一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术及生物医药领域，涉及一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其应 用，具体涉及一类嘧啶核苷磷酸化酶及其基因，及含有该嘧啶核苷磷酸化酶基因的重组表 达载体和基因工程菌，并用于催化合成索非布韦中间体（2' R)-2' -脱氧-2' -氟-2' -甲基 脲苷，以及其他核苷类原料药及医药中间体的生产。
【背景技术】
[0002] 索非布韦（sofosbuvir，商品名Sovaldi)是美国Gilead Sciences公司研发的口 服治疗丙肝（HCV)药物，于2013年12月经FDA批准上市。索非布韦是首个获得批准用于 丙型肝炎全口服治疗方案的药物，是全球第一个上市的HCV聚合酶核苷类抑制剂，通过作 用于HCVNS5B聚合酶靶点干扰病毒遗传物质RNA的合成，从而终止HCV病毒的RNA链复制， 并对多种基因型HCV有治疗效果，单独应用索非布韦或与NS5A蛋白酶抑制剂合用，丙肝患 者服用12周持续病毒学应答率达到95%以上，临床效果显著，被医学界视为治疗丙型肝炎 的突破性药物。据世界卫生组织统计，全球丙肝的感染率约为3%，约1. 8亿人感染HCV，丙 肝呈现全球化流行趋势。索非布韦上市仅一年多，其销售额即过百亿美元，成为史上最快达 到年销售百亿美元的药品。
[0003] 索非布韦是尿嘧啶核苷类似物的前药，分子式为C22H29FN 3O9P,分子量529. 45, CAS 登记号为 1190307-88-0。中文化学名为（S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(2,4-二氧 代-3,4-二氢嘧啶-I (2H)-基]-4-氟-3-羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基）甲氧基）（磷酰 化苯氧基）氨基）丙酸异丙酯；英文化学名称为（S)-isopropyl 2-{ (S) _{{(2R，3R，4R，5R) -5-[2, 4-diox0-3, 4-dihydr0-pyrimidin-l(2H)-yl]-4-fluor〇-3-ydroxy-4-methyltetra hydrofuran-2-yl}methoxy}(phenoxy phospho-ryla-mino}pr〇-panoate〇
[0004] 核苷类似物的合成主要有化学合成法、碱基修饰法和生物转化法三种，前两种方 法工艺步骤多，反应条件苛刻，需要进行异构体的分离；碱基和核糖基团缩合时还需要进行 基团的保护和去保护，使合成反应的总收率偏低，成本居高不下（MENG W，ELLSWORTH B A， NIRSCHL A A,et al. J Med Chem,2008,51(5):1145-1149. CARR R,HILDBR AND S,HODGES M L，et al.WO, 2013178571 Al. 2013-11-05)。而酶催化合成方法具有反应条件温和、反应专 一性强、副反应少、产物容易分离纯化，可合成复杂的生物分子，无需基团保护等优点。目 前，嘧啶核苷磷酸化酶已被广泛用于酶法合成抗肿瘤、抗病毒的核苷类似物。
[0005] 核苷磷酸化酶（Nucleoside Phosphorylase，NPase)是核苷补救代谢途径中的 关键酶，广泛存在于真核或原核生物中，可分为噪呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylas，PNPase，EC2. 4· 2. I)，尿苷磷酸化酶（uridine phosphorylase， UrdPase, EC2. 4· 2· 4)和胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，dThdPase，EC2. 4· 2· 3)。 核苷磷酸化酶能可逆地催化核苷（或脱氧核苷）磷酸化反应。目前，利用核苷磷酸化酶已 成功合成了阿糖腺苷、利巴韦林、5-甲基尿苷等药物。但利用含有核苷磷酸化酶的天然菌株 合成核苷类药物存在酶量小的缺点，构建基因工程菌可从解决酶量问题。
[0006] 核苷磷酸化酶催化的化学反应如下：
[0009] 本发明开发了一个具有较高催化活性的嘧啶核苷磷酸化酶，可用于索非布韦中间 体的生产，以及相关核苷类原料药及医药中间体的生产。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种嘧啶核苷磷酸化酶基因及其 编码的蛋白。
[0011] 本发明的另一目的是提供该基因、含有该基因的重组质粒及基因工程菌的应用。
[0012] 本发明的又一目的是提供一种催化合成（2' R) -2' -脱氧-2' -氟-2' -甲基脲苷的 方法。
[0013] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0014] -种嘧啶核苷磷酸化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明中嘧 啶核苷磷酸化酶的基因序列来源可以为大肠杆菌Escherichia Coli)、产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)、芽抱杆菌（Bacillus)、微杆菌（Exiguobacterium)、胡萝卜软 腐欧文氏菌（Erwinia carotovora)、乙酰短杆菌（Brevibacterium actylium)、短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)等。本发明的一个实施例中啼啶核苷磷酸化酶的基因序列来自大 肠杆菌。嘧啶核苷磷酸化酶基因可以通过PCR扩增法、重组法或者化学合成方法获得。
[0015] -种嘧啶核苷磷酸化酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 含有本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的重组载体。可通过本领域常规方法 将本发明的嘧啶核苷磷酸化酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，如质粒 pUC18, pUC19, pET系列等，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒 为 pET-28a(+)。
[0017] -种生产所述的嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌，所述基因工程菌中包含所述的 嘧啶核苷磷酸化酶基因或所述的重组载体。
[0018] 所述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌（Escherichia coli) BL21(DE3) 〇
[0019] 本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因、所述的重组载体、所述的基因工程菌在制 备嘧啶核苷磷酸化酶中的应用。
[0020] -种嘧啶核苷磷酸化酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述的基因工程菌，获得 重组表达的嘧啶核苷磷酸化酶。
[0021] 所述的方法，优选还包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述嘧啶核 苷磷酸化酶的步骤。
[0022] 本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶在催化合成（2'R) _2'_脱氧_2'_氟_2'_甲基脲 苷中的应用。
[0023] -种利用本发明所述的嘧啶核苷磷酸化酶催化合成（2' R)_2' -脱 氧-2' -氟-2' -甲基脲苷的方法，以（3R，4R，5R) -3-氟-4-羟基-5-(羟甲基）-3-甲基四 氢呋喃-2-二氢磷酸和尿嘧啶为底物，权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶为催化剂，催化 合成（2' R) -2' -脱氧-2' -氟-2' -甲基脲苷。
[0024] 有益效果：
[0025] 本发明通过易错PCR和定点突变方法获得了 SEQ ID NO. 1所示的嘧啶核苷磷 酸化酶基因变体，通过将该基因导入大肠杆菌构建基因工程菌，并进行诱变表达，获得 了 SEQ ID NO. 2所示的重组嘧啶核苷磷酸化酶。重组嘧啶核苷磷酸化酶突变体的酶 活为612U/mg，比突变之前提高了 30-60%。该重组嘧啶核苷磷酸化酶能够用于催化 (3R，4R，5R)-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基）-3-甲基四氢呋喃-2-二氢磷酸和尿嘧啶合成索 非布韦中间体（2' R)-2' -脱氧-2' -氟-2' -甲基脲苷。 生物材料保藏信息 本发明基因工程菌分类命名为大肠杆菌NP1506Escherichia coli NP1506,2015年 12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为 CCTCC NO :M 2015782。
【具体实施方式】
[0026] 根据本发明一个实施例的嘧啶核苷磷酸化酶基因，其来源大肠杆菌 (Genbank:NC_000913. 3)。根据易错PCR和定点突变方法对其进行突变，从而获得该重组氨 基转移酶突变体目的基因，其基因序列为SEQ ID NO. 1。
[0027] 根据本发明一个实施例的嘧啶核苷磷酸化酶突变体的蛋白序列为SEQ ID NO. 2。
[0028] 根据本发明一个实施例的重组载体，包括本发明实施例的嘧啶核苷磷酸化酶突变 体基因，载体为pET-28a(+)，采用乳糖启动子。基因工程菌摇瓶培养的诱导剂为IPTG，嘧啶 核苷磷酸化酶制备的诱导剂为乳糖。
[0029] 根据本发明一个实施例的生产嘧啶核苷磷酸化酶突变体的基因工程菌具有包括 嘧啶核苷磷酸化酶多肽基因突变体的重组载体。
[0030] 具体地，本发明的基因工程菌为保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)的保藏 编号为CCTCC M 2015782的基因工程菌。
[0031] 实施例1基因工程菌的建立
[0032] 根据Genebank公布的大肠杆菌啼啶核苷磷酸化酶基因（Genbank:NC_000913. 3)， 人工合成嘧啶核苷磷酸化酶基因片段，以该基因片段为模版，通过PCR扩增扩 展该片段（片段两侧加 BamH I和EcoR I内切酶片段），其核苷酸序列如SEQ ID N0.3(Genbank:NC_000913.3)所示。并利用 Hind III 和 BamH I 内切酶位点 将基因插入pET-28a(+)质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21 (DE3)中 建立嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌。其中PCR扩增嘧啶核苷磷酸化酶基因的 引物为：上游引物为5' -GTCTGATGTTTTTCATCTCG-3'（SEQ ID NO. 4)，下游引物为 5'-CCCGTTTTCCCGCTGGCTTT-3'（SEQ ID NO. 5)。
[0033] 实施例2嘧啶核苷磷酸化酶突变体基因的获得
[0034] 本研究利用易错PCR和定点突变的方法，对嘧啶核苷磷酸化酶进行了蛋白质工程 改造。易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反