使用细胞学和免疫学的生物学样本评估方法
【专利说明】使用细胞学和免疫学的生物学样本评估方法
[0001] 本申请要求2013年4月11日提交的美国临时申请61/811，034的权益，其内容通 过引用整体并入本文。
【背景技术】
[0002] 将从生物学样本获得的细胞因子和细胞学信息组合为预测不典型增生会进展到 癌症的风险的方法。
[0003] 1.不典型增生（dysplasia)的筛查
[0004] 临床医学中一个众所周知的问题是，虽然癌前病变（不典型增生）是比较常见的， 但是只有这些病变的一小部分进展到真正的癌症。
[0005] 在缺乏可靠手段去区分有可能和不能进展到癌症的病变的情况下，临床医生通常 采取保守方法，并积极治疗超出某些异常阈值的所有病变。这种保守的方法的一个缺点是 相当一部分的患者接受不必要和/或过度积极的治疗，其中许多已知产生严重的副作用。 第二个缺点是，这种不必要的治疗消耗大量有限的医疗资源，从而将这些资源从别的病人 转开，而所述别的病人从这些资源可以获益更多。因此需要一种手段来将有可能进展到癌 症的癌前病变和那些不能的区分开。
[0006] 疾病筛查方案的一个挑战在于，所用测试必须能够迅速、准确、有效地检查大量无 症状的个体，以便检测出那些少数呈现具有所述疾病或前兆状况的亚临床迹象。换句话说， 疾病筛查是在罕见的事件检测中的工作，其中所使用的测试必须足够灵敏以检测出疾病的 亚临床表现，和具有足够特异性以准确地将这些表现与其它原因导致的相似表现区分开。 另外的因素是，特别是在癌症筛查领域，开始后，该疾病并不总是进展到成为有症状的点， 而可能会停止在某一点，甚至退行恢复正常。
[0007] 宫颈癌筛查和后续追踪异常筛查结果提供了癌症筛查成功的有纪录的可论证地 最佳例子。与大多数筛检类似，对大量无症状的患者人群进行宫颈癌筛查，以鉴定这些人中 的有可能受益于治疗或其他适当干预那少数成员。因为大量的无症状个体必须进行筛选， 以鉴定表现出目标疾病状态的少数，物流和经济学在筛选程序的部署和操作中发挥关键作 用。特别是，被筛选的大量个体决定了样品收集和测试的物流是高效率的。异常筛查结果 确认相关的高成本以及甚至更高的治疗成本（如果异常结果被确认）也对筛选过程施加严 格的要求，包括筛选测试是高度特异的，并且筛选成本的最小化。
[0008] 20世纪40年代中期以来，宫颈癌筛查已经使用巴氏试验进行，其中从各个体收集 的细胞进行细胞学检查，以鉴定含有表现出预示不典型增生或癌症存在的形态学异常的细 胞的那些样品。从其获得细胞学异常样本的病人接受追踪检查，通常是通过对活检获得的 组织样品进行组织学检查，以确认该异常的存在，并且如果确认，诊断存在的特定的疾病状 态。接着，此诊断提供治疗计划和递送的基础。
[0009]目前，宫颈癌筛查是基于从子宫颈获得的鳞状上皮细胞以及，在某些情况下，颈管 细胞的形态评估。在该检查的最初形式中，细胞是子宫颈已脱落细胞，但自从20世纪40年 代晚期以来，细胞已经通过用抹刀、刷子或扫帚装置刮子宫颈获得。样品收集方法的这一改 变的主要原因是要获得富含宫颈鳞状上皮细胞的"更干净"的样品，用于形态学评估。直到 90年代初，这些样品通常涂到载玻片上以准备细胞学评估。虽然这种玻片制备方法简单而 有效，然而所得到的样本通常含有细胞簇和细胞丛、黏液、细菌、真菌、酵母以及可能损害具 有临床价值的上皮细胞检查的非上皮细胞。
[0010] 在20世纪90年代后期，涂片开始被"单层"（或"液体基"）制备物取代，所述制 备物通过更好地分散上皮细胞帮助样品评估，同时通过玻片制备过程中的纯化步骤，消除 或显著减少载玻片上粘液的量和非上皮细胞的数目。当前这些由世界范围内的医学会和国 家卫生部门认可的单层制备方法，占美国和英国的宫颈癌筛查样本的80%以上，以及占世 界范围的宫颈筛查样本的很大部分，且正在增长。
[0011] 由世界卫生组织公布的统计数据表明，宫颈癌的发病率因国家而异，一般在 0.02-0. 1%的范围内。巴氏试验是迄今为止世界范围内宫颈癌筛查使用的主要方法。在此 检测中，从子宫颈收集的鳞状上皮细胞在细胞学上检查，观察到的此中任何形态异常的细 胞，按国际公认标准（Bethesda)分类。
[0012] 这些类别是：
[0013] (a)在正常范围内（WNL):没有显著异常。
[0014] (b)显著性待定的非典型鳞状上皮细胞（AS⑶S):主要在美国使用的类别，细胞呈 现不落入其它分类的相对较小的形态异常
[0015] (C)低度鳞状上皮内病变（LSIL或LGSIL):与不典型增生一致的中度形态学异常。 呈现出与病毒感染一致的形态变化的细胞也可包含在此类中。
[0016] (d)高度鳞状上皮内病变（HSIL或HGSIL):重度不典型增生形态异常。这一级别 的护理标准通常规定积极医疗干预。
[0017] (e)癌症。
[0018] 虽然数字某种程度根据患者人群有所不同，现实的粗略估计是，发达国家中，宫颈 癌筛查结果由大约90%的WNL、9%的ASCUS+LSIU0. 9%的HSIL以及0. 1%的癌症组成。 这一数字表明，仅有一小部分宫颈不典型增生实际上会进展到癌症。这受到得到确认的观 察支持，大部分不典型增生被人体自发清除而无需治疗性干预。需要准确预测不典型增生 可能进展为癌症的方法，以最好地运用稀缺的医疗资源。还得到确认的是，当活检用于确认 时，灵敏度（被检测出不典型增生的百分比）（特异性是照此正确鉴定的哺乳动物的百分 比；特别是假阳性率为1)。
[0019] 从操作角度来看，70%的灵敏度意味着所筛查人群中大约1/3有宫颈非典型增生 或宫颈癌的个体没有由巴氏试验检测出来。由此明显需要提高用于宫颈癌筛查的测试灵敏 度。与此类似，70%的特异性意味着，大约1/3测试分类为具有不典型增生或癌症的情况， 不能确认以及通常重新分类为WNL。除了这种误分类的情感影响，这些假阳性结果具有显著 的经济影响，因为鉴定该组中的真阳性案例所需要的跟踪测试在所要求金钱和医疗资源上 远远贵于最初的筛查。考虑到世界范围内的可用医疗资源的严重限制，在追踪假阳性筛查 结果花费资源意味着，可以筛查的个体更少，用于治疗真阳性的不典型增生或癌症的个体 的可利用资源更少。需要提高宫颈癌筛查测试的特异性。
[0020] 尽管前面的描述集中于宫颈癌筛查，这些和其他类似的考虑和需要适用于其它癌 症的筛查程序，例如，但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌和膀胱癌。
[0021] 以前的提高灵敏度和特异性的尝试集中在开发用于检测可以与不典型增生的存 在相关的"标志物"的测定，改进的形态评估的方法，以及使用替代指标。标志物是细胞表面 或胞内分子，如果细胞过程被破坏，这些分子的浓度显著增加或减少。到目前为止已使用的 标记物几乎全是蛋白质，但是偶尔探索使用少量别的类型分子，如脂质和寡核苷酸。虽然许 多这些以标记物为基础的测试提供高灵敏度，但其特异性往往受限，因为这些标志物是细 胞的正常组分和在正常和常规细胞过程中发挥作用。这些标记物也不孤立表达，而是作为 一个高度互连的细胞进程网络中的元件，其中引起一个标记物表达变化的因素可对许多其 他标志物的表达有多重影响。在这一方面，参与常规细胞维持和修复的网络已被证明是特 别麻烦的。当前最有成效的以标志物为基础的方法集中在多个标志物的表达的相关性，而 不是在一个单一的标志物的表达。有限的成功有时也通过精确定量单个细胞中标志物表达 水平来实现。除了进行必要的定量测定的众多技术挑战，正常的个体间甚至样本内可变性 使确定所需标志物表达的真正背景或参照水平（用于确定是否测量的表达变化是显著的） 非常具有挑战性。类似的挑战和限制存在于使用改进形态评估方法，其大部分是基于各种 自动图像分析的方法。这一方法中，修复细胞过程以及对在样本制备和成像中异乎寻常严 格的工艺控制的需要是特别麻烦和苛刻。
[0022] 上述的挑战和限制，导致探索使用替代标志物检测癌变和癌前状态。可以说这些 方法中最先进的是使用HPV测试进行子宫颈癌筛查。此用途是基于所观察到的一个或多个 HPV病毒的"高风险"（致癌）毒株感染，和HSIL/癌症（）之间的强相关性（>90% )。支持 这种方法的论据是，因为HPV病毒本身，以及由它在细胞中产生的各种蛋白质和其他分子， 都是外来的，所以基于此方法的测试不受许多上述限制的约束。虽然由一个或多个致癌毒 株造成的HPV感染和不典型增生直到并包括癌之间有很强的相关性，但本领域众所周知， 只有极少数的这类感染实际上进展到HSIL阶段及更少的进展到癌症。因而虽然HPV检测 是高度灵敏的，它们的假阳性率通常报道是在40-60%的范围。在文献中的几个报道最近建 议，HPV诱发不典型增生进展为癌症不是感染本身的直接结果，而可能是发生在细胞内的病 毒传播过程中，比较少见的随机误差的反映。这转而又导致建议用HPV蛋白E6和E7表达 增加作为标志物，所述E6和E7似乎与HSIL及癌症具有更好的相关性。然而这种方法受到 与上述类似的限制，因为E6和E7的表达是HPV的生命周期的正常部分，因而其本身本质上 不决定细胞将进展到癌症。
[0023] 早在19世纪50年代，有人观察到，获得某些危及生命的感染然后痊愈的一些癌症 患者中的肿瘤，缩小甚至完全消失。还观察到，，实体瘤的相当大比例，一些情况下超过50% 的质量是由白血球组成。最近已确定，这些肿瘤浸润淋巴细胞（TIL类）主要包括T细胞、 NK细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、巨细胞和其他组成先天免疫系统的细胞。其它研究已 经表明，这些细胞的主要功能是检测、攻击和破坏不需要的、损坏的、外来的、感染的和其它 的异常细胞。
[0024] 2.人体免疫系统的相关方面
[0025] 虽然人的免疫系统的结构、它的调控、其与癌症的关系尚未被完全理解，但是属于 本发明的几个点可以概括为：
[0026] (a)免疫系统和癌症之间的相互作用是复杂的，且还未被很好地理解。这些相互 作用的范围可以从免疫系统攻击和破坏癌细胞到进入癌症耐受状态，或甚至积极促进的状 态。也有一个大的和增长的身体的证据，发展中的癌症可以通过大量的方法调节相应的免 疫反应。
[0027] (b)新出现的不典型增生和癌细胞最初被检测出，以及通过效应T细胞、NK细胞、 巨噬细胞和先天免疫系统的其他细胞中和或破坏。这通常被描述为基于所产生的各种细胞 因子的炎症反应。
[0028] (C)可以生成对所述癌症的B细胞（抗体、体液）应答。
[0029] (d)如果癌症及时清除，免疫应答回复到其静止的监视状态，留下敏化的记忆T细 胞和B细胞，如果另一个类似癌症随后被检测出，可以迅速响应。
[0030] (e)如果癌症仍然存在并未及时清除，免疫系统的某些细胞可以经历表型转变，所 述转变减少或终止在癌症的附近的免疫应答。已被报道的转变包括：
[0031] 辅助性T细胞从Thl表型转变（表达促炎细胞因子，促进免疫应答）为Th2表型 (表达抗炎性细胞因子和抑制免疫应答）。
[0032] 部分T细胞群采用了调节性（Treg)表型，可以局部抑制先天性免疫应答。关于调 节性B细胞（Breg)所知甚少，其似乎是在Tregs之前或同时产生，以及局部抑制免疫应答。
[0033] 一部分局部巨噬细胞从Ml型（积极）转变成M2型（耐受