基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 一种基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构 酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种DPE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属 于酶基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE酶)属于D-塔格糖3-差向异构酶(简称DTE)家 族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或 与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。目前，DPE酶 可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。
[0003] 随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构 越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研宄仍是功能性甜味剂领域具有重要 的经济价值的当务之急。D-阿洛酮糖是一种天然己酮糖，D-阿洛酮糖拥有蔗糖甜度的70%， 能量值却只有蔗糖的〇. 3%，具有较高的溶解度，较低的血糖反应。因此它是一种理想的甜味 剂，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品。此外D-阿 洛酮糖还可以减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。
[0004] 自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，近年来通过新技术开发可实现其大规模生产。 D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化 困难、食品安全性等问题。而通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase， DPEase，EC 5. I. 3. 30)把D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的生物转化法因具有反应简 单、产物单一、纯化步骤容易等优点而逐渐吸引了众多科学家的关注，也成为D-阿洛酮糖 商业化生产的热点和焦点。
[0005] 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品 的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局（FDA)和中国 农业部等部门批准为食品级安全菌株。表达系统没有明显的密码子偏 好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯 化等后续操作，并且遗传背景研宄比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品级安全的重组枯 草芽孢杆菌，并可用于转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。对D-阿洛酮糖的食品生产具有重要 的意义。
[0007] 本发明的技术方案：一株基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为lA751/7〇z-DPE，分类命名为 SK38. 002,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO : M 2015258〇
[0008] 所述的基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差 向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括含有来源于梭状芽胞杆菌（0 O ?5 iri ο? ?? sciflifefldATCC 35704的DPE酶基因的整合载体pDGI-7S6-P43-DPE ;再利用整合载体 PDGI-7S6-P43-DPE将DPE酶基因和抗生素抗性基因7οζ71-5/7^整合至枯草芽孢杆 菌) 1Α751染色体上，然后利用Cre重组酶敲除染色体上的5/7C抗性基 因，获得一株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌lA751/7 〇z-DPE，命名为 SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。
[0009] 重组菌的制备方法，其具体步骤为： (1)以整合载体pDGIEF(NCBI-Gene ID: 86278326)为出发载体，将质粒P7S6用 Sal I /Xma I双酶切得到片段；将整合载体pDGIEF用Sal I /Xma I双 酶切，将^?71-577^片段连入相应酶切位点，得到新的整合载体pDGI-7S6。
[0010] (2)设计引物将DPE酶基因扩增出来，在引物中引入Nhe I /Sal I酶切位点，通过 重叠延伸PCR将启动子P43融合在DPE酶基因上游。将扩增的DPE酶基因连接至pMD-19T 中，得到质粒T-P43-DPE。
[0011] (3)将整合载体 pDGI-7S6 和 T-P43-DPE 同时用 Nhe I /Sal I 双酶切，将 P43-DPE 表达基因构建至整合载体PDGI-7S6中，得到整合载体pDGI-7S6-P43-DPE。
[0012] (4)将整合载体pDGI-7S6-P43-DPE转入枯草芽孢杆菌1A751感受态，发生同源 重组，P43-DPE表达基因和整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上，得到 lA751-P43-DPE-spc。
[0013] (5)将温敏性质粒pTSC导入整合的重组枯草芽孢杆菌lA751-P43-DPE-spc中， 在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在Cre酶的作用下，7oz71和7〇冰6位点发生重组，抗 生素抗性基因5/7C被删除，提高温度培养，pTSC质粒丢失。最终获得一株无抗性基因的重 组枯草芽孢杆菌 lA751/7oz-DPE，命名为UaciBw1S SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。
[0014] 为增强表达，在DPE基因的上游添加启动子P43, P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1中1-300位所示。
[0015] 整合载体pDGI-7S6-P43-DPE，其中含有所述的DPE酶基因 （SEQ ID NO. 1中 301-1170位所示）、作为筛选标记的抗生素抗性基因7〇ζ71-5/7^Λ?66片段以及淀粉酶同 源臂<3〃#。
[0016] 所述的重组枯草芽孢杆菌lA751/7oz-DPE的应用，可用于生产D-阿洛酮糖，在化 学、食品和制药领域中的应用。
[0017] 本发明的有益效果：本发明提供一株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组 枯草芽孢杆菌 1A751/7oz-DPE，命名为UaciBw1S SK38. 002,即 CCTCC NO :Μ 2015258。其可以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖。该重组枯草芽孢杆菌在化学、食品和制 药领域中具有重要的应用价值。
[0018] 生物材料样品保藏：一株枯草芽孢杆菌002,已保藏于 中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO : M 2015258,保藏日期2015年4月28日。
【附图说明】
[0019] 图1 :整合载体pDGI-7S6-P43-DPE的构建过程。
[0020] 图2 :染色体整合及抗性基因5/X敲除。
[0021] 图3 :重组菌SK38. 001的发酵及酶活曲线。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1 !P43-DPE表达单元的构建 通过重叠 PCR引入P43启动子，利用引物对P1/P2扩增P43启动子，利用引物对P3/P4 扩增DPE酶基因连接，设计引物如下： Pl: 5' -CCGCTAGCTG ATAGGTGGTA TGTTTTC-3' P2: 5' -TAATAAATAC CATGCTTCAT GTGTACATTC CTCTCT-3' P3: 5' -AGAGAGGAAT GTACACATGA AGCATGGTAT TTATTA-3' P4: 5' -GTCGACTTAC TTCCATTCAA GCATG -3' 通过PCR的方法，利用Pl和P2为引物获得PCR产物1。利用P3和P4为引物获得PCR 产物2。
[0023] 以PCR产物1和PCR产物2为模板，利用Pl