一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中udpc的分析检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析化学领域，涉及对细胞代谢改善药胞磷胆碱钠注射液质量进 行分析的方法，具体涉及一种胞磷胆碱钠注射液中尿苷二磷酸胆碱的分析检测方法，该分 析检测方法主要采用液相色谱法（即HPLC)分离测定胞磷胆碱钠注射液中的杂质尿苷二磷 酸胆碱。
【背景技术】
[0002] 胞磷胆碱钠注射液的主要成分为胞磷胆碱钠（英文名：CiticolineSodium，CAS: 33818-15-4)，化学名为胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯单钠盐。分子式为C14H25N4NaOnP2，分子量 为510. 31，其结构式如下：
[0003]
[0004] 胞磷胆碱是细胞膜结构性磷脂生物合成的中间物质。外源性给予胞磷胆碱，能通 过增加磷脂的合成快速修复神经元细胞膜，促进乙酰胆碱和多巴胺的合成，稳定神经递质 系统，并能够促进大脑的能量代谢。胞磷胆碱能增强上行性网状结构激活系统的功能，降低 脑血管阻力，增加脑血流量，改善大脑血液循环，促进大脑物质代谢，功能恢复。
[0005] 1956年Geiger在动物实验中发现胞磷胆碱能使脑损伤恢复。1957年Kennedy的 研究证实其在脑磷脂质的合成中至关重要，1961年日本武田制药公司开发生产出此产品， 并于1988年在我国注册。目前，该品种制剂上市剂型有片剂、胶囊剂及注射剂，依托我公司 现有生产线，选择开发胞磷胆碱钠注射液剂型。国外上市的胞磷胆碱钠注射液规格有2ml: 0. 25g及5ml:0. 5g;根据本品的用法用量及国内外上市产品的信息，确定我司研发的制剂 规格为：胞磷胆碱钠注射液2ml:0. 25g及5ml:0. 5g。
[0006] 胞磷胆碱钠注射液中的杂质UDPC(英文全称为Uridine5'-(trihydrogendipho sphate)，P，_[2-(trimethylammonio)ethyl]ester,innersalt，CAS:99492_83_8,UDPC为 英文简称），化学名为尿苷二磷酸胆碱，分子式为C14H25N3012P2，分子量为489. 31，其结构式如 下：
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[0008] 胞磷胆碱钠嘧啶环上的两个氮的孤对电子都没有共辄，在酸性条件下，它的氮 被氢离子结合后有利于氨基离子（_NH3+)离去，水再作为亲核试剂取代，最后异构为杂质 UDPC〇
[0009] 反应机理如下所示：
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[0011] 因此，实现胞磷胆碱钠及其杂质间的有效分离对测定胞磷胆碱钠和各杂质的量具 有重大意义。目前，本领域仍然期待有用于控制胞磷胆碱钠注射液质量的有效方法，尤其是 期待能够快速、准确地分析出胞磷胆碱钠注射液中杂质UDPC含量的方法。
【发明内容】
[0012] 本发明目的是提供一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，该分 析检测方法是一种可用于控制胞磷胆碱钠质量的有效方法。用特定的色谱分析条件，包括 使用C18色谱柱，以及使用磷酸盐缓冲液-甲醇分离测定胞磷胆碱钠注射液中相关杂质的 高效液相色谱法，可以有效地实现胞磷胆碱钠中杂质UDPC的分离及测定。本发明人经过反 复试验发现，用Inersil? 〇DS-3(型号为C18,柱长X内径为150X4. 6mm)色谱柱检测，以 磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液（取0.Olmol/L四丁基氢氧化 铵溶液用磷酸调节pH值至4. 5)等体积混合）]-甲醇（二者的体积比95 :5)为流动相，可 以将胞磷胆碱钠杂质UDPC进行有效分离，从而可以准确控制胞磷胆碱钠的质量。本发明的 方法能简单、快速、准确地分离、检测出胞磷胆碱钠及其杂质含量。
[0013] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中 UDPC的分析检测方法，该分析检测方法采用高效液相色谱法对含胞磷胆碱钠的药物制剂中 杂质UDPC进行分析检测，包括以下步骤：
[0014] 第一步，用高效液相色谱法分析系统适用性溶液，系统适用性溶液的进样量为 20μ1，记录色谱图中胞磷胆碱钠峰与5' -胞苷酸峰的分离度；
[0015] 第二步，当所述第一步得到的胞磷胆碱钠峰与5' -胞苷酸峰的分离度大于1. 5时， 再用高效液相色谱法分析含胞磷胆碱钠的药物制剂样品溶液和对照溶液，药物制剂样品溶 液和对照溶液的进样量均为10μ1，记录色谱图至主成分保留时间的至少3倍，获得药物制 剂样品溶液和对照溶液的高效液相色谱分析图，从中读取并计算杂质数量、杂质种类、杂质 相对量、各色谱峰之间分离度中的至少一个信息；
[0016] 第三步，将所述第二步中得到的高效液相色谱分析图中的峰面积值带入到公式 中，计算出含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的含量，所述公式为UDPC的质量百分含量= (药物制剂样品溶液中UDPC的峰面积+对照溶液中胞磷胆碱钠的峰面积）Χ0. 5% ;
[0017] 在所述第一步和第二步中，色谱条件为：
[0018] 色谱柱为Inersi「K 0DS-3色谱柱；色谱柱的柱温为30~40°C;流动相为磷酸盐缓 冲液-甲醇混合溶液，其中磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95:5,磷酸盐缓冲液的pH值为 4. 3~4. 7 ;流动相的流速为0. 9~1.lml/min;使用紫外检测器，检测波长为276nm。
[0019] 上述技术方案中的有关内容解释如下：
[0020] 1、上述方案中，含胞磷胆碱钠的药物制剂也可以指胞磷胆碱钠注射液。
[0021] 2、上述方案中，所述系统适用性溶液的制备：将每100ml水中含有25mg的5' -胞 苷酸对照品溶液与每l〇〇ml水中含有25mg的胞磷胆碱钠对照品溶液等体积混合，即得系统 适用性溶液。
[0022] 3、上述方案中，所述对照溶液的制备：精密量取所述药物制剂样品适量，用水定量 稀释制成每lml中含0. 0125mg的溶液，作为对照溶液；
[0023] 所述药物制剂样品溶液的制备：精密量取含胞磷胆碱钠的药物制剂样品适量，用 水定量稀释制成每lml中含胞磷胆碱钠2. 5mg的溶液，即为药物制剂样品溶液。
[0024] "精密称取"系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。
[0025] 4、上述方案中，所述磷酸盐缓冲液是通过以下步骤获得的：将0.lmol/L的磷酸二 氢钾溶液和四丁基铵溶液等体积混合，即得磷酸盐缓冲液，其中，所述四丁基铵溶液取是通 过用磷酸调节pH值至4. 5的0.Olmol/L四丁基氢氧化铵溶液得到的。
[0026] 所述磷酸盐缓冲液具体是通过以下步骤获得的：取磷酸二氢钾13. 6g，加1000ml 水溶解；四丁基铵溶液的制备：取10 %四丁基氢氧化铵26ml，加水至1000ml，用磷酸调节 pH至6. 5 ;取磷酸二氢钾溶液与四丁基铵溶液等体积混合，摇匀，即得。
[0027] 5、上述方案中，所述色谱柱的柱温优选为35 °C。
[0028] 6、上述方案中，所述流动相的流速优选为1.Oml/min。
[0029] 7、上述方案中，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为4. 45~4. 55.
[0030] 8、上述方案中，所述Inersil1' 0DS-3色谱柱的生产厂商为日本GLSciences公司， 该InersiP〇DS-3色谱柱的填料粒径为4μm，色谱柱的内径4. 6_，色谱柱的柱长为150_。 以上型号参数可以简写为4μπι，150X4. 6_，或简写为150_Χ4. 6_Χ4μπι，或其它类似 简写方式。
[0031] 9、上述方案中，所述磷酸盐缓冲液中还加入有离子对试剂，优选离子对试剂为 10%四丁基氢氧化铵水溶液。发明人发现在流动相中加入离子对试剂，在不干扰两个已知 杂质的前提下，能够更好地分离胞磷胆碱钠与杂质5胞苷酸和UDPC，并且有效改善峰 形。
[0032] 本发明设计特点是：本发明人发现，采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱， 即inersil? 〇DS-3(型号为C18,柱长X内径为150X4. 6mm)色谱柱，能够有效分离胞磷胆 碱钠中含有的两个已知杂质，即杂质5'-胞苷酸和UDPC;在柱箱温度为30~40°C的范围 内具有相当好的分离效果，色谱峰的对称性良好；在pH值为4. 3~4. 7的范围内具有相当 好的分离效果。
[0033] 本发明方法针对胞磷胆碱钠中的杂质Y-胞苷酸和UDPC有良好的检测效果。另 外，本发明采用等度条件对胞磷胆碱钠中的杂质进行分析，有如下优点：
[0034] (1)分析时间较短，快速，仅需15分钟左右即可完成胞磷胆碱钠中的杂质UDPC的 分析检测。
[0035] (2)系统稳定，重现性较好。
[0036] (3)对高效液相色谱仪型号及性能要求不高，高效液相色谱仪可以使用岛津LC Solution/LabSolution，或安捷伦ChemStation，或其他色谱系统。
[0037] (4)对胞磷胆碱钠中的杂质UDPC更具有针对性和适用性，并且测定的准确度高。
【附图说明】
[0038] 附图1为流动相为磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液 (取0. 01m0l/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4. 5)等体积混合）]-甲醇（磷酸 盐缓冲液与甲醇的体积比为95 :5)，柱温为35°C，流速为1. 0ml/min时的系统适用性HPLC 图；
[0039] 附图2为流动相为磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液 (取0. 01m0l/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4. 5)等体积混合）]-甲醇（磷酸 盐缓冲液与甲醇的体积比为95 :5)，柱温为35°C，流速为1. 0ml/min时的样品HPLC图；
[0040] 附图3为流动相为磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液 (取0. 01m0l/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4. 3)等体积混合）]-甲醇（磷酸 盐缓冲液与甲醇的体积比为95 :5)，柱温为35°C，流速为1. 0ml/min时的系统适用性HPLC 图；
[0041] 附图4为流动相为磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液 (取0. 01m0l/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4. 3)等体积混合）]-甲醇（磷酸 盐缓冲液与甲醇的体积比为95 :5)，柱温为35°C，流速为1. 0ml/min时的样品HPLC图；
[0042] 附图5为流动相为磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液 (取0. 01m0l/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4. 7)等体积混合）]-甲醇（磷酸 盐缓冲液与甲醇的体积比为95 :5)，柱温为35°C，流速为1. 0ml/min时的系统适用性HPLC 图；
[0043] 附图6为流动相为磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液 (取0. 01m0l/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4. 7)等体积混合）]-甲醇（磷酸 盐缓冲液与甲醇的体积比为95 :5)，柱温为35°C，流速为1. 0ml/min时的样品HPLC图；
[0044] 附图7为流动相为磷酸盐缓冲液[0.lmol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液 (取0. 01m0l/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4. 5)等体积混合）]-甲醇（磷酸 盐缓冲液与甲醇的体积比为95 :5)，柱温为30