专利名称：制备嘧啶核苷的方法和新的嘧啶核苷化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种嘧啶核苷化合物的制备方法，其适合用作医药品等的合成原料，以及一种新的嘧啶核苷化合物。
背景技术：
特开昭59-213397号公报(专利文献1)和特开平5-49493号公报(专利文献2)等公开了利用核苷磷酸化酶，从嘧啶碱衍生物合成嘧啶核苷化合物的方法，其中的核酸碱均是尿嘧啶碱的衍生物。上述的尿嘧啶衍生物是嘧啶碱的4位上有羰基构造的化合物，从尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、胸腺嘧啶制备对应的核苷化合物的方法是已知的。
在利用胞嘧啶磷酸化酶，从磷酸糖和嘧啶碱衍生物制备嘧啶核苷化合物的方法中，EP1254959A2(专利文献3)中已经公开了从5-氟胞嘧啶、氮杂胞嘧啶(azacytosine)、5-甲基胞嘧啶制备胞嘧啶核苷化合物的方法，除此之外，没有已知的方法。
发明内容
嘧啶核苷化合物的制备中，特别是作为医药品的原料使用中，微量的副产物的混入是一个严重的问题。根据有机合成方法制备嘧啶核苷化合物中，通常生成α-异构体作为异构体。α-异构体的生成在增加精制负荷的同时，会降低嘧啶核苷化合物的回收率，而这是工业制造时的一个严重的问题。
因而，本发明的目的在于提供利用具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶，由磷酸糖和不同的嘧啶碱衍生物合成嘧啶核苷化合物的方法，以及提供嘧啶核苷化合物。
为了解决上述问题，本发明者们对在具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶的存在下，由不同的嘧啶碱衍生物和磷酸糖合成核苷化合物进行了深入的研究，结果发现由下述的通式(1)中所示的嘧啶碱化合物能制备出相应的核苷化合物。
再者，本发明者们等研究了利用具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的微生物，从4-乙酰胺基嘧啶和戊糖-1-磷酸生成嘧啶核苷化合物的反应，在该过程中，确认会大量生成乙酰基被水解的嘧啶碱或嘧啶核苷化合物，因此会显著降低反应产率。
本发明者们发现了这种脱乙酰化反应是由(1)由反应条件引起的化学反应，和(2)由宿主产生的具有脱乙酰化活性的酶引起的反应这两个反应的组合引起，同时，还对抑制脱乙酰化反应的方法进行了深入的研究，结果发现，将反应混合物的pH值控制在6～9，优选在7～8的范围，以及将反应温度控制在20℃～60℃，优选30℃～40℃的范围的方法，对于抑制化学的脱乙酰化反应的进行是有效的。本发明者们还发现从微生物的菌体、培养液及其处理物中减少或除去具有脱乙酰化活性的酶的方法，对于抑制由于具有该脱乙酰化活性的酶引起的脱乙酰化反应的进行是有效的。
基于以上认识，本发明者们完成了本发明。
也就是说，本发明如下所述(1)嘧啶核苷化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括在具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶的存在下，使磷酸化糖与嘧啶碱衍生物反应，得到嘧啶核苷化合物的步骤，其中嘧啶碱衍生物为式(I)表示的化合物 式中，R1表示可以被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基或碳原子数为1～3的烷基取代的氨基、碳原子数为1～3的烷基或巯基；R2表示氨基、巯基、羟基或氢原子；R3表示可以被羟基取代的碳原子数为1～3的烷基，氨基或氢原子；R4表示羟基或氢原子。但是，R1为氨基，R2为羟基，且R4为氢原子时，R3不能为碳原子数为1～3的烷基和氢原子。
(2)(1)中所述的制备方法，其中通式(1)所示的嘧啶碱衍生物为2-羟基-4-甲基嘧啶、4-乙酰胺基嘧啶、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶、4，5-二氨基-6-羟基嘧啶、2-巯基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或4-巯基尿嘧啶。
(3)(1)或(2)中所述的制备方法，其中磷酸化糖为核糖-1-磷酸、2-脱氧核糖-1-磷酸或2’，3’-二脱氧核糖-1-磷酸；(4)(1)～(3)中任一项所述的制备方法，其中前述的酶由大肠菌得到；(5)(1)～(4)中任一项所述的制备方法，其中前述的酶以含该酶的微生物菌体，或者从该菌体或其培养液得到的酶调制物的形式提供。
(6)嘧啶核苷化合物的制备方法，利用经脱酰化活性失活或者降低化处理的具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的微生物的菌体或酶调制物，将通式(1)中的R1为被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基取代的氨基的化合物与磷酸化糖反应。
(7)(6)中所述的制备方法，其中前述的微生物菌体或者前述的酶调制物的脱酰化活性的失活或者降低化处理通过加热或者与含有机溶剂的水接触进行。
(8)下述通式(II)表示的嘧啶核苷化合物 式中，R5为氨基或氢原子，R6为氨基或氢原子，R7为羟基或氢原子。
按照本发明，能提供使用酶合成嘧啶核苷化合物的方法，该化合物在已知方法中只能通过有机合成制备。
具体实施例方式
本发明中的具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶，是指一种具有以胞嘧啶或其衍生物作为基质，生成胞嘧啶核苷化合物的活性的酶，这种酶可来源于任何满足要求的动物、植物和微生物。一般来说，这种胞嘧啶核苷磷酸化酶的酶在相关领域中并不是公知的。因此，这一术语仅在本发明中如上述定义。
作为可用作这种胞嘧啶核苷磷酸化酶的具体的例子，较适合的是作为含在大肠杆菌(Escherichia coli)等的埃希氏菌(Escherichia)菌属等微生物中的已知的具有嘌呤核苷磷酸化酶的酶，其同时具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性。作为具体的例子，大肠杆菌(Escherichia coli)嘌呤核苷磷酸化酶的DNA碱基序列参见SED ID NO3，由此碱基序列翻译得到的氨基酸序列参见SED ID NO4。此外，基于当今在基因工程上的进步，使得通过对碱基序列的部分实行失活、插入、置换来改变氨基酸序列更加容易进行了。鉴于这样的技术水平，在期望不影响期望的酶活性的范围内，例如在酶活性得以保留甚至提高的范围内，对该碱基序列的一部分进行改变，从而改变氨基酸序列的酶也属于本发明的胞嘧啶核苷磷酸化酶。例如，在序列编号4表示的氨基酸中，在不影响目标酶活性的范围内，通过2～3个氨基酸的缺失、替换或插入得到的酶；在序列编号3表示的碱基序列中，在不影响目标酶活性的范围内，且其互补序列可在严格条件下杂化的条件下，具有通过缺失、替换或插入等突变得到的碱基序列编码的氨基酸序列的酶。在不影响目标酶活性的同时，在本发明中互补的序列可使杂交在苛刻的条件下进行。
本发明的嘧啶碱衍生物如通式(1)所示。通式(1)中，R1表示可以被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基或碳原子数为1～3的烷基取代的氨基、碳原子数为1～3的烷基或巯基；R2表示氨基、巯基、羟基或氢原子；R3表示可以被羟基取代的碳原子数为1～3的烷基，氨基或氢原子；R4表示羟基或氢原子，但是，R1为氨基，R2为羟基，且R4为氢原子时，R3不能为碳原子数为1～3的烷基和氢原子。
通常已知，在水介质中，嘧啶碱会形成互变异构体。例如，作为典型的嘧啶碱的胞嘧啶、2-巯基嘧啶和6-羟基-4-氨基嘧啶，会形成下示的互变异构体。
因而，本发明中使用的通式(I)所示的嘧啶碱衍生物当然也包括相应的互变异构体。
通式(I)所示的嘧啶碱衍生物的代表例包括2-羟基-4-甲基嘧啶、4-乙酰胺基嘧啶、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶、4，5-二氨基-6-羟基嘧啶、2-巯基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶和4-巯基脲嘧啶。
本发明的磷酸化糖中，磷酸通过酯键连接在多羟基醛或多羟基酮及其衍生物的1位上。磷酸化糖的优选例子包括核糖-1-磷酸、2’-脱氧核糖-1-磷酸、2’，3’-二脱氧核糖-1-磷酸和阿戊糖-1-磷酸。
上述的多羟基醛或多羟基酮可举出作为天然物中的戊醛糖，如D-阿戊糖、L-阿糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖；戊酮糖(ketopentose)，如D-木酮糖、L-木酮糖、D-核酮糖；脱氧糖，如D-2-脱氧核糖、D-2，3-二脱氧核糖，其范围并不限于此。
这些磷酸化糖，可通过核苷磷酸化酶的作用，向核苷化合物中加入磷酸进行分解反应制备(J.Biol.Chem.Vol.，184，437，1950)或通过异头物(anomer)选择性化学合成方法制备。此外，WO 01/14566中描述了通过在酶的脱氧核糖-1-磷酸的合成方法。
本发明中的嘧啶核苷化合物的合成反应，其利用微生物菌体、其培养液及其处理物，选择合适的pH值和温度等反应条件，在水介质中进行，其中，所述微生物菌体中表现出能将胞嘧啶衍生物和磷酸化糖做为基质合成胞嘧啶核苷化合物的核苷磷酸化酶，且通常pH值为4～10，温度为10～80℃。
水介质为一种由水，或以水作为主要组成、具有pH缓冲能力的溶剂。
反应中使用的磷酸化糖和嘧啶碱衍生物的浓度优选为约0.1～1000mM。两者的摩尔比为是添加的嘧啶碱衍生物的比率相对于磷酸化糖或其盐为0.1-10。鉴于反应的转化率，摩尔比优选为0.95。
作为本发明中生成的嘧啶核苷化合物，可举出例如4-甲基嘧啶呋喃核糖、2’-脱氧-4-巯基尿嘧啶、2-巯基胞嘧啶核苷、5-羟甲基胞嘧啶核苷、N-乙酰基-2’-脱氧胞嘧啶核苷和通式(II)所示嘧啶核苷化合物通式(II)中，R5表示氨基或氢原子；R6表示氨基或氢原子；R7表示羟基或氢原子。
而且，本发明中，微生物的菌体、培养液及其处理物中，含有通过对微生物的菌体或培养液中的菌体施加诸如超声波或渗透压冲击等进行破坏所得到的物质，以及用固定化载体等固定的菌体或其破坏物得到的物质，或从上述破坏物中精制得到的酶等。
此外，为了捕集反应混合物中生成的磷酸，可加入微溶于磷酸中的金属盐类，或加入诸如离子交换树脂等的载体，这样可以提高反应收率。
利用微生物的菌体、培养液或其处理物，使通式(I)中的R1是具有碳原子数为1～3的烷基的酰基取代的氨基的化合物与磷酸化糖反应，制备相应的嘧啶核苷化合物，其中，该微生物的菌体、培养液或其处理物对具有碳原子数为1～3的烷基的酰基取代的氨基的脱酰化的活性被失活或降低。
被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基取代的氨基的脱酰化活性可通过加热处理或活性降低处理而失活或降低。
本发明所述的加热处理没有特别的限制，只要其能失活或降低脱酰化活性，而不会使胞嘧啶磷酸化酶失活。例如，该微生物的菌体、培养液或其处理物可在水性介质中静置或悬浮至少10分钟，优选至少30分钟，其中，水性介质的pH值通常为4.0～0.0，优选6.0～9.0，温度通常为至少50℃，优选60～80℃。加热时间更优选为40分钟或更少。
此外，可通过向处理液中加入至少1mM，优选10～100mM的磷酸化糖，以进一步稳定胞嘧啶核苷磷酸化酶。
本发明中，对前述的脱酰化活性的降低化处理没有特别的限制，只要被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基取代的氨基的脱酰化活性能被失活或降低，而胞嘧啶核苷化合物不被失活。例如，将该微生物菌体、培养液或其处理物置于有机溶剂中，或进行加热处理，或可将所述破碎菌体制得的酶溶液用有机溶剂或硫酸铵等对酶进行分级处理，沉淀出蛋白质，仅除去具有脱酰化作用的酶。
本发明中涉及的有机溶剂没有特别地限制，只要其能使脱酰化活性失活。具体地说，可以包括极性溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二俄噁烷、四氢呋喃、丁酮或丙酮等；醇类，如1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、1-壬醇等；酯类，如醋酸丙酯、醋酸丁酯、醋酸异丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸戊酯、醋酸异戊酯、醋酸环己酯、醋酸苄酯等；烃类，如戊烷、环己烷、己烷、2-甲基己烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、环己烷、甲基环己烷、庚烷、环庚烷、辛烷、环辛烷、异辛烷、壬烷、癸烷、十二烷、石油醚、精制轻质溶剂汽油、轻石油、工业汽油、煤油、苯、甲苯、二甲苯、乙苯、丙苯、异丙苯、均三甲苯、萘等；卤代烃，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯或二氯苯等；酚类，如甲酚、二甲苯酚等；酮类，如甲基异丁基酮、2-己酮等；醚类，如二丙醚、二异丙醚、联苯醚、联苄醚等。此外，还包括酰胺化合物，如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基苯甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、N-甲基甲酰胺、N-乙基甲酰胺、N-甲基乙酰胺、甲酰胺、乙酰胺、苯甲酰胺等；脲化合物，如脲、N，N’-二甲基脲、四甲基脲、N，N’-二甲基咪唑啉酮等；亚砜化合物，如二甲基亚砜、二乙基亚砜、二苯基亚砜等。
在上述有机溶剂中，优选以丙酮作为有机溶剂。
本发明中对用有机溶剂失活或降低脱酰化活性的方法没有特别的限制，只要其能使脱酰化活性失活或降低而不使核苷磷酸化酶的活性失活即可。例如，将该微生物的菌体、培养液或其处理物静置或悬浮于pH值为4.0～10.0、优选pH值为6.0～9.0的有机溶剂水溶液中；有机溶剂水溶液浓度不小于10％(体积比)，优选不小于20％(体积比)，最好不小于30％(体积比)；温度不低于0℃，优选20℃～80℃，最好为50℃～80℃；时间为10分钟～40小时，最好为1～20小时。
此外，向反应液中加入有机溶剂也能得到同样的效果。
利用前述的通过活性降低处理，脱酰化活性失活或降低的菌体或酶调整物，将式(I)的化合物和磷酸化糖反应制得嘧啶核苷化合物，其中R1为被具有1～3个碳原子烷基的酰基取代的氨基。例如N-乙酰基-2’-脱氧胞嘧啶核苷。
可以利用该衍生物和生成物在水等溶剂中的溶解性的不同，或使用离子交换或吸附树脂的方法来从反应液中分离出嘧啶核苷化合物。
实施例以下实施例对本发明进行说明，但所列举的实施例并不限制本发明所保护的范围。
生成的嘧啶核苷化合物的鉴定按如下进行将反应液进行超滤，并用硅胶柱精制，提取生成物并真空干燥，通过C13-NMR和H1-NMR对得到的产物进行分析。
此外，生成的嘧啶核苷化合物均通过高效液相色谱(HPLC)进行了定量分析。分析条件如下色谱柱Develosil ODS-MG-5，4.6×250mm(野村化学)柱温40℃泵流速1.0ml/min检测UV 254nm淋洗液磷酸二氢钾(50mM)∶甲醇＝8∶1(V/V)
参考例1(产生胞嘧啶核苷磷酸化酶的菌体的制备)大肠杆菌染色体DNA的制备如下将大肠杆菌K-12/XL-10菌株(Stratagene公司)植入50ml的LB培养介质中，在37℃下过夜培养，然后收集菌群，用含1mg/ml的溶菌酶的溶菌液处理。再用苯酚处理溶菌液后，用通常的方法用乙醇使DNA进行沉淀。生成的DNA的沉淀沿玻璃棒缠绕沉淀后，回收清洗，用于PCR。
分别具有SED ID NOs1，2中的碱基序列的低聚核苷酸(由北海道系统科学株式会社合成)被用作PCR的引物。这些碱基序列是基于对已知的大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶进行的编码deoD基因的碱基序列(基因库中编号为AE000508(编码区碱基编号为11531-12250))设计的。这些引物分别在5’-端基和3’-端基附近具有限制性酶EcoRI和HindIII的识别序列。
PCR循环30次以下反应使用0.1ml的含有6ng/μl的已完全被限制性酶HindIII消化的大肠杆菌染色体DNA和3μm的每种引物的PCR反应溶液，在96℃变性处理1分钟，在55℃退火1分钟，并在74℃进行1分钟的拉伸反应。
上述的反应产物和质粒pUC18(宝酒造株式会社)被EcoRI和HindIII进行消化，然后用连接Hi(东洋纺株式会社产)连接。然后，利用重组的质粒，大肠杆菌DH5α就被转化了。将此转化体置于含50μg/ml的氨必西林(Am)和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂介质中进行培养，以获得白色的耐Am的转化体菌株。
从此转化体提取出的插入了目的DNA片断的质粒被命名为pUC-PNP73。可通过一般测定碱基序列的方法测定插入pUC-PNP73的DNA片断的碱基序列。确定的碱基序列列于SED ID NO3中。由此碱基序列翻译得到的氨基酸序列列于SED ID NO4中。这种酶具有分子量约为26000的亚基，而且它的活性是通过六聚体的形式表现的。其酶活性表现的最佳温度约为70℃，最佳pH值为约7.0～7.5。这种转化体被命名为大肠杆菌MT-10905。
将大肠杆菌MT-10905置于100ml的含有50μg/ml的Am的LB介质中，在37℃下振荡培养过夜。然后将培养液以13000rpm的速度离心分离10分钟，得到细胞群。再将得到的细胞群悬浮于20ml的100mM的磷酸盐缓冲液中(pH值为7.5)。将悬浮物再以13000rpm的速度离心分离10分钟，然后将其悬浮于10mM的50mM的2’-脱氧核糖-1-磷酸二(单环己铵)盐(SIGMA产)的溶液中。
参考例2(精制胞嘧啶核苷磷酸化酶的制备)用超声波破碎机，对参考例1中制得的悬浮液中的菌体进行破坏。在70℃下加热处理10分钟，然后离心分离制得粗酶溶液，然后将其注入由Toso制造的DEAE-Toyopearl(3cm×3cm)色谱柱中，其已用50mMTris-HCl缓冲液(pH值为7.5)平衡过。再用50mM～500mM的NaCl溶液对它进行线性梯度洗脱以收集活性馏分。洗脱液用70％的硫酸铵水溶液饱和以形成沉淀物进行回收。该沉淀物在10mM磷酸盐缓冲液(pH值为7.5)中进行渗析。将渗析后的溶液注入载有羟磷灰石(3cm×15cm)的色谱柱中，其已用10mM的磷酸缓冲液(pH值为7.5)平衡。再用10mM～50mM的10mM磷酸缓冲液(pH值为7.5)对其进行洗脱以收集活性馏分。酶溶液用70％的硫酸铵水溶液饱和以形成沉淀物，并回收。将收集到的沉淀物溶于1mL的10mM的磷酸缓冲液(pH值为7.5)中，再中10mM的Tris-HCl缓冲液(pH值为7.5)渗析，以制得2ml的精制酶。经确认，该精制酶在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺体系的电泳实验中呈现出一个单带。
实施例1将含有50mM的核糖-1-磷酸二(单环己铵)盐(SIGMA产)、10mM的2-羟基-4-甲基嘧啶(东京化成产)、100mM的醋酸钠缓冲液(pH为8.0)、0.1ml的参考例1中制得的菌体悬浮液的反应溶液1.0ml在50℃下反应1小时。反应溶液稀释后进行分析，生成了6.9mM相应的嘧啶核苷化合物。
实施例2将含有50mM的2’-脱氧核糖-1-磷酸二(单环己铵)盐(SIGMA产)、10mM的4-乙酰胺基嘧啶(ALDRICH制)、100mM的醋酸钠缓冲液(pH为8.0)、0.1ml参考例2中制得的菌体悬浮液的反应溶液1.0ml在50℃下反应1小时，稀释反应溶液后进行分析，生成了4.4mM相应的嘧啶核苷化合物。
实施例3向按特开2002-205996号公报记载的方法制得的2.5g的2’-脱氧核糖-1-磷酸二铵盐、0.63g的2，4-二氨基-6-羟基嘧啶(ALDRICH制)、1.5g的碳酸镁中加入15g蒸馏水，以制得反应溶液，向其中加入5ml的参考例2制得的酶溶液，在30℃下反应20小时。
通过ESI(+)法对反应溶液进行LC-MS测定。
色谱柱Develosil ODS-UG5，2.0×150mm(野村化学)流动相A0.1％(V/V)醋酸/H2OB0.1％(V/V)醋酸/CH3CNA/B＝90/10流速1.0mL/min检测254nm产物的洗脱时间为5.25分钟，MS的结果为质量数(强度峰)127(80)，243(100)和485(20)。
实施例4向按特开2002-205996号公报记载的方法制得的2.5g的2’-脱氧核糖-1-磷酸二铵盐、1.5g的4，5-二氨基-6-羟基嘧啶(LANCASTER制)、1.5g的碳酸镁中加入15g蒸馏水中，以制得反应溶液，向其中加入5ml的参考例2制得的酶溶液，在30℃下反应20小时。
通过ESI(+)法对反应溶液进行LC-MS测定。LC条件与实施例3中的相同。
产物的洗脱时间为6.68分钟，MS的结果为物质号(强度峰)127(40)，243(100)和485(10)。
过滤移除反应溶液中的沉淀物，加入盐酸调整溶液的pH值为2.0。将溶液浓缩至大约5g。加入3倍量的异丙醇进行结晶，过滤晶体，并用等量的异丙醇洗净，之后真空干燥，得到约0.6g的产物的晶体。
1H-NMR和13C-NMR的的测定结果如下1H-NMR(D2O，400MHz，20.1℃)δ8.29(s，1H)，6.31(t，J＝6.3Hz，1H)，4.48(m，1H)，4.12(m，1H)，3.87(dd，J＝3.4和12.5Hz，1H)，3.77(dd，J＝5.1和12.5Hz，1H)，2.54(m，1H)，2.42(m，1H)13C-NMR(D2O)δ(ppm)160.38，156.12，147.22，102.61，89.80，88.60，72.99，63.74，42.58实施例5将含50mM的2’-脱氧核糖-1-磷酸二(单环己铵)盐(SIGMA产)、10mM的2-巯基胞嘧啶(SIGMA产)、100mM的醋酸钠缓冲液(pH为8.0)、0.1ml参考例2中制得的酶溶液的1.0ml的反应溶液在50℃下反应1小时，将得到的反应溶液稀释进行分析，生成了0.3mM相应的核苷化合物。
实施例6将含50mM的2’-脱氧核糖-1-磷酸二(单环己铵)盐(SIGMA产)、10mM的5-羟甲基胞嘧啶(SIGMA产)、100mM的醋酸钠缓冲液(pH为8.0)、0.1ml参考例2中制得的酶溶液的1.0ml的反应溶液在50℃下反应1小时，将得到的反应溶液稀释进行分析，生成了0.1mM相应的核苷化合物。
实施例7将含50mM的2’-脱氧核糖-1-磷酸二(单环己铵)盐(SIGMA产)、10mM的4-巯基脲嘧啶(SIGMA产)、100mM的醋酸钠缓冲液(pH为8.0)、0.1ml参考例2中制得的酶溶液的1.0ml的反应溶液在50℃下反应1小时，将得到的反应溶液稀释进行分析，生成了4.2mM相应的核苷化合物。
实施例8(脱酰化活性的去除操作)将参考例1得到的菌体溶液在60℃下加热6小时。将该菌体溶液作为加热菌体溶液。
向参考例1得到的菌体中加入丙酮(70％V/V)，在30℃下搅拌1小时。离心分离回收菌体。将自然干燥的菌体作为干燥的丙酮处理菌体。
将参考例1中得到的菌体制成超音波破碎的粗酶溶液。向该粗酶溶液中加入丙酮(50％V/V)，离心分离除去沉淀物。再加入丙酮(80％V/V)，离心分离回收沉淀物，将干燥的酶粉末作为丙酮处理粉末实施例9(去除了脱酰化活性的酶的反应)将1.3g的2’-脱氧核糖-1-磷酸二(单环己铵)盐(SIGMA产)和0.6g的4-乙酰胺基嘧啶(ALDRICH产)中加入至16.5g蒸馏水中，再加入1.3g醋酸镁，以制得溶液，并向其中分别加入1)4g加热处理菌体，2)1.2g丙酮处理菌体，3)0.4g丙酮粉末，在30℃下反应6小时。通过加入NaOH或醋酸，使反应中的pH值为约7.0。作为比较例中，加入4g参考例1中得到的菌体悬浮液进行反应。
结果如表1所示表1
序列表<110>三井化学株式会社<120>嘧啶核苷化合物的制备方法<130>
<160>4<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物用于克隆大肠杆菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的寡核苷酸<400>1gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用作PCR引物用于克隆大肠杆菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的寡核苷酸<400>2tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29<210>3<211>720<212>DNA<213>大肠杆菌<400>3
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<400>4Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val1 510 15Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Tyr Ile Ala Glu Thr20 25 30Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly35 40 45Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly50 55 60Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp65 70 75 80Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Leu85 90 95Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr100 105 110Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala115 120 125Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Asn Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala130 135 140Leu Gly Ile Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe145 150 155160Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile165 170 175Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu180 185 190Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Ile Arg195 200 205Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp
210 215 220Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Glu225 230 23权利要求
1.嘧啶核苷化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括在具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶的存在下，使磷酸化糖与嘧啶碱衍生物反应，得到嘧啶核苷化合物的步骤，其中嘧啶碱衍生物为式(I)表示的化合物 式中，R1表示可以被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基或碳原子数为1～3的烷基取代的氨基、碳原子数为1～3的烷基、巯基；R2表示氨基、巯基、羟基或氢原子；R3表示可以被羟基取代的碳原子数为1～3的烷基，氨基或氢原子；R4表示羟基或氢原子，但是，R1为氨基，R2为羟基，且R4为氢原子时，R3不能为碳原子数为1～3的烷基和氢原子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中通式(1)表示的嘧啶碱衍生物为2-羟基-4-甲基嘧啶、4-乙酰胺基嘧啶、2，4-二氨基-6-羟基嘧啶、4，5-二氨基-6-羟基嘧啶、2-巯基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶或4-巯基尿嘧啶。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中磷酸化糖为核糖-1-磷酸、2-脱氧核糖-1-磷酸、2’，3’-二脱氧核糖-1-磷酸或阿糖-1-磷酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，该具有胞嘧啶核苷磷酸化活性的酶从大肠杆菌得到。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，该具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的酶以含该酶的微生物菌体，或者由该菌体或其培养液得到的酶调制物的形式提供。
6.嘧啶核苷化合物的制备方法，利用具有胞嘧啶核苷磷酸化酶活性的微生物的菌体或酶调制物，将通式(1)中的R1为被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基取代的氨基的化合物与磷酸化糖反应，其中该微生物的菌体或酶调制物对被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基取代的氨基的脱酰化的活性被失活或者降低。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中前述的微生物菌体或者前述的酶调制物的脱酰化活性的失活或者降低化处理通过加热或者与含有机溶剂的水接触，选择进行脱酰化活性的失活或降低化处理。
8.下述通式(II)表示的嘧啶核苷化合物 式中，R5为氨基或氢原子，R6为氨基或氢原子，R7为羟基或氢原子。
全文摘要
本发明提供一种利用胞嘧啶核苷磷酸化酶，使磷酸糖与不同嘧啶碱衍生物反应制备嘧啶核苷化合物的方法。该方法包括在具有胞嘧啶磷酸化活性的酶的存在下，使磷酸化糖与嘧啶碱衍生物反应，得到嘧啶核苷化合物的步骤，其中嘧啶碱衍生物为式(I)表示的化合物。式中，R1表示可以被具有碳原子数为1～3的烷基的酰基或碳原子数为1～3的烷基取代的氨基、碳原子数为1～3的烷基或巯基；R2表示氨基、巯基、羟基或氢原子；R3表示可以被羟基取代的碳原子数为1～3的烷基，氨基或氢原子；R4表示羟基或氢原子，但是，R1为氨基，R2为羟基，且R4为氢原子时，R3不能为碳原子数为1～3的烷基和氢原子。
文档编号C07H19/00GK1576371SQ20041006907
公开日2005年2月9日 申请日期2004年7月16日 优先权日2003年7月18日
发明者安乐城正, 三宅仁基, 及川利洋 申请人:三井化学株式会社