专利名称：用偶联酶反应的最大瞬时速度测定靶酶活性的方法
技术领域：
本发明主要依据偶联酶反应达到稳态所需延迟时间效应，从而用偶联酶反应的最大瞬时 速度测定靶酶活性的方法，可用于生物医药基础研究、临床检验、环境卫生监测等领域。
发明的
背景技术：
当所需要测定活性的酶所用底物和产物都难以直接测定时，利用工具酶作用于对应的产 物以便可用常规设备简便定量产物生成的速度是一种实用方法，称为偶联酶法。常用的偶联 工具酶包括脱氢酶或其它生产显色产物的酶，以便通过脱氢酶等对靶酶产物的作用，使得脱 氢酶的指示底物或指示产物NADH(NADPH)发生变化，这样可连续监测NADH或NADPH吸 收的变化推算待测靶酶的活性。偶联酶法中也可使用过氧化物酶测定最终生成的有色产物， 但其反应通常不便于连续监测。偶联酶测定技术广泛应用于生物医药基础研究与临床检验， 例如偶联乳酸脱氢酶(LDH)测定谷丙转氨酶(ALT)活性，偶联苹果酸脱氢酶(MDH)测定谷草转 氨酶活性，同时偶联葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶两种工具酶测定oc-淀粉酶活性等。
根据经典初速度法分析偶联酶反应测定靶酶活性的基本理论，为了使得工具酶作用于可 直接测定物质造成的信号变化速度与反应体系待测定靶酶反应初速度成正比，即偶联酶反应 体系达到稳态，所用工具酶的活性通常需要很高，才能縮短偶联酶反应体系达到稳态所需要 的时间，减少反应体系达到稳态前指示底物的消耗而保障可测上限尽可能高。
使用单一工具酶时，通常所测靶酶活性线性上限不超过工具酶最大活性的1%,使得工具 酶的用量通常很大而成本很高才能达到所需要的线性范围。当使用多个工具酶时，成本就更 明显。因此，如何降低工具酶的用量而保障甚至拓宽线性范围，尤其是线性上限，对常规应 用偶联酶技术测定靶酶活性具有重要价值。
本发明依据偶联酶反应过程达到稳态所需延迟时间的现象，提出分析全过程的瞬时速度， 用最大瞬时速度表示靶酶活性的方法，从而在相同工具酶用量下显著提高偶联酶活性测定上 限，或者降低工具酶用量和对应成本获得相同的线性范围。
本发明所述的数据分析方法只适用于可连续监测反应过程的偶联酶反应体系，可用于临 床检验、生物医药的基础研究等。
发明内容
本发明利用偶联酶反应过程达到稳态需要较长延迟时间的现象，縮短连续监测反应过程 的记录间隔或插值縮短被分析数据的采样间隔，从而通过分析反应过程中的最大瞬时速度确 定待测靶酶的初速度(活性)，从而用相同量的工具酶显著提高偶联酶反应体系可测靶酶活性的 线性上限，或者显著降低工具酶的用量和成本而同时保留相当的可测耙酶活性的线性上限； 其优势在工具酶米氏常数越高时越明显，使用的工具酶越多则越明显。
分析模拟偶联酶反应数据发现，当原始数据中无离群值点时偶联酶反应过程中瞬时速度 先升后降，中间维持稳定，即反应体系处于稳态而瞬时速度基本不变，故采用抛物线方程拟 合瞬时速度在稳态或接近稳态区间的变化趋势确定抛物线顶点对应的最大瞬时速度。
本发明的核心是数据分析技术，除了要求被分析数据的采样间隔较短外，其余可以与经 典初速度法完全相同。但使用此方法保障所需的线性范围后，工具酶的用量可优化减少。例 如，对于测定谷丙转氨酶则使用与经典初速度法完全相同的实验条件以提高可测线性上限； 对于测定谷草转氨酶时则可降低工具酶用量也降低成本；对于偶联多个工具酶测定OC-淀粉酶 活性时则可使用完全相同的实验条件也显著提高可测靶酶活性的线性上限。
本发明的代表性应用过程包括如下步骤
(1) 按照与经典初速度法完全相同的条件准备偶联酶的反应体系，或者自行设计偶 联工具酶用量以降低工具酶成本；
(2) 启动反应30s内以不长于30s间隔连续记录反应过程(附图l和附图5);自动生 化分析仪上逐个分析时可10 S间隔采样，平行分析可用30 S或更长间隔；
(3) 共连续监测3.0到5.0 min内的反应过程数据；
(4) 判断采样间隔是否符合要求，如果采样间隔不长于10s则不需要进行插值处理，
如果长于19 S则需要进行插值处理以缩短采样间隔；
(5) 回归分析起点对应四个相邻数据点获得对应瞬时速度(用Excel分析如附图2);
(6) 依次对相邻四个数据点回归分析，判断回归分析的决定系数是否符合要求，获 得回归分析符合要求的反应过程瞬时速度变化趋势图(附图3和附图6);
(7) 选择反应1.0min后且越过最大瞬时速度下降过程中与初始速度相当的瞬时速度 为止点，抛物线拟合确定顶点对应的最大瞬时速度(附图3);
(8) 上述分析过程都可用专用程序或在Excel等通用软件中实现。
图1纯化ALT偶联1200 U/L LDH反应过程中340 nm吸收变化
图2用Excel分析图1中所记录反应过程的数据转换列表
图3分析图1中数据对应的瞬时速度变化趋势和抛物线拟合图
图4测定纯化ALT的初速度对反应体系标定的纯化ALT量响应曲线
图5临床血清标本中ALT偶联1200 U/L LDH反应过程中340 nm吸收变化
图6分析图4中数据对应的瞬时速度变化趋势和抛物线拟合图具体施例方式 实施例l:分析纯化ALT偶联LDH反应过程测定ALT活性
1. 实验反应曲线的记录
(1) 釆用与经典初速度法分析ALT偶联LDH完全相同的实验条件，包括温度、底物、工 具酶及预反应消除杂酶的可能干扰等(细节参见叶应妩，王毓三.《全国临床检验操 作规程》.第二版.江苏东南大学出版社，1997, pp204-206);
(2) 加入a-酮戊二酸启动ALT反应后30 s开始，以5间隔连续监测反应过程中340 nm吸 收的变化；用5 s间隔记录5.0min内的反应过程吸收变化(附图1)。
2. 反应过程的数据分析
(1) 如用10 s以上间隔监测反应过程，则通过三次多项式插值，对每三个原始记录点进 行插值达到记录间隔为5s;
(2) 用记录间隔为5s的数据，从第二个数据点开始回归分析四个相邻点获得瞬时速度；
(3) 用Excel分析每四个相邻点的瞬时速度(附图2);
(4) 用回归分析决定系数不小于0.95瞬时速度作趋势图，从第一个点到其下降到相当的 点间用抛物线拟合，用抛物线顶点对应的最大瞬时速度表示ALT活性(附图3);
(5) 测定所得ALT初速度对纯化ALT量响应曲线(附图4,线性上限可达到80U/L)。 实施例2:分析临床血清标本中ALT偶联LDH反应过程测定ALT活性
1. 实验反应曲线的记录
(1) 采用与纯化ALT完全相同的实验反应条件；预反应消除杂酶的可能干扰；
(2) 加入a-酮戊二酸启动ALT反应后30s开始，以5 s间隔连续监测5.0 min反应过程中 340nm吸收的变化(附图5)。
2. 反应过程的数据分析
(1) 从第二个数据点开始回归分析四个相邻点获得瞬时速度；
(3) 参照纯化ALT反应过程分析方法，依次分析每四个相邻点对应的瞬时速度，确认回 归分析的决定系数不小于0.95瞬时速度采用于后续分析；
(2) 从第一个瞬时速度点到其下降到相当的点间用抛物线拟合，用抛物线顶点对应的最大 瞬时速度表示ALT活性(附图6)。
权利要求
1、一种数据分析方法，用于通过回归分析采样间隔较短的偶联酶实验反应过程数据确定最大瞬时速度表示偶联酶反应体系靶酶活性；
2、 按照权利要求1所述，此数据分析方法的特征在于(1) 适用于分析偶联一个或多个工具酶的偶联酶反应过程；(2) 此类可适用的偶联酶反应需要连续监测其反应过程；(3) 所用数据分析方法主要是插值、回归分析和抛物线拟合求顶点对应的最大值；(4) 被分析偶联酶反应过程采样间隔应较短，用较长采样间隔则需通过插值获得采 样间隔较短的反应数据再用此方法进行分析；
3、 按照权利要求1和权利要求2所述，此数据分析方法的特征在于-(1) 可直接分析的实验反应过程数据记录间隔应不长于10 s;(2) 当所记录实验反应过程数据的间隔长于10 s后，通过样条差值、多项式插值等 方式获得采样间隔不长于10 s的反应过程数据再用此方法进行分析；(3) 此数据分析方法对应原始实验数据采样间隔不宜长于30s，否则优势会减弱；
4、 按照权利要求1和权利要求2所述，此数据分析方法的特征在于(1) 适用于偶联工具酶的酶反应过程数据分析，其对偶联工具酶的数量没有明显限 、帝U，但偶联工具酶越多时记录反应过程的总时间应越长，否则其应用中的优势会减弱；通常记录总时间在3.0 min到6.0 min;(2) 所适用偶联酶反应过程必须连续监测，故所偶联工具酶中常用脱氢酶以便检测 底物NADH(或NADPH)或产物NADH(或NADPH)跟踪反应过程；(3) 所适用偶联酶反应过程也可用其它便于连续检测产物或底物变化的工具酶；(4) 可用吸收、荧光、发光、电化学等能获得可靠信号变化的技术监测反应过程；
5、 按照权利要求1到权利要求3所述，此数据分析方法的特征在于(1) 连续记录偶联酶反应过程延迟时间不宜长于30 s，可启动反应20 s后就开始记 录反应过程；如记录延迟时间长于30 s会降低此数据分析方法的优势；(2) 通常可从第三记录数据点开始分析；如连续记录反应过程的延迟时间长于30s 且记录间隔长于10s，从第二个记录数据点开始分析；(3) 对实验所得或通过插值所得采样间隔不长于10 s的反应过程数据，从前述的被 分析起点开始，通过回归分析确定相邻四个记录数据点对应的平均速度作为这 四个相邻数据点中第一个点对应的瞬时速度；依此类推分析整个过程的瞬时速 度；被分析偶联酶反应过程数据中最后三个数据点不进行分析；(4) 回归分析任意相邻四个数据的决定系数需大于0.95，否则需确认被分析数据点 对应原始数据是否为离群值(outlier);如果是离群值点则此瞬时速度在随后抛 物线拟合确定最大瞬时速度过程中应被略去；(5) 抛物线拟合瞬时速度的变化确定最大瞬时速度；抛物线拟合范围是从最初瞬时 速度到1.0 min以后且瞬时速度下降到与最初瞬时速度相当的位置，使得被拟 合区域内的瞬时速度基本成钟罩型变化；用抛物线拟合此段钟罩型数据获得其 变化方程，确定抛物线顶点对应最大瞬时速度表示靶酶活性此抛物线拟合瞬 时速度变化趋势可消除实验测定数据中离群值点带来的影响；
6、 按照权利要求1到权利要求5所述，此数据分析方法的特征性应用过程在于(1) 按照与经典初速度法完全相同的条件准备偶联酶的反应体系，或者降低工具酶 用量以降低成本而保障相同的线性范围；(2) 启动反应30 s以内开始以不长于30 s间隔连续记录反应过程；在自动生化分 析仪上逐个分析时可用10 s采样间隔，而平行记录则常用30 s或更长间隔； 在普通分光光度计上可用5 s左右的间隔采样；(3) 共记录3.0到6.0 min;如果采样间隔不长于10 s则不需要进行插值处理，如 果长于10 s则需要进行插值处理获得采样间隔不超过10 s的数据；(4) 从所定起点开始，回归分析数据获得反应过程中瞬时速度，判断决定系数；(5) 确定抛物线拟合范围，以抛物线顶点对应的最大瞬时速度表示靶酶活性;
7、 按照权利要求1到权利要求3所述，此数据分析方法的应用特征包括(1) 除了记录间隔较长时需要进行插值获得所需数据需要专用程序外，其他的数据 分析过程可用专用程序，也可在如Excel等通用软件中实现。(2) 此数据分析方法用于分析偶联酶反应过程可显著降低工具酶用量而提高靶酶 活性测定的线性上限；通常用单一工具酶时靶酶活性线性上限可达工具酶的 10%，工具酶对中间底物的亲合力越低(即其米氏常数越高)，则优势越明显； 使用的工具酶越多则优势也越明显。(3) 此方法可用于分析临床检验领域测定血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、a-淀粉酶 等偶联脱氢酶为工具酶的偶联酶反应体系，从而显著提高这类偶联酶反应体系 测定靶酶活性的线性上限而保留与经典初速度法相当的线性下限。
全文摘要
本发明为用于生物医药领域偶联酶反应测定靶酶活性的数据分析方法；在延迟不超过30s后以不长于10s间隔记录偶联酶反应过程或插值获得采样间隔不长于10s反应数据，回归分析相邻四个数据点对应平均速度为第一个点瞬时速度；分析瞬时速度随反应进行的变化，用抛物线拟合从第一个瞬时速度到反应1.0min以后且已越过最高点并下降到与第一瞬时速度相当的瞬时速度之间的数据，用抛物线顶点的最大瞬时速度表示靶酶活性；此数据分析方法用于偶联酶反应测定靶酶活性可显著提高线性响应上限或降低工具酶用量，偶联工具酶越多则此数据分析方法优势更明显；用于分析与经典初速度法完全相同实验条件下的谷丙转氨酶偶联乳酸脱氢酶反应曲线可将线性响应上限提高1倍以上。
文档编号C12Q1/32GK101597636SQ200910104280
公开日2009年12月9日 申请日期2009年7月8日 优先权日2009年7月8日
发明者于明安, 刘北忠, 娟 廖, 飞 廖, 杨晓兰, 宇 桑, 谢燕玲, 赵运胜 申请人:重庆医科大学