一种基于双酶偶联高通量检测d-阿洛糖的新方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测D-阿洛糖的新方法。具体涉及利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联，检测D-阿洛糖。该方法既可用于液体培养基中反应产物D-阿洛糖的检测，也可用于检测固体培养基中反应产物D-阿洛糖的生成。当用于液体培养基的检测时，反应产物与N-（2-羟基-3-磺丙基）-3，5-二甲氧基苯胺钠（HSDA）作用产生蓝色水溶性醌类物质，利用96孔酶标板在583nm处读取吸光值。吸光值与其浓度成线性关系，能够根据标准曲线计算浓度，并利用96孔酶标板进行高通量检测。当该方法用于固体培养基中D-阿洛糖的检测时，反应产物与二氨基联苯胺(DAB)作用生成不溶于水的褐色吩嗪聚合体，利用此显色反应可在培养皿中挑出阳性菌落。
【专利说明】-种基于双酶偶联高通量检测D-阿洛糖的新方法
[0001]
【技术领域】 本发明属于糖转化工业微生物的筛选和开发利用领域，特别涉及一种基于双酶偶联反 应的高通量检测D-阿洛糖的新方法。
[0002] 技术背景 高通量筛选的意义 近年来，随着系统代谢工程与合成生物学的日新月异的发展，以及蛋白质构象预测、结 构分析和定点突变方法研究的不断深入，加速了人们利用微生物以及微生物来源的关键酶 的步伐。
[0003] 然而，由于生物体的复杂性和人类认识的局限性，除了少数成功的实例外，设计合 成的工程菌株经常不能完全达到高效的生产要求，企图通过理性设计达到改善生产关键酶 性能的目的也仍然非常困难。因此，需要通过诱变进化的方法进一步弥补理性设计的不足， 而非理性的诱变则通常需要结合高效高通量的筛选。只有建立有效的高通量筛选方法，在 先进的现代自动化技术和仪器设备帮助下，才能大大突破人工筛选在速度、效率和标准化 等方面的限制。
[0004] 阿洛糖的生理活性和筛选意义 在碳水化合物研究领域中，稀少糖是一类重要的研究内容。尽管在自然界中含量极少， 但稀少糖却在膳食、保健、医药等领域中发挥着非常重要的功能。D-阿洛糖是一种功能广泛 的稀少糖。它可以显著抑制中性分叶核白细胞的生成，因此能够在器官和组织移植中作为 一种免疫抑制剂显示重要功能。此外，D-阿洛糖还能够有效抑制肿瘤细胞的增生繁殖，并 诱导卵巢癌细胞0VCAR-3的凋亡。D-阿洛糖的衍射物因其结构特点在许多具有生物活性的 天然化合物、糖类衍射物、核苷类似物及非糖化合物的合成中应用广泛。
[0005] D-阿洛糖的生物转化目前主要是以D-阿洛酮糖为底物，利用L-鼠李糖异构酶将 D-阿洛酮糖转化为D-阿洛糖。然而，目前发现的L-鼠李糖异构酶大多催化效率不高，作用 条件严苛，并不适用于工业化大生产。筛选和诱变筛选表达高效L-鼠李糖异构酶或其生产 菌株因此极为重要。
[0006] 传统检测方法的局限 传统定性或定量检测D-阿洛糖的方法非常有限。主要的检测方法为液相色谱法和以 半胱氨酸咔唑法为代表的化学方法。液相色谱法操作繁琐，仪器、耗材的成本高，示差检测 的灵敏度也比较低，如果检测的样品比较多，也会存在保留时间的偏移等问题。半胱氨酸咔 唑的化学检测方法需要浓硫酸试剂，操作比较危险，而且对样品的纯度要求严格，受其他物 质的干扰比较多。因此，研究建立简便、快速、准确、处理量大和应用广泛的分析方法，可以 促进生物法生产D-阿洛糖的理论研究，加快其产业化进程，对L-鼠李糖异构酶及其生产菌 株的快速进化也能起到很好的促进作用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的： 本发明的目的在于提供一种基于双酶偶联反应的高通量检测D-阿洛糖的新方法。通 过吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联的方法测定D-阿洛糖，高通量筛选目标微生物或酶。与 传统筛选方法相比，基于双酶偶联反应的高通量筛选方法具有成本低、效率高、目的性强， 能够批量操作的优点，能够从广泛的自然界中筛选性能优良的菌株。
[0008] 本发明的思路： 利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联的方法，测定D-阿洛糖和的含量。该方法包含两 个方面内容。
[0009] -方面，在氧气存在条件下，D-阿洛糖被其吡喃糖氧化酶氧化，生成过氧化氢，形 成的过氧化氢与4-安替比林和HSDA在过氧化氢酶作用下形成一种水溶性的蓝色醌类物 质，在583nm处有特征吸收值。借助96孔黑色微孔板和酶标仪，筛选高产D-阿洛糖的菌 株或高效的催化用酶，为基础和应用研究提供宝贵的菌种和酶资源。
[0010] 另一方面，D-阿洛糖被吡喃糖氧化酶作用形成的过氧化氢与DAB作用生成不溶于 水的褐色吩嗪聚合体，可以用于固体培养基中指示D-阿洛糖的生成。同样可以用于高效菌 株和酶的筛选。
[0011] 本发明的技术路线： 技术路线1 :液体反应液中 (1) 将固体培养基上长出的单菌落或者一种纯化后的酶转入到含有液体培养基和转 化底物的96深孔培养板中，每个孔对应一个单菌落或一种酶，用硅胶盖盖好，培养0-24小 时； (2) 将96深孔培养板利用冷冻离心机进行离心，去除菌体； (3) 将96深孔培养板中的上清液与HSDA、4-安替比林、吡喃糖氧化酶和过氧化物酶在 96孔板中反应，37 °C保温20分钟； (4) 将反应结束的96孔板板利用酶标仪测定583nm处的光吸收值，并将测得的吸收值 与标准曲线进行比对，计算D-阿洛糖的浓度。
[0012] 技术路线2 :固体培养基上 (1) 利用培养基将待筛选样品进行活化培养12-24小时； (2) 将富集培养的混合菌利用无菌水进行稀释，获得单菌落，涂布到表面有灭菌醋酸纤 维素薄膜的固体培养基上，培养6-18小时； (3) 将长有单菌落的醋酸纤维素薄膜揭下置于一干净的培养皿中； (4) 制备转化显色胶：含有DAB、吡喃糖氧化酶、过氧化物酶和转化底物的琼脂糖凝胶； (5) 将溶融态的转化显色胶倒入步骤（7)所得的培养皿里，转化显色胶冷凝后覆盖在醋 酸纤维素薄膜上，37°C保温，实时观察胶上的褐变效应。
[0013] 本发明的优点： (1) 效率高，吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联能够快速检测D-阿洛糖的含量； (2) 通量高，96深孔培养板和96孔板板结合酶标仪一起使用，大大提高了筛选的速度， 固体培养基上的筛选也很直观，一个平板可以同时筛选上百个单菌落； (3) 操作简便，检测过程不需要任何危险试剂的参与，反应条件温和，显色结果灵敏； (4) 成本低，能够以较低成本获得大量菌种。 具体实施例
[0014] 实施例1 : 步骤：在96孔板上依次加入lg/L D-阿洛糖50 μ L，150 μ L试剂A，吡喃糖氧化酶和 过氧化氢酶液100 μ L，总体积300 μ L。对照组加10g/L D-阿洛酮糖。设置酶标仪温度为 37°C，读取0_21min的583(nm)光吸收值。从时间变化图（附图1)中可以看出，随着时间的 增加，光吸收值增加，因此可以设定一个合适的时间观测点，如反应开始后20min为检测的 时间点。此外，对照组的光吸收值一直非常低，可以认为，反应底物D-阿洛酮糖对检测无干 扰。
[0015] 实施例2 :利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联的方法测D-阿洛糖的标准曲线。
[0016] 步骤：在96孔板上依次加入0、0· 2、0· 4、0· 6、0· 8和L Og/L D-阿洛糖50μ L， 150 μ L试剂Α,吡喃糖氧化酶和过氧化氢酶液100 μ L,总体积300 μ L。设置酶标仪温度为 37°C，读取20min的583(nm)光吸收值（附图2)。R2=0.997,说明D-阿洛糖在一定范围内 与测定的Ab(583nm)值呈显著线性关系。
[0017] 实施例3 :液体反应体系中筛D-阿洛糖的生产菌 步骤：固体培养基上培养含有待筛选L-鼠李糖异构酶及其突变体的大肠杆菌，将得到 的单菌落转接到含有液体培养基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)和底物10g/L的D-psicose 的96深孔培养板中，每个孔接种一个单菌落，用硅胶盖盖好，37°C培养12小时；将96深孔 培养板离心，取上清液50 μ L转入96孔板中，加入含HSDA、4-安替比林的溶液A以及含吡喃 糖氧化酶和过氧化物酶的溶液，37°C保温20分钟，再在583nm测光吸收。对照组用液体培 养基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)代替培养液上清参加反应，测583nm的光吸收（附图3)。 对照组的光吸收值在21min内一直很低，可以认为液体培养基（LB Amp IPTG)对检测无干 扰。
[0018] 实施例4 :固体培养基上的D-阿洛糖的生产菌的筛选 步骤：在固体培养基LB(含抗生素 Amp和IPTG)表面覆盖一层灭过菌的硝酸纤维素 薄膜，并在薄膜上涂布含有待筛选L-鼠李糖异构酶及其突变体的大肠杆菌，待单菌落长出 后，将膜揭下置于一干净的培养皿中；预制溶融状态的含DAB、转化底物D-阿洛酮糖、吡喃 糖氧化酶和过氧化物酶的显色胶，覆盖到长有单菌落的硝酸纤维素薄膜上冷凝，至于37°C 的培养箱中实时观测上述膜上各菌落生产D-阿洛糖的进程(附图4)。
[0019] 实施例5 :液体反应体系中筛D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和L-鼠李糖异构酶的 双酶共表达工程菌 步骤：构建D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和L-鼠李糖异构酶的双酶共表达工程菌，以 D-果糖为底物，转化生产D-阿洛糖。将固体培养基上培养含有待筛选D-阿洛酮糖-3-差 向异构酶和L-鼠李糖异构酶的双酶共表达工程菌，将得到的单菌落转接到含有液体培养 基LB (添加抗生素 Amp和IPTG)和底物100g/L的D-果糖的96深孔培养板中，每个孔接种 一个单菌落，用硅胶盖盖好，37°C培养12小时；将96深孔培养板离心，取上清液50 μ L转入 96孔板中，加入含HSDA、4-安替比林的溶液Α以及含吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的溶液， 37°C保温20分钟，再在583nm测光吸收。对照组用液体培养基（LB添加抗生素 Amp、IPTG 和100g/L的D-果糖)代替培养液上清参加反应，测583nm的光吸收（附图5)。对照组的光 吸收值在21min内一直很低，可以认为液体培养基对检测无干扰。
[0020] 附图表说明： 附图1 :D-阿洛糖（D-all〇se)和D-阿洛酮糖（D-psicose)吸光随时间变化的曲线 附图2 :双酶偶联法检测D-阿洛糖的标准曲线 附图3 :液体培养基（LB Amp IPTG)的吸光值随时间的变化曲线 附图4 :固体培养基上的D-阿洛糖的生产菌的筛选 附图5 :液体培养基（LB Amp IPTG D-果糖100g/L)的吸光值随时间的变化曲线。
【权利要求】
1. 一种利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联反应的检测D-阿洛糖的高通量筛选新方 法，当用于液体培养基时，步骤如下： (1) 将单菌落或纯化后的酶转入含转化底物的96深孔培养板中； (2) 将96深孔培养板利用冷冻离心机在合适的条件下离心，取其上清液进行测定； (3) 利用双酶偶联的方法，在96孔板板中结合试剂A测定上述上清液中D-阿洛糖的含 量。
2. -种利用吡喃糖氧化酶和过氧化物酶偶联反应的检测D-阿洛糖的高通量筛选新方 法，当用于固体培养基时，步骤如下： (1) 将菌群涂布到固体培养基表面的硝酸纤维素薄膜上，待单菌落长出后，将膜揭下置 于一干净的培养皿中； (2) 预制溶融状态的含试剂B、转化底物以及双酶的显色胶，接着覆盖到长有菌落的硝 酸纤维素薄膜上冷凝，利用双酶偶联的方法实时观测上述膜上各菌落生产D-阿洛糖的进 程。
3. 按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的双酶是吡喃糖氧化酶和过氧化物酶。
4. 按权利要求1中所述的方法，其特征是：结合试剂A是4-氨替比林和HSDA的磷酸 盐缓冲溶液(包括但并不局限于)。
5. 按权利要求1中所述的方法，其特征是：待试剂A、吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的双 酶以及样品加入到深孔板中后，37°C下反应20min。
6. 按权利要求1中所述的方法，其特征是：所述的测定条件为：在583nm波长下测光吸 收(包括但并不局限于)。
7. 按权利要求2中所述的方法，其特征是：所述的双酶是吡喃糖氧化酶和过氧化物酶。
8. 按权利要求2中所述的方法，其特征是：结合试剂B是DAB的磷酸盐缓冲溶液(包括 但并不局限于)。
9. 按权利要求2中所述的方法，其特征是：待试剂、吡喃糖氧化酶和过氧化物酶的双酶 以及样品加入到深孔板中后，37°C下反应l_24h。
【文档编号】C12Q1/28GK104195219SQ201410472672
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】柏玮, 朱玥明, 李星硕, 门燕, 孙媛霞 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所