 谷氨酸脱駿酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC4. I. 1. 15)在生物体内广 泛存在，其催化谷氨酸生成y -氨基丁酸（y -aminobutyric acid，GABA)，而GABA是哺乳 动物体内一种重要的抑制性神经递质。在对自身免疫性疾病以及糖尿病研究中，特别是I 型糖尿病，GAD、GABA 以及谷氨酸脱羧酶抗体（glutamic acid decarboxylase antibody， GAD-Ab)，等的水平作为病理分析、疾病诊断、免疫治疗的重要参数，历来备受研究者关注。
[0003] GAD存在两种异构体形式：分子量为65, 000的GAD65和分子量为67, 000的GAD 67， 两者分别由不同染色体上的非等位基因编码。GAD65基因位于第10染色体短臂（p) 11. 23区 段，GAD67基因位于第2染色体长臂（q)31区段。它们的氨基酸同源性占60-70%，主要区别 在1-95和325-355位氨基酸序列。70-90%的I型糖尿病患者血清中可检测出GAD 65抗体， 15-25%的I型糖尿病患者有GAD67抗体，说明I型糖尿病患者体内GAD自身抗体主要是针 对GADjJt原的。
[0004] 随着人们生活方式及饮食结构的改变，糖尿病在我国有着越来越高的发病率。减 少糖尿病并发症成为一个棘手的问题。目前越来越多的人把目光转移到了利用基因工程手 段获取GAD抗原。此种方法不仅原料消耗小，成本低，纯度高，且克服了由于6六0 65蛋白在胰 腺组织中含量极低，制备困难，以及人源组织不易获得等缺点，因而具有广泛的临床应用前 景。
[0005] 目前，虽然已有少数报道将哺乳动物来源的GAD65成功表达于微生物中，但存在表 达量低、质粒表达量不稳定、酶活低、形成包涵体、胞内分泌等问题。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供一种重组表达人谷氨酸脱羧酶（GAD)的毕赤酵母 基因工程菌，实现了人谷氨酸脱羧酶的活性表达、高效表达。本发明采用毕赤酵母为宿主和 基因组整合性质粒PPICZa为表达载体，成功的把人源GAD 65S因重组到毕赤酵母基因组上 且形成产物分泌到胞外，这不仅克服了质粒表达的不稳定性、表达量低等问题，而且也简化 了形成包涵体或胞内分泌所带来的工作量。所筛选得到重组菌株，经甲醇诱导能过量表达 GAD65并分泌到胞外，其具有免疫原性。
[0007] 本发明提供了一种高效活性表达人的谷氨酸脱羧酶的方法，是构建以毕赤酵母为 宿主整合表达核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述的谷氨酸脱羧酶的重组菌，然后以该重组菌 发酵生产人的谷氨酸脱羧酶。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SEQ ID NO: 1所述的谷氨酸脱羧酶基 因〇六065连接到表达载体pPICZ α上，得到重组质粒pPICZ a -hGAD 65，然后电转入毕赤酵母 X-33菌株，使GAD65*编码序列插入酵母基因组中，筛选得到重组菌。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将重组菌活化后接种于BMGY培养基培 养20h，然后静置弃上清，用BMMY培养基重悬菌体并加入甲醇诱导培养。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵具体是：将重组菌单菌落接种于生长培养 基BMGY中，30°C，200r/min培养20h ;将菌液，室温静置lh，弃掉上清液，用30mL BMMY培养 基重新悬浮菌体，加入100%甲醇至终浓度为1% (v/v)，30°C，200r/min培养，每隔24h补 加100%甲醇至终浓度为1%(￥八）进行诱导；诱导4811后，1200(^/111丨11离心5111丨11，保留上 清液，即为含有谷氨酸脱羧酶的液体。
[0011] 本发明还提供一种毕赤酵母基因工程菌，所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主表达 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述的谷氨酸脱羧酶。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主是毕赤酵母X-33菌株。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建：将SEQ ID NO: 1所述的谷氨 酸脱羧酶基因6六065连接到表达载体pPICZ α上，得到重组质粒pPICZ a -hGAD 65，然后电转 入毕赤酵母X-33菌株，使GAD65*编码序列插入酵母基因组中，筛选得到重组菌。
[0014] 本发明还要求保护所述基因工程菌生产的谷氨酸脱羧酶，以及得到的谷氨酸脱羧 酶在制备药物方面的应用。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明实现了人的谷氨酸脱羧酶的活性表达、高效表达，本发明使用毕赤酵母作 为宿主，得到的基因工程菌经摇瓶发酵、Tricine-SDS-PAGE和Western Blot鉴定，证实人 源谷氨酸脱羧酶（GAD65)实现了诱导表达。最后，通过对发酵上清液进行分离纯化得到融合 蛋白，经过蛋白浓度测定，融合蛋白hGAD 65*度达到2. 36g/L。
【附图说明】
[0017] 图1 :表达载体菌体PCR验证；1为空载体PCR产物；2为含有pPICZ a -hAGAD6^ 粒的DH5 α重组子PCR产物；
[0018] 图2 :表达载体整合酵母基因组验证；
[0019] 图3 :重组毕赤酵母表达产物的检测；
[0020] 图4 :Western Blot鉴定融合蛋白hGAD65(l :GAD+病人血清为一抗；2 :GAD65单克 隆抗体一抗）。
【具体实施方式】
[0021] 低盐LB培养基（g/L):胰蛋白胨10g，NaC15g，酵母粉5g ;
[0022] ΥΗ)培养基（g/L):胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g ;
[0023] YPDS培养基（g/L):胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，山梨醇182g ;
[0024] BMGY 培养基（g/L):酵母粉 10g，胰蛋白胨 20g，甘油 20g，（NH4)2SO4IOg, YNB3. 4g， ImoL/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液（ρΗ6· 0) 100mL，生物素 4 X 10 5g ;
[0025] BMMY 培养基（g/L):酵母粉 10g，胰蛋白胨 20g，（NH4)2SO4IOg, YNB3. 4g，ImoL/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液（ρΗ6· 0) 100mL，生物素 4 X 10 5g。
[0026] 实施例1 :重组菌的构建
[0027] (1)重组质粒 pMD19-T-GAD65的构建
[0028] 将核苷酸如SEQ ID NO: 1的GAD酶基因连接到pMD19-T质粒上，并转化大肠杆菌， 验证正确的转化子，得到重组质粒pMD19-T-GAD65。抽提pMD19-T-GAD 6#P pPICZa质粒，然 后以XhoI和NotI分别双酶pMD19-T-GAD65(合成的GAD65基因克隆至pMD19-T载体上）和 pPICZa质粒4h，0.7%琼脂糖凝胶电泳分析。利用割胶回收试剂盒回收目的片段，16°C连 接4h后，利用化学转化法，转化大肠杆菌DH5 a，将转化后的菌液涂布到含终浓度为25 μ g/ mL zeocin的低盐LB平板上，37°C培养24h后，挑选若干平板上生长出来的菌落，接种于2mL 含终浓度为25 μ g/mL zeocin的低盐LB液体试管中培养，然后以5' AOXl和3' AOXl为引物， 进行菌落PCR验证，结果阳性克隆扩增出2346bp片段，而以空载体pPICZ a作为对照扩增 出588b片段（如图1)，与理论相符，说明目的基因已经连接到pPICZa载体上，经测序，表 达载体的阅读框正确。得到重组质粒pPICZ a -hGAD65。
[0029] (2)重组毕赤酵母的构建
[0030] 以SacI线性化的表达载体pPICZ a -hGAD65电转化X-33毕赤酵母，涂布100 μ g/ mL zeocin的YH)抗性平板上进行后培养，将长出来的单菌落重新划线于此浓度抗性平板 上，挑选长势好的单菌落作为进一步验证其酵母基因组中是否整合了表达载体，以上述株 菌的基因组为模板，5' AOXl和3' AOXl为引物进行PCR验证，结果如图2所示，菌株扩增出 2. 2kb (基因组上的醇氧化酶基因）和2346bp (表达载体上的目的片段），而对照（整合了 空载体pPICZ a的重组毕赤酵母）扩增出2. 2kb和588bp (空载体上的目的片段），表明此 株菌可初步认为是成功整合了表达载体的重组毕赤酵母。将验证正确的菌株保种，送测序， 测序结果表明，GAD 65全编码序列正向插入酵母基因组中，阅读框的正确性。
[0031] 其中酵母感受态的制备方法如下：
[0032] (1)从新鲜YPD平板上挑取X-33毕赤酵母菌落于25mL YH)液体培养基中，30°C， 200r/min 培养 20h ;
[0033] (2)将0· 5mL上述培养液转接到25mL YPD液体培养基中，30 °C，200r/min培养 8h (大约 0D600 = L 3-1. 5);
[0034] (3)吸取ImL上述菌液于I. 5mL无菌的EP管中，4000r/min离心2min，收集菌体， 用I. 5mL预冷的无菌水，吹打悬浮细胞；
[0035] (4) 4000r/min离心2min，收集菌体，用ImL预冷的无菌水重新悬浮细胞；
[0036] (5) 4000r/min离心2min，收集菌体，用I. 5mL预冷的ImoL/L山梨醇悬浮细胞；
[0037] (6)4000r/min离心2min，收集菌体，用100 μ L预冷的ImoL/L山梨醇混匀细胞， 5min后方可使用。
[0038] 电穿孔转化法如下：
[0039] (1)提前预热电穿孔仪；
[0040] (2)取80 μ L酵母感受态细胞与20 μ L线性化的表达载体，轻轻混匀，冰浴5min ; 后转入预冷的〇. 2cm电击杯中；
[0041] (3)将电击杯外水汽彻底擦干净，放入电击室；
[0042] (4)按电转参数：1.51^，25 4卩，200,51118进行电击；
[0043] (5)电击后立即加入ImL预冷的ImoL/L山梨醇于电击杯中，轻轻吹打后，将内容物 全部转入无菌的I. 5mL EP管中，于30°C复活培养Ih ;
[0044] (6) 4000r/min离心5min，去除750 μ L上清液，将剩余的菌液涂布到含有100 μ g/ mL zeocin 的 YPDS 平板上，30°C培养 3-5d。
[0045] 实施例2 :重组菌发酵生产谷氨酸脱羧酶GAD65
[0046] 融合蛋白hGAD65的诱导表达及产物的鉴定
[0047] (1)诱导表达
[0048] 抽提测序正确的重组质粒pPICZ a -hGAD65R化到毕赤酵母X-33,得到基因工程表 达菌。
[0049] (a)将选定的重组毕赤酵母单菌落接种于50mL生长培养基BMGY/500mL三角瓶中， 30°C，200r/min 培养 20h ;
[0050] (b)将上述BMGY生长培养基中的菌液，室温静置lh，弃掉上清液，用30mL BMMY培 养基重新悬浮菌体，加入100%甲醇至终浓度为1%(￥八），30°(：，20(^/1^11培养，每隔2411 补加100%甲醇至终浓度为1% (v/v)进行诱导；
[0051] (c)甲醇诱导 48h 后，12000r/min 离心 5min，保留上清液，进行 Tricine-SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳（图3)。
[0052] (2)表达产物 hGAD6^ Tricine-SDS-PAGE 分析鉴定
[0053] 按照Protein Assay Kit Bradford蛋白质定