专利名称：盐藻中钠磷共转运通道1;2基因、其编码蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及盐藻中钠磷共转运通道l;2基因、其编码蛋白及其克隆方法。
背景技术：
盐藻，又叫杜氏藻，它是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是已知的最耐盐的真 核生物。同时，它对光照、环境pH、温度和重金属离子等变化造成的胁迫也能够很 好的耐受。因而被广泛的用来研究植物对各种胁迫的反应机制，特别是耐盐胁迫的机 制。
磷是所有生物必需的生命元素，生物体对无机磷吸收利用的第一步是通过无机磷 转运通道来实现的。本实验室利用SSH技术从盐藻(Dw"fl//e//fl v/nYfo)中分离到两 个受高盐与磷"饥饿"诱导的钠磷共转运通道基因(DvSP7V， DWiT2)。在功能上， Z)vSP77和I)vS户77可能与盐藻细胞中的无机磷的转运，促进甘油合成，维持对外界 高渗胁迫的适应有关。
基因复制是基因组进化的一种重要机制，是基因功能多样化的前提，也是物种进 化的主要推动力。基因发生复制后积聚突变或者获得新的功能，或者退化成没有功能 的假基因。基因功能在具备多样化之前，必需先发生基因复制，由此可见基因复制在 进化中的重要性。
发明内容
本发明的目的之一是提供盐藻钠磷共转运通道l;2基因(DvS户77;力。 本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。 本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。
为达到上述目的，本发明通过"鸟枪"法测序盐藻BAC克隆DNA，得到了一段 连续的盐藻基因组序列，根据在NCBI的核酸库中的Blastn比对发现，获得了盐藻钠 磷共转运通道l;2基因(DvS尸77;力。
本发明采用如下技术方案
一种盐藻钠磷共转运通道l;2基因，其特征在于该基因具有SEQ N0 1所示的
碱基序列。
上述的盐藻钠磷共转运通道l;2基因编码蛋白，其特征在于具有SEQ N0 2所示 的氨基酸序列。
上述的盐藻钠磷共转运通道l;2基因的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步
骤
a. 根据NCBI GenBank DvS尸n (DQ286760) 的基因组序列设计下列引物5' ACTGGTCCACAGACAAGAAGG 3'与5' TCTCAGCATCACGAGCCATA 3';通过四维PCR筛选体系从盐藻BAC文库得到一个含有盐藻钠磷共转运通 道基因的BAC克隆，并构建该BAC克隆的鸟枪文库；
b. 从步骤a中构建的鸟枪文库中，大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在 MegaBACE4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进 行双向测序；共测序600个鸟枪文库质粒，即6块96孔板；
c. 将上述的600个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计 算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以 填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列。通过Blastn 程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在该连续的盐藻基因组序列中， 获得盐藻钠磷共转运通道l;2基因的全长基因组序列，长度为7973bp。
本发明通过对盐藻BAC克隆DNA的"鸟枪"法测序，在连续的盐藻基因组序 列中发现盐藻钠磷共转运通道1基因(Z)vSP77)和不同于已知的盐藻钠磷共转运通 道1;2基因(DvS尸77;2)。它们可能起源于盐藻基因组序列的复制，并且在6个不同 盐稳态条件下Z)vSP77z2的表达量要大于DvSP77，它们的表达趋势也发生了分化。 当盐藻处在极端高盐浓度条件下(5M NaCl)时，Dv5P77;2可能担负起主要功能， 它增加了盐藻对于更宽盐浓度的适应性。而Z)v5777;2响应高盐或磷"饥饿"胁迫时 的诱导表达趋势与DM户77类似，在功能上可能与盐藻细胞中的无机磷的转运，促进 甘油合成，维持对外界高渗胁迫的适应有关。本发明在研究植物抗盐机制上具有一定 的理论意义。
图l显示了BAC DNA序列的Blastn比对结果示意图，图中两个箭头所指匹配 到序列都是盐藻钠磷共转运通道基因(Z)wm/zW/fl v/n'cfo sodium-coupled phosphate transporter protein gene)，它们在GenBank中的序列号都是DQ286760。左侧箭头所
指序列是Z)vS尸n，右侧箭头所指序列是DvSP77;2。
图2显示了 DvS尸77和DvS尸77;2的基因组序列结构示意图，图中灰色的箭头代 表大片段重复区段，黑色箭头代表非重复区段。
图3 DvSP7V和Dv5P77;2在6个不同盐稳态条件下的表达情况，X轴代表盐藻 培养基中NaCl的浓度，Y轴代表目标基因拷贝数与内参基因拷贝数的比值。图下的 表格代表了柱状图示的具体数值。。
图4 DvSP7V和DvS尸77;2在高盐(A)与磷"饥饿"(B)胁迫下的表达情况，X轴 代表盐藻受外界胁迫的时间，Y轴代表目标基因拷贝数与内参基因拷贝数的比值。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按 照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rded.)或植物分子 生物学一实验手册(plant Molecular Biology—A Laboratory Manual, Melody S. Clark 编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的 条件。
实施例一BAC克隆的筛选与鸟枪文库的测序及拼接
根据NCBI GenBank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上DvSiTl (DQ286760)的 基因组序列设计引物(5' ACTGGTCCACAGACAAGAAGG 3'与5' TCTCAGCATCACGAGCCATA 3')，通过四维PCR筛选体系从盐藻BAC文库得到 一个含有盐藻钠磷共转运通道基因的BAC克隆，并构建该BAC克隆的鸟枪文库。
大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定。每个 鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。以该BAC克隆大小为70kb计算， 以每个测序反应得到可用序列为800 bp，得到可用序列的成功率以80%来计算，按 10倍覆盖的要求，共测序600个鸟枪文库质粒，即6块96孔板。
在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测 序列。构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组 序列。
实施例二 BAC DNA序列的Blastn比对与Z)vS尸J7和DvS尸77，'2基因组序列的
比较
在NCm的核酸库中，BAC DNA序列的Blastn比对结果显示，在连续的盐藻基 因组序列中发现了两个盐藻钠磷共转运通道基因(图1)。图中左侧箭头所指序列就 是盐藻钠磷共转运通道1基因(Z)WP7V)，右侧箭头所指序列是一个新的同源基因， 命名为盐藻钠磷共转运通道1;2基因(ZH^尸77z2)。
在Z)WP77和i)W尸77;2 8 kb左右的基因组序列范围内，包括大片段重复区域(大 约7 kb, 97.9%的同源性)与3'下游区域(只有47.0%的同源性)(图2)。大片段重 复区域覆盖了这对同源基因的5'上游区域，整个基因编码区域，但不包括3'下游区 域(图2)。以上结果暗示DvSPT7和DvSP77J可能来源于盐藻中同一祖先基因的基 因复制(gene duplication),这种基因复制的机制可以帮助盐藻在进化中增加基因的 数量，分化基因的功能。
实施例三DvSP77/2基因在不同外界条件下的表达分析
分别设计DvS尸77;2和DvS尸7V以及内参基因Z)"cri" (AF163669)的特异性引 物，利用Real-time PCR的方法检测DvSP77;2和Z)vSP7V在不同外界条件下的表达量。 DvSPTlRTS: 5' TTGTGGCTGGTTCATATCCT 3' DvSPTlRTA: 5' TATTCAATCAGTTCAGTGGG 3' DvSPTl;2RTS: 5' TGTTCCTTCGGCTGTCTTAT 3' DvSPTl;2RTA: 5' AATTGAGTTCCTCGCTTGTG 3' DvActinRT+: 5' GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC 3' DvActinRT陽5' CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA 3'
Real-time PCR分析结果显示(图3)，在6个不同盐稳态条件下DvS尸77;2的表 达量要大于DvS户77。并且从0.5M至5MNaCl， Z)vS户77;2的表达是逐渐上升的；而 DW户77的表达经历了一个先上升后下降的过程。由此可知，DWP77;2和DvS户7V在 表达上发生了分化。
而DW户77;2响应高盐或磷"饥饿"胁迫时的诱导表达趋势与DvS户77类似，并 没有发生改变(图4)，这说明DvSP77;2和DvS户77在功能上都与盐藻细胞中的无机 磷的转运，促进甘油合成，维持对外界高渗胁迫的适应有关。 序歹U表 <110〉上海大学
<120>盐藻钠磷共转运通道1;2基因、其编码蛋白及其克隆方法 <160> 2
<210> 1
<211> 7973
<212> DNA
<213> 盐藻( <400> 1
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<210> 2 <211> 672 <212> PRT
<213> 盐藻(Dw"a//e//a vzWcfo) <400〉 2
Met Thr Asp Val Asp Ser Phe Ser Gly Asn Met Pro Asn Leu Ser 1 5 10 15
Gly Phe Glu Ser Ala Ala Gly Trp Gin Gly Glu Asn Phe Thr Tyr 20 25 30
His Asp Gly Lys Trp Ser Ala Tyr Val Trp Leu Leu Val He Gly 35 40 45
Ser Phe Thr Ser Phe Met Ala Ala Trp Gly He Gly Ala Asn Asp 50 55 60
Val Ala Asn Ser Phe Ala Thr Ser Val Gly Ser Lys Ala Leu Thr 65 70 75
Met Phe Gin Ala Cys Val lie Ala Gly lie Phe Glu Phe Val Gly 80 85 90
10
atctgttccttcggctgtcttattatttag7080
ggctgcctgagtggtcaatcttgctagtga7140t￡lg￡L￡LtCSLtgc鄉gatctgtctgagcagt7200
ccgcctgcttagtgcactgt7260
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ccgtctactcttgtacatttcatgattgta7440
cttcagctatgtcaatgtgagggctg卿a7500
acaccattcagtaccaggtgactgccaggc7560
acagagtaaccacgagtgttgcactggttc7620
gctcatg犯gac 11 cataaacaagtacgag7680
gg已gcccgccggcacacaaactagctaaag7740
tggacsgacacgtgggtagtgcactaccca7800
gtaaggcagg7860
tg￡Ltt￡L￡L￡Lg￡Lgcc肪gg卿tagcgatctc7920
33g7973
Ala Val Ser Leu Gly Gly Thr Val Val Lys Thr Val Lys Gly Ser 95 100 105
lie Thr Asp Pro Ser Met Phe Lys His Gin Pro Gin lie Phe Ala 110 115 120
Tyr Gly Met Leu Gly Ala Ser Thr Ser Val Ala lie Val Leu Phe 125 130 135
Leu Ala Thr Tyr Leu Lys Gin Ala Val Ser Thr Thr His Thr Ala 140 145 150
He Gly Ser Val Leu Gly Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Ala Asp 155 160 165
Gly Val Thr Trp Asn Glu Val Ser Asp Glu Phe Pro Phe Arg Lys 170 175 180
Gly Phe Thr Pro Val Val lie Ser Trp Phe Val Ser Pro Val Phe 185 190 195
Thr Ala lie Leu Ser Ser Gly Phe Phe lie lie Thr Arg lie Val 200 205 210
Cys Leu Gin Arg Gin Gin Ser Tyr Lys lie Ala Phe Phe Met lie 215 220 225
Pro Val Leu Met Met He Thr lie Phe He Val Leu Leu Ala He 230 235 240
Phe Leu Lys Ser Val Asp Ser Gly His Asp Arg Glu Gly Glu Glu 245 250 255
Asn Trp Ser Thr Asp Lys Lys Ala Trp Val Ala He Val Val Gly 260 265 270
Ala Gly Ala Gly Leu Leu Thr lie Pro Tyr Thr He Trp Leu Arg 275 280 285
Lys Ser Met Leu Gin Glu Asp Gin Glu Val His Glu Glu Asn Met 2卯295 300
Ala Arg Asp Ala Glu Thr Ala His Val Ala Ala Gly Gly Thr Leu 305 310 315
Lys Glu Lys Asn Pro Glu Asp Asp Val His Glu Leu Thr Lys Ala 320 325 330
Glu Lys Phe Met Glu Trp Phe Asn Gly Thr Trp Phe Gly Gin Arg
335 340 345
Gin Phe Val Lys Asn Phe Val Ala Ala Met Thr Tyr Asp Val His 350 355 360
Ala His Val Ala Thr Met Asp Asn Pro Lys Val Ala Gin Met His 365 370 375
Ala Asp Ala Glu Val Phe Asp Pro Arg Thr Glu Asp Val Phe Lys 380 385 3卯
Arg Met Gin lie lie Thr Ala Ser Ala Val Ala Phe Val His Gly 395 400 405
Ala Asn Asp Val Ala Asn Gly Val Gly Pro Leu Ala Gly lie Trp 410 415 420
Asp Thr Tyr Asn Thr Tyr Gin Ser Gly Ser Gly Lys Ala Ser Gin 425 430 435
Pro Arg Trp He Leu Val lie Gly Ala Ala Gly lie Val Phe Gly 440 445 450
Leu Ala Met Tyr Gly Tyr Arg lie lie Ala Thr Leu Gly Val Asp 455 460 465
Leu Val Val Met Thr Pro Ser Arg Gly Tyr Ser Val Glu Leu Ala 470 475 480
Ala Ala Ala lie lie Ala Leu Ala Ser Thr Tyr Gly Leu Pro Val 485 4卯495
Ser Thr Thr Gin Val Val Thr Gly Gly Glu lie Gly Val Gly Met 500 505 510
Cys Glu Ser Trp Lys Met Thr Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe lie 515 520 525
Arg Thr Phe Trp Gly Trp Val Gly Ala Leu Val Thr Gly Ala lie 530 535 540
Leu Ser Ala Leu Leu Phe Ser lie Gly Val Tyr Gly Pro Ser Arg 545 550 555
Thr Asp Leu Asp Tyr Val Thr His Tyr Gin Arg Ala Met Lys lie 560 565 570
Asp lie Asp Gin Ser Met Gin Ala Leu Leu Asp Arg Cys Ala Ala 575 580 585
Ala Pro Ala Pro Thr Asn Gly Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Asp 590 595 600
Leu Asn Cys Ser Cys Gin Gin Arg He Pro Tyr Thr Met Gly Asp 605 610 615
Leu Gin Gly Leu Lys Thr Gin Val Asp Gly Leu Phe Asn Phe Glu 620 625 630
Glu Asn Gly Gin lie Asn Glu Tyr Asn Met Met Tyr Met Leu Arg 635 640 645
Gin lie Asn Ser Leu Phe Lys Tyr Thr Phe Phe Asp Gly Asp Phe 650 655 660
Ser Gin Tyr Glu Asn Val Ser Glu Gin Thr Met Pro 665 670
权利要求
1.一种盐藻钠磷共转运通道1；2基因，其特征在于该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。
2. —种根据权利要求1所述的盐藻钠磷共转运通道l;2基因编码蛋白，其特征在于 具有SEQ N0 2所示的氨基酸序列。
3. —种根据权利要求1所述的盐藻钠磷共转运通道l;2基因的克隆方法，其特征在 于该方法具有如下步骤-a. 根据NCBI GenBank DvS尸n (DQ286760) 的基因组序列设计下列引物5' ACTGGTCCACAGACAAGAAGG 3'与5' TCTCAGCATCACGAGCCATA 3';通过四维PCR筛选体系从盐藻BAC文库得到一个含有盐藻钠磷共转运通 道基因的BAC克隆，并构建该BAC克隆的鸟枪文库；b. 从步骤a中构建的鸟枪文库中，大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在 MegaBACE4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进 行双向测序；共测序600个鸟枪文库质粒，即6块96孔板；c. 将上述的600个鸟枪文库质粒的原始数据输入在RedHat Linux平台的并联计 算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以 填补出现在序列之中的缺口，得到一段连续的盐藻基因组序列；通过Blastn 程序在该连续的盐藻基因组序列中，获得盐藻钠磷共转运通道l;2基因的全长 基因组序列，长度为7973bp。
全文摘要
本发明涉及一种盐藻中钠磷共转运通道1；2基因、其编码蛋白及其克隆方法。该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。本发明通过对盐藻BAC克隆DNA的“鸟枪”法测序，在连续的盐藻基因组序列中发现盐藻钠磷共转运通道1基因(DvSPT1)和不同于已知的盐藻钠磷共转运通道1；2基因(DvSPT1；2)。它们可能起源于盐藻基因组序列的复制，并且在6个不同盐稳态条件下DvSPT1；2的表达量要大于DvSPT1，它们的表达趋势也发生了分化。当盐藻处在极端高盐浓度条件下(5M NaCl)时，DvSPT1；2可能担负起主要功能，它增加了盐藻对于更宽盐浓度的适应性。而DvSPT1；2响应高盐或磷“饥饿”胁迫时的诱导表达趋势与DvSPT1类似，在功能上可能与盐藻细胞中的无机磷的转运，促进甘油合成，维持对外界高渗胁迫的适应有关。本发明在研究植物抗盐机制上具有一定的理论意义。
文档编号C07K14/415GK101100669SQ200710041200
公开日2008年1月9日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者孟祥宗, 宋任涛, 管祯玮, 许政暟 申请人:上海大学