专利名称：偶联酶促反应测定5'－核苷酸酶的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物样本中测定5’-核苷酸酶活性的技术方案以及有此方案制造的试剂。特别是涉及一种有5’-核苷酸酶将次黄苷酸水解产生次黄苷后偶联多酶促反应体系。
背景技术：
Bertrand(1982)借助5’-核苷酸酶(5’-Nucleotidase，5’-NT)将次黄苷酸(Inosine5’-monophosphate disodium salt，IMP)水解产生次黄苷(Inosine)。通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)酶促反应生成过氧化氢(H2O2)。利用Trinder氏反应(1969)H2O2在过氧化物酶(Peroxidase，POD)的氧化作用下将3，5-双氯-2-羟基苯磺酸(3，5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonicacid，DHBS)和4-氨基比林(4-aminophenazone)偶联物凝聚成紫红色的有色醌(Quinoneiminedye)。通过连续反应和动态观察有色醌510nm处吸光度上升的速率来测定5’-NT的活性。该法缺点是供氢体的选择过窄，仅选用DHBS。其反应原理和参考文献如下 Alain Bertrand and Jean Buret，用离心生化分析仪一步测定血清5’-核苷酸酶。临床化学学报119(1982)275-284。[Alain Bertrand and Jean Buret，A one-step determinationof serum 5’-nucleotidase using a centrifugal analyzer.Clinica ChimicaActa，119(1982)275-284.]P.Trinder，用葡萄糖氧化酶和一种新型氧受体来测定血糖。临床生化年刊，卷6，24-26页，1969。[P.Trinder，Determination of glucose in blood using glucose oxidase with analternative oxygen acceptor.Annals in Clinical Biochemistry，v.6，p.24-26，1969]发明内容Bertrand氏测定5’-NT的次黄苷偶联酶促反应体系仅选用DHBS作为供氢体，不利于反应的灵活应用。
本发明对Bertrand氏法中Trinder氏反应进行了改进。将以下任一苯胺类化合物用作Trinder氏反应的供氢体。从而增加了反应的灵活性，使5’-NT测定的整套反应体系更有利于临床推广使用。
1)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxylaniline(ADOS)]2)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺[N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline(ADPS)]3)N-乙基-N-(3-硫丙基)苯胺[N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline(ALPS)]4)N，N-双(4-硫丁基)-3-甲基苯胺[N，N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline(TODB)]5)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲基苯胺[N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS)]6)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲基苯胺[N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOPS)]本发明借助5’-NT水解次黄苷酸生成次黄苷。通过次黄苷偶联PNP和XOD酶促反应，使产生的H2O2在POD的氧化作用下将苯胺类供氢体和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AA)偶联物凝聚成有色产物。通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定5’-NT的活性。
以本发明的次黄苷偶联酶促反应配制了测定5’-NT的试剂盒。
具体实施例方式
1.确定IMP Michaelis常数Km1)试剂组成试剂IGood’s缓冲液pH 7.6 100mmol/L4-AA 2mmol/L5’-NT 150U/L(响尾蛇毒)PNP 100U/LXOD 200U/LPOD 600U/L试剂II Good’s缓冲液pH 7.6 100mmol/LIMP 0.001-10mmol/LTOOS 2mmol/L2)试验参数与操作步骤温度 37℃
波长550nm比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向正予孵育 1.8ml试剂I予孵育时间 5分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间2分钟测试时间3分钟测试仪 Shimadzu UV-1603)计算计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。
ΔA/min=(ΔA1/min+ΔA2/min+ΔA3/min)3]]>4)结果以ΔA/min作为反应速率V，用1/V作为Y轴，IMP浓度S的倒数1/S作为X轴。作Lineweaver-Burke图。求得IMP Km 3×10-5mol/L。
2.确定有色产物毫摩尔消光系数ε1)试剂组成试剂IGood’s缓冲液pH7.6 100mmol/L4-AA 2mmol/L5’-NT 150U/L(响尾蛇毒)PNP 100U/LXOD 200U/LPOD 600U/L试剂II Good’s缓冲液pH7.6 100mmol/LIMP 3mmol/LADOS或ADPS或ALPS 2mmol/L或TODB或TOPS或TOOS2)试验参数与操作步骤温度37℃波长260nm(IMP)比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向负予孵育 1.8ml试剂I予孵育时间 5分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间2.5小时测试仪 Shimadzu UV-160
动态观察1mmol/L IMP吸光度下降至2.5小时后完全降解。然后，在以下波长测定有色产物的吸光度542nm (ADOS)540nm (ADPS)561nm (ALPS)630nm (TODB)630nm (TOPS)550nm (TOOS)3)结果ε毫摩尔消光系数 在本法条件下供氢体ADOS氧化凝聚产物ε＝64.46mM-1cm-1ADPS氧化凝聚产物ε＝66.12mM-1cm-1ALPS氧化凝聚产物ε＝97.88mM-1cm-1TODB氧化凝聚产物ε＝53.32mM-1cm-1TOPS氧化凝聚产物ε＝53.32mM-1cm-1TOOS氧化凝聚产物ε＝76.07mM-1cm-13.苯胺类供氢体化合物的选择1)试剂组成试剂I Good’s缓冲液pH7.6 100mmol/L4-AA 2mmol/LPNP100U/LXOD200U/LPOD600U/L试剂II Good’s缓冲液pH7.6 100mmol/LIMP10mmol/LADOS或ADPS或ALPS 2mmol/L或TODB或TOPS或TOOS2)生物样本O-300U/L响尾蛇毒5’-NT3)试验参数与操作步骤温度37℃波长542nm (ADOS)540nm (ADPS)561nm (ALPS)630nm (TODB)630nm (TOPS)550nm (TOOS)比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向正予孵育 0.05ml样本+1.8ml试剂I予孵育时间 5分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间2分钟测试时间3分钟测试仪 Shimadzu UV-1604)计算计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。
ΔA/min=(ΔA1/min+ΔA2/min+ΔA3/min)3]]>5,-NT(U/L)=ΔA/min×Tv×1000ϵ×Sv×L]]>一个5’-NT活性单位(U/L)定义为在本测试特定条件下每分钟将1μmole次黄苷酸水解成为次黄苷。
ε毫摩尔消光系数 在本法条件下供氢体ADOS氧化凝聚产物ε＝64.46mM-1cm-1ADPS氧化凝聚产物ε＝66.12mM-1cm-1ALPS氧化凝聚产物ε＝97.88mM-1cm-1TODB氧化凝聚产物ε＝53.32mM-1cm-1TOPS氧化凝聚产物ε＝53.32mM-1cm-1TOOS氧化凝聚产物ε＝76.07mM-1cm-1Tv总反应体积(ml)Sv样品体积(ml)L比色杯光径(cm)5)结果不管选择哪种苯胺类供氢体化合物，5’-NT线性范围0-300(U/L)4.5’-NT测定试剂盒产品名称5’-核苷酸酶(5’-NT)试剂盒型号生化试剂产品代码DC-5NT规格试剂I(R1)50ml，试剂II(R2)25ml，5’-NT正常血清(冻干)1ml/1瓶，5’-NT异常血清(冻干)1ml/1瓶，275测试/盒(罗氏Cobas Mira生化分析仪)。
检测介质血清或血浆适用于体外诊断用途5’-核苷酸酶(5’-NT)试剂盒适用于体外定量测定人血清中的5’-核苷酸酶(5’-Nucleotidase，5’-NI)活性。5’-NT测定有助于肝胆病和肝癌的临床诊断。
概述5’-核苷酸酶(5’-NT)全称为5’-核糖核苷酸磷酸水解酶，是一种特殊性的磷酸酯水解酶。它能特异地水解5’-核苷酸(5’-核苷一磷酸)连于成糖的5’-磷酸，生成核苷和无机磷酸，它对4种5’-核糖糠苷一磷酸都能水解，但对5’-去氧核糖苷一磷酸则无作用。
5’-NT分布在肝、胆、胰、肠、心、脑、肺、肾、垂体、甲状腺、前列腺、睾丸……等脏器和组织中，定位在细胞膜上，在肝内主要存在于胆小管和窦状间隙内。本酶最适PH为6.6-7.0，受mg2+激活，却受Ni2+抑制，(这些恰与碱性磷酸酶相反)，其机制可能是5’-NT在血清中以高分子量，高电荷的形式存在，可以被Ni2+沉淀。
5’-NT测定意义1.肝胆病血清中此酶活力增高主要见于肝胆系统疾病。5’-NT有助于鉴别诊断肝细胞性黄疸和胆汁淤积性黄疸和胆法淤积性黄胆。前者5’-NT仅轻度增高，后者活性高于正常的2-3倍。
2.判断血清碱性磷酸酶增高原因5’-NT特导性高，能协助临床判断血清碱性磷酸酶增高是肝胆系统疾病还是骨骼系统疾病还是骨骼系统疾病。在骨骼系统的疾患如肿瘤转移、畸形性骨炎、甲状旁腺机能亢进、佝偻病等，血清碱性磷酸酶活力通常增高，而5’-NT仍为正常或为临界值。所以对血清碱性磷酸酶活力增高患者，测定此酶有助于判断血清碱性磷酸酶活力增高是胆道系统疾病还是骨骼系统疾病引起。此外，妊娠妇女及儿童期5’-NT不增高，但血清碱性磷酸酶均升高。
3.原发、继发性和转移性肝癌5’-NT是诊断肝肿瘤非常灵敏标志，在病变早期当肝功能、肝扫描和有关肝病检查阴性时本酶活性已明显增高。
目前临床上对肝功能能第一线检验常用的BIL、ALT/AST，A/G，P/T，HbsAg，AFP试验于肝病的初步筛选，以鉴别肝细胞性和胆汁淤积性疾病，而5’-NT，NH3，Y-GT，胆汁酸则列为第二线检查，以证实第一线肝病异常与肝病关系，5’-NT是肝酶检查重要检查部份，应把它列入肝功能常规项目检查，将会更全面了解肝脏情况，提高临床应用价值。
原理
(λmax 556nm)应用5’-NT偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)，黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)反应连续监测法。5’-NT水解次黄苷酸(Inosine 5’-monophosphate disodium salt，IMP)生成次黄苷(Inosine)；再通过偶联PNP的作用，生成次黄嘌呤(Hypoxanthine)；后者在XOD氧化下生成尿酸(Uric Acid)和过氧化氢(H2O2)；最后在POD的作用下H2O2再与N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(EHSPT或TOOS)、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AA)反应(Trinder氏反应)，生成紫红色的有色醌(Quinone dye)。通过动态测量有色醌550nm处吸光度上升的速度来测算5’-NT的活性。
试剂盒组份5’-核苷酸酶(5’-NT)试剂盒含有1.试剂I(R1) 50ml/1瓶2.试剂II(R2) 25ml/1瓶3.5’-NT正常血清(冻干)1ml/1瓶4.5’-NT异常血清(冻干)1ml/1瓶5.检验证明6.1份使用说明。
试剂组成试剂IGood’s缓冲液pH7.6 100mmol/L4-AA 2mmol/LPNP 100U/LXOD 200U/LPOD 600U/L试剂IIGood’s缓冲液pH 7.6 100mmol/LIMP 10mmol/LEHSPT 2mmol/L5’-NT质控血清 响尾蛇毒5’-NT和人血清试剂配制本试剂盒为液体双试剂，可直接上机使用。5’-NT质控血清需要溶于1ml蒸馏水中方可使用。
试剂的稳定与贮存期试剂30℃下可保存不超过二周，避光保存2-8℃一年，严禁冷冻。冻干5’-NT质控品2-8℃或冷冻保存一年。溶化后的5’-NT质控品18-19℃保存至少一月，2-8℃或冷冻保存期更长。
样本收集用新鲜和非溶血的血清或血浆。如果有需要可以进行抗凝处理。样品中5’-NT在4℃条件下稳定一周。
试验参数与操作步骤温度37℃波长550nm比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向正予孵育 0.05ml样品+1.8ml R1(或依比例混匀)予孵育时间 5分钟启动反应加0.9ml R2(或依比例混匀)
样品/试剂1∶54延迟时间2分钟测试时间3分钟空白参照水总反应时间 5分钟测试仪 Shimadzu UV-160计算计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。
ΔA/min=(ΔA1/min+ΔA2/min+ΔA3/min)3]]>5,-NT(U/L)=ΔA/min×Tv×1000ϵ×Sv×L]]>ε毫摩尔消光系数 在本法条件下有色醌ε＝76.07(1cm光径)Tv总反应体积(ml)Sv样品体积(ml)L比色杯光径(cm)当比色杯光径1cm时5’-NT(U/L)＝ΔA/min×723当比色杯光径0.5cm时5’-NT(U/L)＝ΔA/min×1446注意事项1.如果受限于分析仪比色杯容积限制，可以依比例(详见试验参数)调整R1、样本及R2使用量。0.18ml R10.005ml 样本0.09ml R2的比例曾应用于罗氏Cobas Mira生化分析仪，其结果和Shimadzu UV-160分光光度仪无显著性差异。
2.如果受限于分析仪只能接受单试剂，则可以在测试前依比例(详见试验参数)混合R1及R2成为一混合剂。
3.若样品5’-NT＞300U/L，也即用1cm比色杯光径反应吸光值变化大于0.41A/min，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释倍数。
4.如保存不当，试剂发现有混浊时，应弃用。
试剂性能线性范围0-300 5’-NT(U/L)精密度批内CV 8.49％和批间CV 7.23％特异性血清、高浓度胆红素、血红蛋白和碱性磷酸酶对本法无干扰。
参考值正常人血清5’-NT活性参考值2-11.4U/L，建议各实验室根据自身实验条件自行订定正常人血清5’-NT活性范围。
仪器全自动、半自动生化分析仪或可见光分光光度计产品特征液体双试剂特异性测定5’-NT测定精密度高抗干扰能力强适合自动化快速测定参考文献参阅实申参考资料.
权利要求
1.一种测定生物样本中5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是借助5’-核苷酸酶将次黄苷酸水解产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和4-氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物，通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定5’-核苷酸酶的活性。
2.一种按权利要求1制造的测定生物样本中5’-核苷酸酶活性的产品，其特征是借助5’-核苷酸酶将次黄苷酸水解产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和4-氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物，通过连续反应和动态观察有色产物的产量，从而测定5’-核苷酸酶的活性。
3.根据权利要求1所述的测定生物样本中5’-核苷酸酶活性的方法，其特征是苯胺类供氢体可为以下任何一种N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxylaniline(ADOS)N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline(ADPS)N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline(ALPS)N，N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline(TODB)N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS)N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOPS)。
4.根据权利要求2所述的制造测定生物样本中5’-核苷酸酶活性的产品，其特征是苯胺类供氢体可为以下任何一种N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxylaniline(ADOS)N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline(ADPS)N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)aniline(ALPS)N，N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline(TODB)N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOOS)N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline(TOPS)。
全文摘要
Bertrand(1982)借助5’－核苷酸酶将次黄苷酸水解产生次黄苷，通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢，利用Trinder氏反应过氧化氢在过氧化物酶的氧化作用下将供氢体3，5－双氯－2－羟基苯磺酸和4－氨基比林偶联物凝聚成紫红色的有色醌，通过连续反应和动态观察有色醌510nm处吸光度上升的速率来测定5’－核苷酸酶的活性。该法缺点是供氢体的选择过窄。本发明将苯胺类化合物ADOS、ADPS、ALPS、TODB、TOOS和TOPS用作Trinder氏反应的供氢体，增加了反应的灵活性。本发明还涉及用于进行上述方法的试剂盒。
文档编号G01N21/77GK1693882SQ20051005320
公开日2005年11月9日 申请日期2005年2月6日 优先权日2005年2月6日
发明者蔡枫 申请人:浙江亚克药业有限公司, 蔡枫