示，至少在某些癌症中，参与其他进展事件，例如抑制凋 亡和减少在MHC-I复合物上肿瘤抗原的展示。其它抗炎性细胞因子如TNF-β也可使用。检 测这些细胞因子的最方便的是通过免疫染色来完成。任何免疫染色的标准方法都可用。优 选的免疫染色形式使用未标记的一抗与焚光标记的二抗联用。利用焚光标记的一抗形式也 使用有效，但可能导致较低的信号水平，需要定制抗体标记。
[0144] 11.评估从患者得到的样本的不A铟增牛讲展到癌症的风险
[0145] 据推测，通过该方法评估样本主要包括HSIL加LSIL和AS⑶S的选定子集，其中患 者有额外鉴定的经典风险因子，如癌症的家庭或个人史、暴露在DES下或由致癌病毒（例如 高风险HPV株）持续性感染。
[0146] 在样本中的任何细胞里存在的抗炎性细胞因子，如IL-10,可以作为证据表明，局 部免疫反应正在发生或已经终止。如果样本的不典型增生细胞里，没有检测到抗炎性细胞 因子如IL-10的表达，合理假设，这个终止是对免疫系统的长期刺激的正常反应。既然不典 型增生仍然存在，有进展的中等风险。
[0147] 存在表达一种抗炎性细胞因子如IL-10不典型增生的细胞，可以作为证据表明， 局部免疫反应正在被积极抑制，病人因此处于进展为癌症的高风险，尤其是如果也存在调 节细胞。
[0148] 讨论
[0149] 细胞表达抗炎性细胞因子如IL-10并非罕见，即使是在基于形态被分类为HSIL及 癌症的样本里。这主要是由于使用传统的细胞收集方法，其通常收集T细胞、巨噬细胞和免 疫系统的其他细胞，仅附带收集到靶细胞类型。因为如果不是必要的，往往希望采用使用这 些传统的方法收集的细胞，来产生本文公开和要求保护的方法，有必要优化免疫染色试剂 和方法，以使靶细胞类型的检测最大化。各种各样的优化技术是本领域公知的，并且可以使 用。但是，荧光团如在本发明的实践中使用，已知倾向非特异性结合细胞成分，所述结合以 不能有效地通过标准优化技术控制的方式进行。出于这个原因，本发明的另一个方面针对 减轻这种非特异性结合对检测的灵敏度的影响。
[0150] 免疫测定中的非特异性结合是通过使用阻断剂、洗涤剂、离液剂和其他添加剂的 各种组合解决的。虽然这些方法通常有效地限制或抑制大多数类型的非特异性结合，其在 减轻非特异性荧光团对细胞成分的结合效率是不足够用于本发明的实践中。因此本方法使 用相关双染色，以解决这方面的不足。
[0151] 先前描述的免疫染色形式包括未标记的一抗结合标记的二抗被用在本说明书中。 进一步假设该标记是广泛使用Alexa?.系列中选出的荧光团。当用于在本发明方法的检测 中，它可以很容易地观察到，Alexa?系列的不同成员表现出不同模式的与细胞材料的非 特异性结合。因此，观察到的染色模式包括目标分析物的特异染色和非特异性荧光团结合 到细胞材料的叠加。如果使用不同的荧光团作标记，分析物特异性染色模式将保持不变，而 由于荧光团的非特异性结合的模式会发生改变。这种分析物特异性染色一致性与在荧光团 特定的非特异性染色的可变性结合提供了最小化分析结果上的非特异性荧光团结合影响 的方法。
[0152] 相关双染色利用等份的相同二抗，其中一个标记有第一荧光团，另一个标记有第 二荧光团。举例来说，第一等份用Alexa-647?标记，其具有在近红外光谱区的荧光发射， 第二个用Alexa-594?标记，其具有在红色光谱区的荧光发射。这两个标记的二抗在使用 之前被合并。
[0153] 如前所述，将样本首先用未标记的一抗处理，其特异性结合目的分析物。然后将样 本用组合的标记的第二抗体处理，样本的图像被捕捉在红色和红外光谱区。然后这些红色 和红外图像关联，以确定在其中分析物存在于样本的哪些区域。
[0154] 对于给定的区域，如果在红色和红外图像中都检测到低信号，没有染色发生在样 本的相应的位置，目标分析物在该位置不存在。
[0155] 对于给定的区域，如果在红色和红外图像中都检测到高信号，并且信号是相关的， 样本中的对应位置已被选择性染色，分析物存在于该位置。
[0156] 对于给定的区域，如果是在红色或红外图像检测到高信号，但不是在两个中都有， 样本中的对应位置已被非特异性染色，分析物不存在于该位置。
[0157] 图1是散点图，显示了 IL-10阴性的HSIL样品的IL-10的免疫染色的结果。检测试 剂包括特异于IL-10的一抗和由Alexa-594? (绿色荧光）标记的二抗和用Alexa-647?| (红色荧光）标记的相同的二抗的混合物。图I(B):细胞表现出红色和绿色的荧光之间的 低空间相关性（R-G相关系数=0.088)从而指示二抗的非特异性结合。主要为红色的荧 光表明，这些细胞的非特异性结合Alexa-647?标记的二抗优先于用Alexa-594?标记二 抗。图I(A):形态学正常和异常细胞呈现红色和绿色荧光之间的高空间相关性（R-G相关 系数>0.9)。这表明，两种标记的二抗特异性结合。在这一区域的低的荧光强度表示很少 或没有IL-10的存在于形态正常（黑色方块）或不典型增生（红色正方形）的细胞中。图 I (C):细胞表现出红色和绿色的荧光之间的低空间相关性（R-G相关系数=0. 67)从而指示 二抗的非特异性结合。主要是绿色荧光表明这些细胞非特异性结合了 Alexa-594?标记的 二抗优先于A lexa-647?标记二抗。
[0158] 图2是散点图，显示了 IL-10阳性的HSIL样品的IL-10的免疫染色的结果。这些 细胞的染色和说明在图1的图例所述。呈现高的红色和绿色荧光强度的细胞表示IL-10大 量产生和红色和绿色荧光之间的高空间相关性（R-G相关系数>0. 9)，这表明该二抗的结合 是特异的。
[0159] 图3显示的同一细胞颜色区分的图像显示了 Alexa-594? (绿色）标记的和 Alexa-647? (红色）标记的二抗，两者位置的强（>〇.90)空间相关性。蓝色表示细胞核 用DAPI染色。共定位的红色和绿色发射出现在这个图像上为黄色。IL-10阴性细胞在该图 像上显示为蓝色细胞核被绿色环绕（Alexa的594标记的二抗的非特异性结合）。
[0160] 表 1
[0161]
[0162] CN 105143882 A I兄明书 18/18 页
【主权项】
1. 一种用于估计受试者中不典型增生进展为癌症的风险的方法，该方法包括： (a) 检测和分类来自受试者的生物样品的细胞学制备物中的不典型增生的细胞； (b) 检测不典型增生的或非不典型增生的细胞中抗炎性细胞因子的存在；和 (c) 基于至少一种抗炎性细胞因子是否存在于样本中检测到的不典型增生的或其他细 胞中，估计受试者中不典型增生进展为癌症的风险；其中任何细胞都没有表达表明低风险， 由非不典型增生的细胞表达表明中等的风险，以及由不典型增生的细胞表达表明高风险。2. 权利要求1的方法，其中所述抗炎性细胞因子是IL-10。3. 权利要求1的方法，其中不典型增生的细胞用一种或多种发荧光染料染色和检测， 并基于细胞形态进行分类。4. 权利要求1的方法，其中，任选地，检测和分类T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或先天 免疫系统的其他细胞。5. -种用于免疫学测定分析物在细胞学或组织学样本中的空间分布的方法，其中，检 测试剂包含带有第一标记的抗体，和单独带有第二标记的抗体，所述方法包括： (a) 将所述样本与分别用不同标记进行标记的抗体接触，所述不同标记可以以空间分 辨的方式分别检测； (b) 用未标记的一抗处理样本； (c) 确定样本上第一标记的抗体结合的位置； (d) 确定样本上第二标记的抗体结合的位置； (e) 在空间上关联样本上结合的第一和第二标记的抗体存在的位置；其中所述分析物 被认为存在于那些第一和第二标记的抗体以高相关性都存在的位置，并且所述分析物被认 为不存在于那些标记的抗体都不存在，或者仅一个标记的抗体存在，或两个标记的抗体以 低相关性都存在的位置。6. -种用于评估细胞学样本的方法，该方法包括： (a) 制备细胞学样本，其来自包含靶细胞和附带收集的非靶细胞的细胞样品； (b) 将所述细胞学样本与一种或多种形态染料接触； (c) 基于形态检测、鉴定和分类存在于所述细胞学样本中的任何细胞和其他对象； (d) 用一种或多种免疫染料处理所述细胞学样本； (e) 检测一种或多种抗炎性细胞因子在所述细胞学样本中的任何细胞里的存在； (f) 基于细胞形态检测具有不典型增生、癌症、感染或其它疾病状态的指示性特征的靶 细胞的存在；和 (g) 基于检测组成细胞学样本的一部分细胞中的一种或多种抗炎性细胞因子的存在， 评估（f)中所鉴定的靶细胞进展到更不利的疾病状态的相对风险。7. 权利要求6的方法，其中所述靶细胞是上皮起源的。8. 权利要求6的方法，其中非靶细胞包括先天免疫系统的细胞，选自树突细胞、T细胞、 B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞的细胞，或其组合。9. 权利要求6的方法，其中所述形态染料是荧光的或发荧光的。10. 权利要求6的方法，其中所述免疫染料包含荧光标记的一抗，其选择性结合抗炎性 细胞因子。11. 权利要求6的方法，其中所述免疫染料包含未标记的一抗，其选择性结合抗炎性细 胞因子，并且随后通过用荧光标记的二抗处理而原位标记，所述二抗选择性结合所述一抗。12. 权利要求6的方法，其中所述免疫染料包含未标记的一抗，其选择性结合抗炎性细 胞因子，随后通过用第一二抗和第二二抗处理而原位标记，所述第一二抗选择性结合所述 一抗并用第一荧光团标记，所述第二二抗选择性结合相同的一抗并且用不同于所述第一荧 光团的第二焚光团标记。13. 权利要求5的方法，其中独立确定第一和第二荧光团在染色样本中的空间分布，并 且使这些分布空间相关联以区分特异性染色和非特异性染色的空间位置和对象。14. 权利要求6的方法，其中所述抗炎性细胞性因子是IL-10。15. 权利要求1和6的方法，其中所述抗炎性细胞因子选自TGF-P 1和2、IL-4、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-11、IL-13 和 IL-19。16. 权利要求1的方法，其中风险是通过以下方式确定的： (a) 正常进展风险，由不存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的细胞指 示； (b) 略微增加的进展风险，由存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的非靶 细胞指示； (c) 中等增加的进展风险，由存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的靶细 胞指示；和 (d) 大大增加进展风险，由存在显示可检出量的一种或多种抗炎性细胞因子的靶细胞 以及非靶细胞指示。
【专利摘要】将从生物学样本获得的细胞因子和细胞学信息组合为预测不典型增生会进展到癌症的风险的方法。本文公开方法以说明对用于癌症的所测试的来自受试者的生物学样品的评估。除了在样本的基于形态的细胞学筛选中所习惯上考虑的细胞类型，本文公开的方法在筛选过程中添加对某些习惯上不考虑或忽视的细胞类型和细胞因子的评估。
【IPC分类】G01N33/50
【公开号】CN105143882
【申请号】CN201480020796
【发明人】M·E·乔利, R·A·多马尼克
【申请人】塞托克尔公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2014年4月1日
【公告号】WO2014168788A1