专利名称：：酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明属于生物样品中草酸含量的检测分析领域，特别涉及一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：草酸是自然界中广泛存在的一种有机羧酸，多是以草酸盐的形式存在，是生物体生长过程中的一种代谢产物。草酸的代谢生成主要源自于三羧酸的循环和乙醛酸的循环。草酸能够与体内的一些金属离子络合形成化合物。在生物体内，草酸水平过高形成草酸盐积累会对生物体产生一定的毒性。例如在一些植物(豆类、番茄、向日葵等)中，草酸盐的积累会导致植物营养缺失、生长停滞等相关症状。已有的研究表明，草酸不仅对植物有害而且对包括人类在内的几乎所有生物都有毒害作用。在人类和其它脊椎动物中，由于草酸盐的积累易产生尿结石、肾结石、高草酸尿、低血钙症、维生素B6缺乏等症状。人体内的草酸既是甘氨酸和维生素C的代谢产物，也可以经由食物(如菠菜、苋菜、白菜及茶叶等)摄入。体内草酸过多易患多种疾病，一方面由于草酸只能经肾脏随尿液排泄，当体内草酸含量超标时，易引起肾脏负担过重导致器官功能发生病变紊乱，如引起高草酸尿症(PrimaryHyperoxaluriatypel，PHI)、肾衰竭等病；另一方面，由于Ca++、Mg++等多种金属离子和其它稀有元素与草酸根离子螯合形成盐或络合物，从而导致^及一些微量元素从体内流失，进而产生低血*丐症、维生素B6缺乏症、尿结石等多种疾病。在一些工业生产中，由于草酸络合金属离子产生沉积，造成堵塞管道、筛孔等现象。如制浆造纸以及啤酒工业经常会遇到这些问题。因此，人们在应用实践中需要检测一些不同来源样品的草酸含量，如在食品中检测草酸含量以对人民健康负责，在工业样品中检测草酸含量以判断引起管道和筛孔堵塞的临界草酸浓度。目前检测草酸的手段主要有滴定法、原子吸收法、比色法、高压液相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法、酶法及酶_电极法。滴定法建立最早，作为一种经典方法至今仍在食品分析中广泛应用，但发展不大，毛细管电泳灵敏度高，操作也较简便，但该仪器尚未普及。高效液相色谱法(HPLC)灵敏度高，重复性好，操作简便，快捷，但分离过程中无机酸的干扰较严重，且仪器昂贵，对操作人员的要求较高，普及困难，难以大范围使用，尤其是在一线工业生产或食品生产厂家使用。艾玉玲等在专利200710021171中公布了一种化学显色比色法测定双草酸硼酸锂中草酸含量，该方法灵敏度低，操作较繁琐、耗时的缺陷没有改善。比色法廉价、灵敏度高，但预沉淀操作难于完全将草酸提取出来，操作繁琐且重复性较差。酶法及酶_电极法检测草酸简便快速，灵敏度高，选择性好，回收率高，将酶法的放大作用、良好选择性与电极法的快速简便有机的结合了起来，是一种很有前途的检测方法。综合比较可知，高效液相色谱法与酶法及酶_电极法是两种较有前途的草酸检测方法。目前的酶法及酶-电极法均是利用草酸氧化酶(Oxalateoxidase)催化草酸与氧气生成二氧化碳和过氧化氢的特性，通过检测氧气的消耗量，或二氧化碳、过氧化氢的生成量来定量测定草酸。草酸氧化酶主要存在于植物中，譬如菠菜、辣椒叶、甜菜叶与茎、高粱根茎叶、大麦苗和根以及小麦苗等，玉米的根和茎等中，其中以大麦苗中的含量最高，因此目前大麦源的草酸氧化酶使用最频繁。在该酶法检测中，通常Cl—、N03—、SCN—及一些阳离子等会抑制酶活力，干扰测定结果。王尔中在专利200710024719.9、200710024720.1、200710024721.6、200710024722.0、200710024723.5、200710024724.X、200710024725.4中公布了一种草酸氧化酶比色法及酶联法技术的草酸诊断/测定试剂盒，灵敏度高，选择性好，回收率高，将酶法的放大作用、良好选择性与电极法的快速简便有机地结合了起来。酶法及酶-电极法简便、精确度高，是目前测定草酸的经典方法。但是由于该技术所用的草酸氧化酶造价较高，该法的大范围推广应用受到了很大限制。该法的大规模推广应用将有待于草酸氧化酶高效低成本制备技术的突破。因此急需寻找一种可替代该经典方法，且耗时短、价格较便宜、精确度和重现性高、操作简单方便的测定草酸的切实可行的分析方法。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒及其检测方法，该检测试剂盒具有灵敏度高，稳定性强，操作方便，使用试剂及设备成本低，可测定多种不同来源的样品，应用范围广，与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度高，有很好的实用性。所述的缓冲溶液B为100-200mM磷酸-磷酸氢二盐缓冲液、巴比妥盐_盐酸缓冲液Jris-盐酸缓冲液、硼酸_硼砂缓冲液、甘氨酸_氢氧化钠缓冲液、硼砂_氢氧化钠缓冲液或者其它缓冲液，缓冲溶液B的pH为9.09.5，离子强度100-200mM;所述的缓冲溶液C为含20-200mM磷酸氢二盐_柠檬酸、柠檬酸_柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸_盐酸缓冲液、邻苯二甲酸_盐酸缓冲液、柠檬酸_氢氧化钠_盐酸缓冲液或者其它缓冲液，缓冲溶液C的pH为1.55.6，离子强度20-200mM。本发明的一种生物样品中草酸含量的检测方法，包括如下步骤(1)待测样品的前处理将待测样品与上述缓冲溶液A按体积比1:15混合配成混合液，检查pH是否在5.010.0，如果不是，用酸和碱将pH调至5.010.0，加入与混合液0.050.5g/mL的活性碳共混220min，期间偶尔搅动或旋转混匀一下，再经抽滤或离心10-30min，去除酶反应抑制物和干扰物，得上清液；(2)草酸脱羧酶催化草酸生成甲酸反应体系的构建空白样品的准备量取0.3mL上述缓冲溶液C，0.lmL经前处理的待测样品溶液，混合备用；待测样品的准备量取0.3mL上述缓冲溶液C，0.lmL经前处理的待测样品溶液，混合备用；第一步草酸脱羧酶催化草酸生成甲酸反应体系，经前处理的待测样品通过加入0.lmL酶活>0.8U/mL的草酸脱羧酶启动反应(总体积为0.5mL);空白样品则不加入草酸脱羧酶(总体积为O.4mL)，反应pH为1.5-4.5，反应温度为15-60°C，反应时间为20-60min;(3)第二反应体系将辅酶I(NAD+)溶于缓冲溶液B中，配成9.35mg/mL的溶液D;空白样品组在第一步反应体系的酶催化反应空白样品液中加入2.OmL上述溶液D和0.55mL去离子水；待测样品组在第一步反应体系的酶催化反应待测样品液中加入2.OmL上述溶液D和0.45mL去离子水；第二反应体系总体积为2.95mL，混合l_5min后，于340nm处分别读取吸光值A工；[OO37](4)第三反应体系空白样品组在第二步反应体系中加入0.05mL甲酸脱氢酶，混合后在15-6(TC的水浴中反应15-60min，于340nm处读取样品的吸收值A2，计算AAee=A厂Ai;待测样品组在第二步反应体系中加入0.05mL甲酸脱氢酶，混合后在15_60°C的水浴中反应15-60min，于340nm处读取样品的吸收值(A2)，计算AA样品二A2-A！;计算AA340=AA样品AA空白.(A2-A》样品-(VA》空白(5)根据以下计算公式计算得到样品中草酸的含』VxMsxdxvx1000-反应最终体积，3[mL]公式(Dv——待测样品体积，0.1[mL]d——光路直径1[cm]-NADH的吸收系数:340nm=6.3[LXmmol—1Xcm—"AA,AA样品AA空白.(A2-A》样品-(VA》空白本发明的草酸酶偶联分光光度法测定原理反应式如下草酸(草酸盐)靴纖气甲斷甲酸盐)+C02(反应式D甲酸脱氧酸甲酸(甲酸盐)+NAD+十H20-^重碳酸(重碳酸盐)+NADH+H+(反应式2)草酸脱羧酶是一种含锰的酶，该酶能催化草酸(或草酸盐)分解产生甲酸(甲酸盐)和二氧化碳(见反应式l);生成的甲酸在辅酶I(NAD+)存在下，被甲酸脱氢酶完全氧化为重碳酸盐，NAD+则被还原为NADH(反应式2)，而NADH在340nm处有一最大吸光值。具体操作步骤见表l，表1酶偶联紫外分光光度法测定步骤反应体系反应试剂样品空白待测样品缓冲溶液C(mL)0.300.30第一反应体系待测样品溶液(mL，v)草酸脱羧酶(mL,>0.8U/mL)0.100.100.10混合后在15-60'C的水浴中反应20-60min,然后加入下面试剂启动反应；辅酶I的溶液D(mL)2.002.00第二反应体系去离子水(mL)0.550.45混合2min后在340nm处读取它的吸光值(A!),然后加入下面试剂启动反应；甲酸脱氢酶(mL，>40U/mL)0.050.05第.三反应体系混合后在15-60'C的水浴中反应15-60min,在340nm处马上读取样品的吸收值(A2)AA34o=AA样品陽厶A空白AA空白=A2-Ai草酸脱羧酶(oxalatedecarboxylase,0xDC，EC4.1.1.2)主要存在于木材腐朽真菌中，尤其是白腐菌，有关这方面的研究已有大量报道。在褐腐菌Postiaplacenta以及软腐菌Aspergillusniger禾口Aspergillusphoenicis中也曾有过报道。在其它真菌中，迄今为止报道相对较少。后来又有人在豚鼠(天竺鼠)的肝脏中发现该酶，其它动物的肝脏中则未见报道。最近，有研究发现枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis在低pH值环境下也可以诱导合成草酸脱羧酶。洪枫等在专利200710040314.4中公开了一种高效低成本生产草酸脱羧酶的技术方法，降低了该酶的生产和应用成本，可以使其快速产业化。本发明首次将草酸脱羧酶与分光光度计偶联来测定样品中草酸含量，可将多种不同来源样品制成液体(比如各种蔬菜提取液，水果提取液、尿液、血液以及不同工业的废水等)测定，应用范围广，由于这些液体中都存在酶抑制物或其它干扰物，因此在样品的前处理中，添加活性碳吸附剂及EDTA来处理脱毒，以提高测定方法的准确性、稳定性和灵敏度。有益效果本发明的检测试剂盒具有灵敏度高，稳定性强，操作方便，使用试剂及设备成本低，可测定多种不同来源的样品，应用范围广，与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度高，有很好的实用性。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明7而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1不同来源的草酸样品的前处理(1)样品的准备将新鲜的蔬菜洗净、晾干去除表面的水份，准确称取一定量的蔬菜放入榨汁机中充分粉碎成糊状，取出样品进行离心得到上清液，用20%的盐酸或10M的NaOH调节pH值至4.06.0的范围内，然后放入冰箱保存；—份24h的尿液样品被收集在含有lOmL浓盐酸的容器中，计量体积后置于冰箱保存；(2)样品前处理取出前面准备好的蔬菜样品，以1:3的体积比例与pH值为7.0的50mM磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液混合，以PH计测定pH值的大小，如果偏离缓冲液自身pH值7.0，则用盐酸或Na0H溶液调节至pH7.0，然后加入活性碳吸附剂(200g/L)处理5min，抽滤或在12，000rpm转速下离心20min后得到上清液。利用经典的HPLC法测蔬菜样品中草酸浓度，得知经活性碳吸附剂处理后草酸回收率大于95%。以pH值7.0，含20mMEDTA的50mM磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液按1:1的体积比将保存的尿液稀释，以pH计测定pH值的大小，如果偏离缓冲液自身pH值7.0，则用盐酸或Na0H溶液调节至pH7.O，然后加入活性碳吸附剂(200g/L)处理5min。滤纸抽滤或在12，000rpm转速下离心20min后得到上清液。利用经典的HPLC法测得尿液样品中草酸的回收率大于95%。实施例2由于蔬菜样品中含有酶抑制或其它干扰物，所以必须对样品进行前处理。本实验先以白菜汁为模型，进行前处理的研究，实验结果见表2。表2显示，未处理的白菜汁样品测得的草酸含量最小，以水稀释8倍后，测定值从6.lmmol/L上升到了39.lmmol/L，说明稀释的方法能够减少测定的干扰因素。样品经活性碳吸附剂处理后发现测定值有较大的提高，表明吸附剂能够吸附一部分干扰物质，改善了酶反应效果。结合使用上面两种处理方法，即水稀释法加上吸附剂处理，得到的结果比单独使用一种处理方法要好许多，测定值达到了42.4mmol/L，但是与HPLC测得的实际草酸含量45.8mmol/L仍存在一定偏差。在前面处理方法的基础上，通过往样品中添加EDTA至终浓度为20mM，获得了较满意的测定结果，测得的数据46.lmmol/L与HPLC的测定结果45.8mmol/L非常接近，表明蔬菜汁可能存在可以抑制酶反应的金属离子，EDTA螯合了这些金属离子，改善了酶反应。表2紫外分光光度法测定处理后样品白菜中草酸含量8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注所用白菜汁中含草酸45.8mmol/L(HPLC法)。实施例3不同蔬菜中草酸含量的测定(以公认的HPLC经典方法测定的结果为对照)以实施例1中的蔬菜汁为测试样品，按表3中的实验步骤测定草酸，表3实验步骤<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>按表3的实验步骤测得AA，后，根据下列公式计算蔬菜汁样品中的草酸含]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>V——反应最终体积，3[mL]v——反应样品体积，0.1[mL]d——光路直径[cm]e——NADH的吸收系数340nm<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>测定结果见下表4:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注HPLC测试前不需吸附剂预处理。从表中可以看出酶偶联分光光度法与HPLC法所测结果相近，重现性好，同时酶偶联分光光度法对设备及操作要求不高，有利于大范围推广应用。实施例4尿液中草酸含量的测定(以公认的HPLC经典方法测定的结果为对照)以实施例1中的尿液为测试样品，按表5中的实验歩骤测定草酸，表5实验步骤反应试剂样品空白待测样品50mM，pH5.0醋酸缓冲液(mL)0.30待测尿液样品溶液(mL)(v)0-10草酸脱羧酶(mL,>0.8U/mL)_混合后在35'C的水浴中反应30min，然后加入下面试剂启动反应；0.300.100.10辅酶I的溶液D(mL)去离子水(mL)混合2min后在340nm处读取它的吸光值(Ai)2.002.000.550.45然后加入下面试剂启动反应；甲酸脱氢酶(mL，>40U/mL)0.050.05混合后在25'C的水浴中反应20min。在340nm处马上读取样品的吸收值(A2)AA34o=AA样品-AA空白AA空白=A2-Ai厶A样品=A2-A!按表5的实验步骤测得AA，后，根据公式1计算蔬菜汁样品中的草酸含〗测定结果见下表6:表6样品酶偶联分光光度法(mmol/L)HPLC(mmol/L)未处理吸附剂处理后尿液i00.410.39尿液200.260.28尿液300.150.1210权利要求一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒，包括(1)样品前处理试剂盒活性碳吸附剂0.1～1g；缓冲溶液A2～10mL；以上所述的药品和试剂的用量只针对2mL待测样品；(2)样品反应试剂盒，包括草酸脱羧酶，酶活＞0.8U/mL0.1mL×2；辅酶I，即NAD+18.7mg×2缓冲溶液B2.0mL×2；缓冲溶液C0.3mL×2甲酸脱氢酶，酶活＞40U/mL0.05mL×2；0.2-1.0mM草酸标准品2.0mL；以上所述的药品和试剂的用量仅针对1份0.1mL样品和1份空白对照。2.根据权利要求1所述的一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒，其特征在于所述的缓冲溶液A为含0-50mM的EDTA的20-100mM磷酸-磷酸氢二盐、磷酸氢二盐-磷酸二氢盐、磷酸氢二盐_柠檬酸缓冲液、磷酸二氢盐_氢氧化钠缓冲液、巴比妥盐_盐酸缓冲液Jris-盐酸缓冲液、硼酸_硼砂缓冲液、甘氨酸_氢氧化钠缓冲液、硼砂_氢氧化钠缓冲液，缓冲溶液A的pH为5.010.0，离子强度20-100mM。3.根据权利要求1所述的一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒，其特征在于所述的缓冲溶液B为100-200mM磷酸-磷酸氢二盐缓冲液、巴比妥盐_盐酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、硼酸_硼砂缓冲液、甘氨酸_氢氧化钠缓冲液、硼砂_氢氧化钠缓冲液，缓冲溶液B的pH为9.09.5，离子强度100-200mM。4.根据权利要求1所述的一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒，其特征在于所述的缓冲溶液C为含20-200mM磷酸氢二盐-柠檬酸、柠檬酸_柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸_盐酸缓冲液、邻苯二甲酸_盐酸缓冲液、柠檬酸_氢氧化钠_盐酸缓冲液，缓冲溶液C的pH为1.55.6，离子强度20-200mM。5.根据权利要求1所述的试剂盒用于生物样品中草酸含量的检测方法，包括如下步骤(1)待测样品的前处理将待测样品与上述缓冲溶液A按体积比1:15混合配成混合液，用酸或碱将pH调至5.010.O，加入与混合液0.050.5g/mL的活性碳共混220min，期间偶尔搅动或旋转混匀一下，再经抽滤或离心10-30min，去除酶反应抑制物和干扰物，得上清液；(2)草酸脱羧酶催化草酸生成甲酸反应体系的构建空白样品的准备量取O.3mL上述缓冲溶液C，0.lmL经前处理的待测样品溶液，混合备用；待测样品的准备量取O.3mL上述缓冲溶液C，0.lmL经前处理的待测样品溶液，混合备用；第一步草酸脱羧酶催化草酸生成甲酸反应体系，经前处理的待测样品通过加入0.lmL酶活>0.8U/mL的草酸脱羧酶启动反应，总体积为0.5mL;空白样品则不加入草酸脱羧酶，总体积为0.4mL，反应pH为1.5-4.5，反应温度为15_60°C，反应时间为20_60min;(3)第二反应体系将辅酶I溶于缓冲溶液B中，配成9.35mg/mL的溶液D;空白样品组在第一步反应体系的酶催化反应空白样品液中加入2.0mL上述溶液D和0.55mL去离子水；待测样品组在第一步反应体系的酶催化反应待测样品液中加入2.OmL上述溶液D和0.45mL去离子水；第二反应体系总体积为2.95mL，混合l-5min后，于340nm处分别读取吸光值^;(4)第三反应体系空白样品组在第二步反应体系中加入0.05mL甲酸脱氢酶，混合后在15-6(TC的水浴中反应15-60min，于340nm处读取样品的吸收值A2;待测样品组在第二步反应体系中加入0.05mL甲酸脱氢酶，混合后在15-6(TC的水浴中反应15-60min，于340nm处读取样品的吸收值A2;(5)根据测得的吸收值计算得到样品中草酸的含量。全文摘要本发明涉及一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒，包括样品前处理试剂盒及样品反应试剂盒；其检测步骤包括待测样品先经前处理，去除酶反应抑制物和干扰物；在处理后的样品溶液中添加草酸脱羧酶，于15-60℃反应20-60min；加入辅酶I的溶液和去离子水，测定吸光值A1；再加入甲酸脱氢酶反应15-60min，测定反应液的吸光值A2；另做一空白样品进行对照，最后根据测得的吸收值计算得出草酸的含量。本发明的检测试剂盒具有灵敏度高，稳定性强，操作方便，使用试剂及设备成本低，可测定多种不同来源的样品，应用范围广，与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度高，有很好的实用性。文档编号G01N21/31GK101788488SQ20101002284公开日2010年7月28日申请日期2010年1月15日优先权日2010年1月15日发明者曹张军,杨光,洪枫申请人:东华大学