一种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种β?NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，所述有关物质为NAD、ATP、ADP，包括以下步骤：配制对照品和供试品溶液；分别取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪中，记录色谱图中β?烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的峰面积，按照外标法，以无水β?烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐来计算HPLC含量；分别取NAD、ATP、ADP的杂质对照品溶液各20ul，注入液相色谱仪中，记录色谱图中NAD、ATP、ADP的峰面积，再按照外标法计算β?烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品中NAD、ADP、ATP的含量。本发明方法灵敏度高、可靠性强，检测成本低，适用广。
【专利说明】
一种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法。
【背景技术】
[0002] β_烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐通常都是由β_烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADP水解成盐而得到，而NADP是一种辅酶，是β-烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD与一个磷酸分 子以酯键结合的物质，广泛存在生物体内能量代谢过程，嘌呤核苷酸是机体重要的能量物 质。其中三磷酸腺苷酸ATP作为细胞内能量传递的"分子通货"，是机体能量的直接来源，二 磷酸腺苷酸ADP和一磷酸腺苷酸AMP可通过氧化磷酸化等转化为ATP供能，生物体中ATP- ADP-AMP系统的能量状态可通过能荷EC大小说明。β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD和β-烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP是细胞能量代谢所必需的辅酶，在能量代谢中起着核心作用。 此外，嘌呤核苷酸在生物过程中也起着重要的传递作用，能量反应中的质子通常先被传递 至NAD和NADP，再还原成NADH和NADPH，经过电子传递至氧并释放能量。而生成的还原性NADH 和NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，具有重要的抗氧化功能。
[0003] 现有的大多数厂家的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP大生产合成工艺过程都 是以烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD和三磷酸腺苷酸ATP为原料合成NADP，同时生成副产物 二磷酸腺苷酸ADP。而现有生产厂家的对上述几个物质的检测方法都是选择紫外分光光度 法进彳丁检测。
[0004] 现有的文献和发明关于高效液相测定β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐NADP 的含量和其中有关物质大小主要有以下文献和发明。
[0005] 1: "超高效液相色谱一质谱法测定细胞中嘌呤核苷酸的方法探究"；姜丹丹、李伟、 周怀彬、张婷、许芳、武佳、吕建新;《分析测试学报》，2013，10(32)，10;
[0006] 2: "高效液相色谱法测定骨骼肌4了？^0?^10\嫩0+、嫩0!1含量"；洪平、刘虎威、靳 光华、黎燕、杨奎生;《中国运动医学杂志》，2002，1 (21 )，1。
[0007] 但是现有的高效液相色谱法中β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐以及其中各 种有关物质无法有效分离，致使现有检测方法灵敏度不高、可靠性差，检测成本高，无法适 用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐生产中任何一步中间体的考察。
[0008] 故此，现有的β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，有待于进一步完善。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种能有效测定β_烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐中有关物质以及其中有关物质NAD、ATP、ADP的方法，本方法灵 敏度高、可靠性强，检测成本低，适用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐生产中任何一 步中间体的考察，也适用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐本身的质量控制检测。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0011 ] -种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，所述有关物质为NAD、ATP、ADP，其 特征在于包括以下步骤：
[0012] A、取sigma对照品：β_烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐用稀释剂溶解成浓度为 lmg/ml的对照品溶液;取β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品用稀释剂溶解成浓度为 0.5mg/m 1的供试品溶液；
[0013] B、分别取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪中，记录色谱图中β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的峰面积，按照外标法，以无水烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸二钠盐来计算HPLC含量，不小于98% ;
[0014] C、分别取sigma对照品NAD、ATP、ADP用流动相分别溶解成浓度为5ug/ml、2.5ug/ 1111、2.51^/1111的杂质对照品溶液，取0-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品用流动相溶 解成浓度为〇. 5mg/ml的样品溶液；
[0015] D、分别取NAD、ATP、ADP的杂质对照品溶液各20ul，注入液相色谱仪中，记录色谱图 中NAD、ATP、ADP的峰面积，再按照外标法计算β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品中 NAD、ADP、ATP的含量，其中NAD、ADP、ATP分别各不超过1.0%、0.5%、0.5%。
[0016] 如上所述的β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，其特征在于步骤C中所述 流动相由6.06g三羟甲基氨基甲烷加入1000ml水溶液，再用浓磷酸调节溶液pH为4.0，超声 过滤脱气制得。
[0017]如上所述的β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，其特征在于所述的液相色 谱仪中采用C8色谱柱，流速：1.2ml/min，柱温：30°C，检测器采用紫外检测器，检测波长： 260nm〇
[0018]如上所述的β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，其特征在于还包括有系统 适应性测定:分别取约25mgf3-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐、NAD、ATP、ADP化学对照品 用稀释剂溶解，摇匀并定容到50ml，取20ul进样记录色谱图各峰的分离度和理论塔板数，分 离度的大小要不小于1.5,理论踏板数不小于2500。
[0019]综上所述，本发明的有益效果：
[0020] -、本发明能够快速准确的测定β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的含量以及 其中NAD，ATP的含量。
[0021] 二、相对现有的一些应用紫外分光光度计检测方法来说，该方法应用的高效液相 色谱检测方法，检测准确度大大提高，可以应用于工业化生产中间产品控制和成品的质量 检测，可以应用于工业化大生产中产品中杂质控制。
[0022]三、现有的HPLC检测方法中，无法在一个液相条件下分离β-烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸二钠盐和NAD以及ATP、ADP，即无法同时定量以上四种物质，而本方法解决了这个问 题，在同一液相色谱条件下，响应值一样的情况下，同时分离和定量这四种物质。
【具体实施方式】
[0023]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0024]本发明β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法中所述有关物质为NAD、ATP、 ADP〇
[0025] 1、本发明采用的色谱条件
[0026] 1.1色谱柱<8色谱柱
[0027] 1.2流动相:6.06g三羟甲基氨基甲烷加入1000ml水溶液，再浓磷酸调节溶液pH约 为4.00,超声过滤脱气既得。
[0028] 1.3稀释剂:流动相
[0029] 1.4流速：1.21111/1^11柱温：30。(：进样体积：2〇111
[0030] 1.5检测器:紫外检测器
[0031] 1.6检测波长：260nm
[0032] 2:ΗΡΙΧ-β_烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐有关物质以及含量测定的方法包括 以下步骤：
[0033] 2.1取β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐-sigma对照品为已知对照品，用稀释 剂溶解成浓度为lmg/ml的对照品溶液，取β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品用稀释 剂溶解为浓度为〇. 5ml/ml的对照品供试品溶液。
[0034] 2.2分别取20ul进样记录色谱图中β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的峰面 积，按照外标法，以无水烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐来计算HPLC含量，不小于 98% 〇
[0035] 2.3取西格玛对照品NAD、ATP、ADP，再用流动相分别溶解成浓度为5ug/ml、2.5ug/ 1111、2.51^/1111的杂质对照品溶液，取0-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品用稀释剂溶 解为浓度为〇. 5mg/ml的样品溶液。
[0036] 2.4分别取20ul进样记录色谱图中NAD、ATP、ADP的峰面积，再按照外标法计算β-烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品中有关物质的大小，N A D、A D Ρ、A Τ Ρ分别各不超过 1·0%、0·5%、0·5%〇
[0037] 本发明中为了验证测定方法的适用性，进行了以下测试：
[0038] 分别取约25mgf3-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐、NAD、ATP、ADP化学对照品用 稀释剂溶解，摇匀并定容到50ml。取20ul进样记录色谱图各峰的分离度和理论塔板数，分离 度的大小要不小于1.5,理论踏板数不小于2500。
[0039]为了进一步验证本发明测定方法，进行了一下试验：
[0040] -、线性试验
[0041] 取β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的化学对照品适量，用稀释剂分别配置为 0 · 2mg/ml、0 · 4mg/ml、0 · 8mg/ml、1 · 3mg/ml、1 · 6mg/ml 的供试品溶液。分别取20u 1 溶液，注入 液相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见下表1。
[0042] 表1 NADP线性实验
[0045]以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r2 = 0.9996。
[0046] 结果表明：β-烟酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸二钠盐在0.2mg/ml~1.601mg/ml浓度范 围内线性良好。
[0047] 取ATP的化学对照品适量，用稀释剂分别配置为0.5ug/ml、1. Oug/ml、2ug/ml、 3.25ug/ml、4.00ug/ml的供试品溶液。分别取20ul溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图，各 浓度的峰面积见下表2。
[0048] 表2 ATP线性实验
[0051]以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r2 = 0.9997。
[0052] 结果表明：三磷酸腺苷酸ATP在0.5ug/ml~4ug/ml浓度范围内线性良好。
[0053] 取ADP的化学对照品适量，用稀释剂分别配置为0 · 5ug/ml、1 · Oug/ml、2ug/ml、 3.25ug/ml、4.00ug/ml的供试品溶液。分别取20ul溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图，各 浓度的峰面积见下表3。
[0054] 表3 ATP线性实验
[0056]以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r2 = 0.9996。
[0057] 结果表明：二磷酸腺苷酸ADP在0.5ug/ml~4ug/ml浓度范围内线性良好 [0058]取β_烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)的化学对照品适量，用稀释剂分别配置为 1 ·00ug/ml、2 ·00ug/ml、4· 00ug/ml、6 · 50ug/ml、8ug/ml的供试品溶液。分别取20ul溶液，注 入液相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见下表4。
[0059] 表4 NAD线性实验
[0061]以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r2 = 0.9997。
[0062]结果表明：二磷酸腺苷酸(ADP)在1 .Oug/ml~8ug/ml浓度范围内线性良好。
[0063] 二、准确度试验
[0064] 对照品溶液的制备：精密称取β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐对照品约 25mg，置于50ml量瓶中，稀释剂适量，使溶解，并用稀释剂定容至刻度，摇匀，作为对照品溶 液。
[0065] 供试品溶液的制备:分别精密称取β_烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐对照品及 供试品，供试品NADP含量为98 · 5 %，约20mg和20mg，25mg和25mg、30mg和30mg，分别置于 100ml、100ml、100ml量瓶中，加稀释剂适量，使溶解，并用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得 80%、100%、120%的样品，每个浓度各配置三份。按含量测定项下分别测定回收率，结果如 下表5:
[0066]表5回收率测定结果
[0068]结果表明：本法测定准确度良好。
[0069] 三、精密度试验
[0070]取上述准确度项下100%的供试品溶液，连续进样6次，记录主成分峰面积的精密 度如下表6。
[0071 ] 表6精密度试验结果
[0073]结果提示:方法的精密度良好。
[0074]四、溶液稳定性试验
[0075] 取上述准确度项下100%的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、16、24小时，进样，记 录主成分的峰面积变化，结果如下表7。
[0076]表7溶液稳定性考察
[0078]结果表明，24小时内供试品溶液稳定性良好。
[0079]五、方法耐用性试验
[0080] 取上述准确度项下为100 %的供试品溶液，对色谱条件中的流动相的pH值、色谱柱 温度等条件进行小范围改动，考察主成分的保留时间的影响及含量测定结果情况，流动相 溶液PH值大概为3.2左右.考察结果见下表8。
[0081] 表8含量测定方法耐用性考察
[0083]取本品，分别用两根不同的品牌的色谱柱，按该方法测定β-烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸二钠盐的含量，结果如下表9:
[0084]表9不同色谱柱间的耐用性
[0086]本发明采用高效液相色谱法一 UV检测器来测定β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二 钠盐的全部已知有关物质和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的含量。本发明解决了如 何在同一个液相色谱条件下有效的分离和准确定量检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二 钠盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、ATP、ADP，这四种极性和化合物结构相差比较大的物质的 方法。本发明利用高效液相色谱仪，在紫外检测器条件下应用C8色谱柱进行分离，能够有效 的监控以NAD和ATP为原料合成NADP的大生产过程以及NADP成品的质量检测，准确的得知生 产过程中NAD和ATP原料的消耗以及NADP成品的质量，有利于工业化大规模生产NADP。
【主权项】
1. 一种β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，所述有关物质为NAD、ATP、ADP，其特 征在于包括以下步骤： A、 取sigma对照品：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐用稀释剂溶解成浓度为lmg/ ml的对照品溶液；取β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品用稀释剂溶解成浓度为 0.5mg/m 1的供试品溶液； B、 分别取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪中，记录色谱图中β-烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的峰面积，按照外标法，以无水烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸二钠盐来计算HPLC含量，不小于98% ; C、 分别取s igma对照品NAD、ATP、ADP用流动相分别溶解成浓度为5ug/ml、2 · 5ug/ml、 2.5ug/ml的杂质对照品溶液，取β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品用流动相溶解成 浓度为〇. 5mg/ml的样品溶液； D、 分别取NAD、ATP、ADP的杂质对照品溶液各20ul，注入液相色谱仪中，记录色谱图中 NAD、ATP、ADP的峰面积，再按照外标法计算β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐样品中 NAD、ADP、ATP的含量，其中NAD、ADP、ATP分别各不超过1.0%、0.5%、0.5%。2. 根据权利要求1所述的β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，其特征在于步骤C 中所述流动相由6.06g三羟甲基氨基甲烷加入1000ml水溶液，再用浓磷酸调节溶液pH为 4.0,超声过滤脱气制得。3. 根据权利要求1或2所述的β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，其特征在于所 述的液相色谱仪中采用C8色谱柱，流速:1.2ml/min，柱温:30°C，检测器采用紫外检测器，检 测波长：260nm〇4. 根据权利要求1所述的β-NADP二钠盐含量及有关物质的测定方法，其特征在于还包 括有系统适应性测定:分别取约25mg β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐、NAD、ATP、ADP 化学对照品用稀释剂溶解，摇匀并定容到50ml，取20ul进样记录色谱图各峰的分离度和理 论塔板数，分离度的大小要不小于1.5,理论踏板数不小于2500。
【文档编号】G01N30/06GK105866270SQ201610192347
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】娄良
【申请人】中山百灵生物技术有限公司