电子监测生物指示器的基于偶联酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及测试灭菌处理的效力的生物指示器，更具体而言，涉及监测此类生物 指示器的基于偶联酶的方法，在所述方法中，可通过电子方式实施此类监测。
【背景技术】
[0002] 生物指示器（BI)是最重要的指示器种类之一。生物指示器最高程度地确保了处 理器内或所处理的载荷（load)自身满足灭菌条件。这种类型的生物指示器意在通过在指 示器内或在指示器上提供极大量的对所述特定处理具有高度抗性的生物体来代表处理系 统的最坏情形。通常细菌芽孢是选择用于监测灭菌系统的生物体。
[0003] 生物指示器通常由接种到载体材料上的微生物组成。所述微生物通常是细菌芽 孢，已知所述细菌芽孢对待在其中使用它们的特定灭菌介质极具抗性。将载体连同医疗器 械载荷一起置于灭菌循环中。在该循环完成后，孵育生物指示器，并监测其生长情况最多至 7天。生物指示器的生长指示灭菌处理不足以达到完全灭菌，而且该医疗器械载荷在使用前 需要进行重新处理。生物指示器无生长证实了灭菌器内的条件足以至少杀死载荷到指示器 上的细菌芽孢数目（例如，IO 6个细菌芽孢），因此，在一定程度上确保了医疗器械载荷是无 菌的。可惜的是，许多医疗器械在使用者获知完全孵育的结果之前实际上已投入使用。因 此，在医院环境下需要在最短的可能时间内检测活的萌发的生物指示器芽孢。
[0004] 历史上，对活生物指示器的检测依赖于可视的检测手段。通过生长培养基中的浊 度来证明可看到/检测到活生物体的生长和增殖。这种浊度可耗费数天以变为可注意到 的。另一种可视的且更为常见的检测手段是采用比色PH指示剂。当活生物体开始代谢并 且耗尽在生长培养基中提供的营养来源诸如糖类时，它们排泄出酸性排泄物。随着这些酸 性排泄物在生长培养基中累积，系统的PH降低，如果存在pH指示剂，则导致生长培养基的 颜色变化。通过这种手段实施的检测通常耗费18-48小时。
[0005] 最近以来，通过向生长培养基添加荧光性酶底物，使用荧光来检测所关注的生物 体产生的酶的活性。这种更新的方法将孵育时间从数天缩短至数小时。但是，缩短孵育时 间超出荧光方法所见的范围的主要局限性是对于包括塑料小瓶和生长培养基在内的生物 指示器的许多组件天然产生的内在背景荧光。真实的、可检测的信号必须高到足以与这种 内在的天然背景荧光区分开。因此，为增加系统的灵敏度，需要减少背景荧光（噪音）或者 转为使用具有更高灵敏度（信号）的不同技术。
[0006] 因此，在现有技术中，生物指示器依赖于比色或者荧光手段来测定活力。检测受到 产生的信号（不论是比色信号还是荧光信号）需要高于基本背景水平的限制。这导致对活 生物体的检测时间为数小时到数天，以便使信号累积到足以高于背景水平的可检测水平。 对于医院和患者而言，使生物指示器中活生物体的检测时间为数分钟或者更短时间是有益 的。
【发明内容】
[0007] -种允许控制信噪比的方法是电检测。监测系统电性质的变化是监测该系统内其 它变化的一种灵敏手段。然后，可通过适当的电子电路调控所得的电输出，以提供与产生它 们的试剂成正比的放大的且滤过的信号。
[0008] 本发明提供生物指示器中活微生物的快速检测方法，所述方法使用一种基于偶联 酶的电子检测方法来检测因复杂糖（二糖、寡糖和/或多糖）的酶分解所得简单糖（单糖） 的累积。注意到，本文使用的术语"糖（sugar)"可与"糖（saccharide)"可互换使用。本发 明的基于偶联酶的系统包括活芽孢中存在的至少一种天然存在的糖苷酶和一种氧化酶的 组合；或者活芽孢中存在的至少一种天然存在的糖苷酶和一种脱氢酶的组合。为灭菌后芽 孢提供的孵育或生长培养基具有复杂糖，如二糖、寡糖和/或多糖，但是不含简单糖。糖苷 酶与添加到生长培养基中的复杂糖反应，并将其分解为简单糖，包括例如至少一个葡萄糖。 通过氧化酶或脱氢酶作用于简单糖产物，产生电子转移，作为其对单糖作用的一部分。电子 转移的量与活芽孢所产生的简单糖的量成比例。可通过电子方式监测和测量自由电子的转 移。如果电子监测检测到电子转移，这意味着至少一些芽孢是活的，并在灭菌处理中存活， 因此，表明灭菌不是有效的。酶可以是在标准的现有技术水平血糖监测装置中使用的酶，事 实上，已知的现有技术水平下的血糖监测装置能够容易地调整适用于测定合并培养基中任 何葡萄糖或简单糖的存在。因此，本发明允许使用设计用于监测糖尿病患者的血糖水平的 标准的现有技术水平装置通过一种可简单实施并通过电子方式测量的极具特异性的、极为 灵敏的方法来测定灭菌处理的效力。
[0009] 因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种灭菌指示器系统，包括：
[0010] 瓶（Vial)，其包括：
[0011] 第一隔室，其包含一种或多种微生物的芽孢；
[0012] 第二隔室，其包含生长培养基，所述生长培养基包含能够被一种或多种微生物的 萌发细胞转化为单糖的二糖、寡糖或多糖中的一种或多种，并且
[0013] 其中所述瓶不含单糖并被调整适于在所述瓶已暴露于灭菌剂后合并第一隔室的 内容物与第二隔室的内容物以进行孵育；
[0014] -种酶，能够作用于所述单糖并产生电子转移，被设置在至少两个电极上，所述电 极被调整适于携带所述酶作用于单糖时因电子转移而产生的电信号，其中所述至少两个电 极的位置被设定为在孵育期间和/或孵育后接触合并的第一隔室和第二隔室的内容物；以 及
[0015] 一装置，所述装置连接或者可连接至所述至少两个电极并被调整适于检测和测量 所述酶作用于单糖时因电子转移而产生的电信号。
[0016] 在一个实施方式中，所述一种或多种微生物包括嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophiIus)和萎缩芽抱杆菌（Bacillus atrophaeus)中的一种或 两种。
[0017] 在一个实施方式中，所述二糖是麦芽糖，所述单糖是葡萄糖。
[0018] 在一个实施方式中，所述二糖是麦芽糖，所述麦芽糖在合并的第一隔室和第二隔 室的内容物的孵育期间被萌发细胞产生的或在萌芽细胞中存在的葡糖苷酶转化成葡萄糖。
[0019] 在一个实施方式中，所述酶与一种或多种介质（mediator) -起提供。在一个实 施方式中，一种或多种介质包括二茂铁、乙烯基二茂铁、1，1' -二甲基二茂铁、羧基二茂铁、 1，1' -二羧基二茂铁、（二甲基氨基）甲基二茂铁或亚铁氰化物中的一种或者两种或更多种 的混合物。
[0020] 在一个实施方式中，所述至少两个电极包括石墨、石墨烯、碳、碳纳米管、金、铂、 钯、银、镍或铜或其任意两种或更多种的组合或合金。
[0021] 在一个实施方式中，所述酶是葡萄糖氧化酶。
[0022] 在一个实施方式中，所述酶是葡萄糖脱氢酶。
[0023] 在另一实施方式中，本发明涉及一种测定灭菌处理的效力的方法，其包括：
[0024] 提供如上文所描述的灭菌指示器系统；
[0025] 使灭菌指示器暴露于意图杀死一种或多种微生物芽孢的灭菌处理；
[0026] 合并第一隔室和第二隔室的内容物；
[0027] 使合并的内容物暴露于被设置在两个或更多个电极上的酶，同时孵育合并的内容 物；
[0028] 采用连接至电极的装置，检测和测量所述酶作用于单糖时因电子转移而产生的任 何电信号；以及
[0029] 确定所述灭菌处理是否有效。
[0030] 因此，本发明提供了一种优雅且简单的解决快速测定灭菌处理的效力的问题的方 案，并且提供了适于此类用途的装置。
【附图说明】
[0031] 本发明可与多种灭菌指示器装置一起使用。附随的附图旨在提供适宜的灭菌装置 的示例性的、非限制性的描述，并展示所公开的方法，用于更好地理解本发明的目的，而不 是意图以任何方式对此进行限制。在随附的附图中，相同的部件和特征可以