）
[0034] 除了局部抑制局部免疫反应，Th2辅助T细胞、Treg、M2巨噬细胞和Breg分泌抗 炎性细胞因子可以促进血管生成和其它有利肿瘤增殖的方面。
[0035] 癌细胞可表达抗炎性细胞因子，包括但不限于，白介素-10 (IL-10)。这些细胞因子 的某几个，尤其是IL-10,通过抑制干扰素γ (IFN-γ)、IL-2和IL-12的生成，下调癌症特 异性免疫应答。这导致其它抗炎性细胞因子如IL-4和IL-6表达提高，通过肿瘤细胞表面 的主要组织相容性复合物（MHC)的肿瘤抗原的展示减少，以及通过树突细胞和其他抗原递 呈细胞的肿瘤特异性抗原递呈的抑制。
[0036] 先天免疫系统的某些细胞，尤其是T细胞和NK细胞，各自检查由细胞（包含其附 近的组织）展示的细胞表面标记物，以确定它们的状态。检测出展示一系列异常标志物细 胞触发T细胞或NK细胞的旨在破坏异常细胞的细胞溶解和细胞毒性反应。同时，这些细胞 释放多种细胞因子和趋化因子吸引巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞和先天免疫系统的 其它细胞到此，并激活它们继续破坏异常细胞和清除产生的碎片。某些干扰素和与靶细胞 直接相互作用的其他分子也可被释放。因而，异常细胞的破坏通常进行得迅速而有效，但是 在一些情况下不足以完全消除病变。
[0037] 具报道（主要来自对自身免疫性疾病的发生的研究），过长时间的上述类型的炎 症免疫应答可导致活化的免疫细胞破坏，随后攻击原发病灶的附近的正常细胞。为了防止 这种类型的不良附带损害，当靶细胞被破坏时，或如果炎症反应过长，提供并触发非常有效 的终止炎症免疫反应的手段。正如免疫应答的攻击阶段主要是由促炎细胞因子介导，终止 阶段很大程度上由抗炎性细胞因子介导，两者之间的平衡由存在的各种类型的免疫细胞之 间的相互作用的复杂网络控制。最近对于使用活化的T细胞、NK细胞和树突细胞作为癌症 治疗剂的研究，揭示促炎和抗炎性细胞因子之间的平衡也可通过靶细胞本身进行调制。特 别是已经发现，在许多情况下，不典型增生和癌细胞能够表达和释放足够量的抗炎性细胞 因子抑制或终止对其的免疫攻击，并局部迫使先天免疫系统进入静止状态的。施加这种局 部的免疫抑制状态被认为对于允许不典型增生或癌症的进展是必要的且充分的。
【发明内容】
[0038] 本文公开增强生物学样品癌症检测的评估的方法。除了传统上在样本的以形态为 基础的细胞学筛查中所考虑的的细胞类型，本文公开的方法添加某些细胞类型和细胞因子 的评估，他们传统上在筛选过程中轻视或忽略。
[0039] 靶细胞是被评分为"正常"、"不典型增生"或"癌"的细胞。例如，上皮细胞通常是 宫颈癌筛查的靶细胞。
[0040] 在单层样品制备中被剔除或数量明显减少的细胞类型有淋巴细胞（T细胞和B细 胞）、嗜中性粒细胞、树突细胞和巨噬细胞。虽然这些细胞类型，如果大量存在在涂片样本 中，偶尔被认为感染指标，如阴道炎，但就宫颈癌筛查而言历史上他们是被忽略的。正是这 些历史上和有意被忽略的细胞，以及与它们相关的某些细胞因子，是本文所要求保护的公 开的材料和方法的基础。
[0041] 公开监控先天免疫系统在该生物样品收集区域的状态的方法和组合物，以确定免 疫系统是否被局部地抑制，以及如果是这样，这种抑制是否被不典型增生或癌细胞强加或 增强。一些可能的通常结果，每一种承载不同的进展风险，可以设想为：
[0042] 1.正常状态指标为没有不典型增生/癌细胞和没有表达抗炎性细胞因子的细胞
[0043] 2.如果存在不典型增生或癌性细胞，但免疫和靶细胞都不表达抗炎性细胞因子， 表明正常的免疫应答。这可能表示轻度升高的风险。
[0044] 3.如存在免疫细胞表达抗炎性细胞因子，指示抑制免疫应答。如果存在的靶细 胞形态正常，并且不表达抗炎性细胞因子，则可以推测，异常引发的免疫应答已被成功地解 决。然而，如果存在异常的靶细胞，都不表达抗炎性细胞因子，可以解释为由于应答过长，免 疫系统进入静止状态，这些结果可以指示中等增加的进展风险。
[0045] 4.表达抗炎性细胞因子的靶细胞和免疫细胞都存在说明免疫系统被强制抑制。此 状态表不进展到癌症的尚风险。
[0046] 虽然临床上有用的信息可以从这些测试中简单地通过注意样本中的任何细胞是 否表达抗炎性细胞因子取得，如果存在的细胞被分类为在至少区分靶细胞和免疫细胞的水 平上的类型会更有用，而更加有用的是，如果不典型增生和癌细胞在形态学上检测以及，任 选地，分类。
[0047] 以风险评估为目的获得细胞学样本，而不是为了临床诊断。在组织学的程序中使 用的样本是组织切片，其中相当大的依赖于在包含在细胞和组织的细胞间质之间的三维空 间关系的信息。在另一方面，细胞学样本由分散细胞的二维排列组成，其中组织学样本里存 在的基质和其它细胞间质已被除去，并且剩余的细胞间的空间关系被有意破坏。由于缺乏 细胞间质和空间关系，这两者都被认为在不典型增生和癌症的分类和分期中是重要的，细 胞学样本通常被认为不适用于细胞进展到癌症的风险的评估。增加本文所公开的方法以提 高细胞学样本的价值。
[0048] 一种用于细胞学评估不典型增生进展为癌症的风险的方法，包括：
[0049] (a)将生物学样品制备为细胞学样本；
[0050] (b)检测和分类所述样本中任何不典型增生的细胞；
[0051] (d)检测所述样本中发现的任何细胞（正常或不典型增生的）中抗炎性细胞因子 的存在；
[0052] (e)评估（估计）存在于从其获得所述样品的受试者中的任何不典型增生进展到 癌症的风险，所述评估基于在可能在样本中的不典型增生或其他细胞中是否存在抗炎性细 胞因子。用于风险评估的合适的抗炎性细胞因子是IL-10。
[0053] 不典型增生细胞用一种或多种发荧光染料染色和在细胞形态基础上的检测和分 类。
[0054] 对T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或先天免疫系统的其他细胞进行额外地检测和分 类。
[0055] 公开了 一种免疫测定细胞学样本中的分析物的空间分布的方法，其中检测试剂包 括分别带有第一和第二标记的抗体。在本文中所用的"分析物"是分析下的任何化学物或 分子。使用这种方法以，例如，增强细胞因子的信号
[0056] (a)第一和第二标记的抗体可以特异性结合到一抗（未标记）；
[0057] (b)第一和第二标记显示出结合到样本上的不同的非特异模式；
[0058] (C)第一和第二标记在空间分辨模式下，可单个检测到；
[0059] 并且该方法还包括
[0060] (d)任选地，用未标记的一抗处理所述样本；
[0061] (e)用第一和第二标记抗体处理所述样本，标记的抗体同时施加到样本上；
[0062] (f)确定第一标记的抗体结合样本的位置；
[0063] (g)确定第二标记的抗体结合样本的位置；以及
[0064] (h)在空间上关联结合的第一和第二标记的抗体在样本上存在的位置；其中分析 物被认为存在在那些第一和第二标记的抗体以高度关联存在的位置，并且分析物被认为是 不存在于那些没有标记的抗体存在，或者仅一个标记的抗体存在，或两个标记抗体以低相 关性存在的位置。
[0065] 所述第一和第二标记可是荧光的。
[0066] 所述样本可进一步用荧光或发荧光的形态染料处理。
【附图说明】：
[0067] 图1显示在与抗体Alexa-594?和Alexa-647?结合的IL-10阴性的HSIL样品 (DlH)上的IL-10的免疫染色的结果；(A)正常和不典型增生的细胞，散点图（箭头指向染 红色的细胞）；(B)用Alexa-594? (绿色）NSB染色的细胞，R-G相关系数=0. 088 ; (C)用 為:lexa-:647.⑩（红色）NSB染色的细胞，R-G相关系数=〇. 67。
[0068] 图2是显示与抗体Alexa-594⑧和Alexa-647?结合的IL-10阳性HSIL样品 (D6H)上的IL-10的免疫染色结果的散点图；正常和不典型增生细胞（箭头指向染红色的 细胞）。
[0069] 图3表明细胞的假色图像：(A)、⑶其中非特异性结合用相同细胞的分色图像阐 明，所述图像显示（A) Alexa-594? (绿色）和（B) Alexti-647?)(红色）标记的二抗位 置的空间相关性差（〈〇. 08)。蓝色表示细胞核用DAPI染色；（C)、（D)、（E)显示（C) IL-10阳 性HSIL块、（D) HSIL c块-594染色、（E) HSIL块-647染色的特异性结合；（F)、（G)、（H)显 示（F) IL-IO淋巴细胞、（G) IL-IO淋巴细胞-594染色、（H) IL-IO淋巴细胞-647染色的特异 性结合。
[0070] 发明详述：
[0071] 1.临床原理
[0072] 公开了用生物学样本来预测患者是否处于增加的发展癌症的风险的方法。
[0073] 没有引起修复反应的癌症，感染或细胞损伤，细胞学样本中的细胞将有正常范围 内的形态，免疫反应指标如存在T细胞的存在，B细胞和巨噬细胞会很罕见。类似地，细胞 经历无关癌症或感染的损伤的正常修复将显示修复过程的形态变化特征和可能存在一些 巨噬细胞，但T细胞和B细胞不存在。然而，如果癌症、显著的癌前状态或感染存在，细胞将 呈现出独特的形态变化以及活性免疫应答（形式有效应T细胞，Thl型辅助T细胞，Ml巨噬 细胞和可能的其他先天免疫系统的效应细胞）的迹象。另一方面，中止的免疫反应的特征 是与Treg和（可能）Breg细胞、Th2辅助T细胞和M2巨噬细胞以及抗炎性细胞因子的产 生相结合的不典型增生。因此，由这些细胞产生抗炎性细胞因子，如IL-10,是中止的免疫应 答的指标，表明局部环境处于免疫抑制状态允许不利情况的进展。
[0074] 从临床角度看，细胞学样本中的的癌细胞的检测被认为是使立即确证性跟进和积 极干预显得必要，而对这些样本中的不典型增生（癌前）细胞的反应更有可能基于临床医 生对所述不典型增生进展成癌症的风险的评估。世界范围内的护理标准大部分使人相信， 高度不典型增生（HSIL)代表进展的高风险，因此使立即进行干预显得必要，而较低程度的 不典型增生代表低风险，并进行相应应对。然而，这个风险评估会被已知小部分的ASCUS和 LSIL会进展，以及相当部分的HSIL(有人估计60-90% )会自发退行这样的事实复杂化。因 此，在细胞学样本中更准确地评估从其获得所述样本的受试者中进展的风险的方法是可取 的。任何类型分泌IL-10的细胞的存在指示患者处于进展的高风险，并且不依赖于不典型 增生和其他风险因素的程度，如感染HPV的高风险（致癌）毒株。
[0075] 所公开的方法和组合物主要打算用于基于细胞学样本在癌症筛查环境中的评估 的风险评估，但它也可以用于活检样本以及用于诊断和患者管理。触摸制备物是用于此目 的的活检样本的一个特别方便的形式，但也可以使用其它形式，例如组织切片和分散的组 织。宫颈细胞学样品，如常规用于宫颈癌筛查的，将在以下描述中呈现。
[0076] 2.预测不A铟增牛将讲展到癌症的风险的方法
[0077] 预测不典型增生将进展到癌症风险的方法包括：
[0078] (a)检测细胞因子；
[0079] (b)鉴定不典型增