和P4为引物，进行重叠 PCR。其反应 体系如下：
反应程序如下：98°C预变性I min;98°C 10 s，55°C 15 s，72°C I min，进行30个循 环；72°C延伸5 min，降温至4°C。最终得到P43-DPE表达单元。
[0024] 实施例2 :整合载体pDGI-7S6-P43-DPE的构建 将质粒P7S6和pDGIEF，分别用Sal I和Xma I进行双酶切，回收和 载体pDGIEF基因片段，经Τ4连接酶连接过夜后转化入万.co/i DH5 α感受态细胞，涂布到 LB固体培养基(含100 yg/mL 5/7C)上，37°C过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行双酶 切验证。验证正确的质粒被命名为PDGI-7S6。
[0025] 将质粒PDGI-7S6和pP43-DPE，分别用Nhe I和Sal I进行双酶切，回收基因片段 PDGI-7S6和P43-DPE，经T4连接酶连接过夜后转化入凡co/i DH5 α感受态细胞，涂布含 有s/7c(100 μ g/mL)的LB平板，37°C过夜培养。挑取阳性克隆，抽提质粒，进行双酶切和测 序验证。验证及测序正确的质粒命名为PDGI-7S6-P43-DPE (图1)。
[0026] 实施例3 :染色体整合 将重组质粒PDGI-7S6-P43-DPE用XhoI线性化后转化入宿主菌汉1A751感 受态中，涂布到LB固体培养基(含100 μ g/mL 5/7C)上，37°C培养过夜，挑取阳性克隆转化 子即为汉 lA751_DPE_spc (图 2)。制作重组菌汉 lA751_DPE_spc 感 受态，将带有Cre基因的pTSC质粒转化入感受态中，利用含有应（250 μ g/mL)的LB平板 筛选，挑取阳性克隆子，用牙签接种到含有应（250 μ g/mL)和分c (100 μ g/mL)的双抗 性平板和仅含应（250 μ g/mL)的抗性平板，选取仅具有故杭性而不具有57c抗性的阳性 克隆子，再提高温度，丢失质粒PTSC即获得重组菌汉lA751/7oz-DPE。
[0027] 实施例4:重组菌的发酵 I. DPE酶活测定方法：lmL的反应体系中，加入800 yL的用磷酸盐缓冲液（50mM， pH7. 0)溶解的100g/L的D-果糖，200 yL的发酵液，55°C保温lOmin，然后煮沸IOmin以终 止酶反应。
[0028] 2.用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量，计算酶活。酶活单位（U):每分钟催化产生 Iymol D-psicose所需要的酶的量。
[0029] 3.用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37°C、200rpm，培养 12~14h。以3%的接种量接种至发酵培养基中，37°C、200rpm，并定时取样，测定0D_，酶活数 据（图3)。
[0030] 种子培养基：胰蛋白胨（l〇g/L)，酵母提取物（5g/L)，NaCl(10g/L)，以纯净水配 制。
[0031] 发酵培养基：葡萄糖（15g/L)，酵母膏（15g/L)，NaCl (8g/L)，MgSO4 (lg/L)， Na2HP04(lg/L)，pH 7· 25,以纯净水配制。
【主权项】
1. 一株基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异 构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为lA751/7 〇z-DPE，分类命名为枯草芽孢杆菌 SK38. 002,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :M 2015258。2. 权利要求1所述的基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖 3_差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括含有来源于梭状芽胞杆菌 (ATCC 35704 的 DPE 酶基因的整合载体 pDGI-7S6-P43-DPE ;再利 用整合载体PDGI-7S6-P43-DPE将DPE酶基因和抗生素抗性基因整合至 枯草芽孢杆菌1A751染色体上，然后利用Cre重组酶敲除染色体上的5/7C抗性基因，获得一 株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌lA751/7oz-DPE，命名为 sM) SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体步骤为： (1) 以整合载体PDGIEF为出发载体，将质粒p7S6用Sal I /Xma I双酶切得到 片段；将整合载体 pDGIEF 用 Sal I /Xma I 双酶切，将 片段连入相应酶切位点，得到新的整合载体PDGI-7S6 ; (2) 设计引物将DPE酶基因扩增出来，在引物中引入Nhe I /Sal I酶切位点，通过重叠 延伸PCR将启动子P43融合在DPE酶基因上游，将扩增的DPE酶基因连接至pMD-19T中，得 到质粒 T-P43-DPE ; (3) 将整合载体？061-756和！'-?43-0?￡同时用他61/5&11双酶切，将？43-0?￡表达 基因构建至整合载体PDGI-7S6中，得到整合载体pDGI-7S6-P43-DPE ; (4) 将整合载体pDGI-7S6-P43-DPE转入枯草芽孢杆菌1A751感受态，发生同源重 组，P43-DPE表达基因和整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上，得到 lA751-P43-DPE-spc ； (5) 将温敏性质粒pTSC导入整合的重组枯草芽孢杆菌lA751-P43-DPE-spc中，在IPTG 的诱导下，表达重组酶Cre，在Cre酶的作用下，TW71和/(0^66位点发生重组，抗生素抗性 基因5/7C被删除，提高温度培养，pTSC质粒丢失，获得一株无抗性基因的重组枯草芽孢杆菌 lA751/7oz-DPE，命名为SK38. 002,即 CCTCC NO :M 2015258。4. 根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于为增强表达，在DPE基因的上游添 加启动子P43, P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1中1-300位所示。5. 根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于整合载体pDGI-7S6-P43-DPE，其 中含有所述SEQ ID NO. 1中301-1170位所示的DPE酶基因、作为筛选标记的抗生素抗性基 因片段以及淀粉酶同源臂<3?成。6. 权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌1A751/ A^r-DPE的应用，其特征在于可用于生 产D-阿洛酮糖，在化学、食品和制药领域中的应用。
【专利摘要】基于Cre/lox系统的无抗性基因染色体整合的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于酶基因工程技术领域。以整合载体pDGIEF为出发载体，删除原有的壮观霉素(spc)抗生素抗性基因，引入lox71-spc-lox66新的抗生素抗性基因片段，得质粒pDGI-7S6；将ATCC 35704的DPE酶基因，在其上游融合P43启动子构建P43-DPE，将其构建至pDGI-7S6中得pDGI-7S6-P43-DPE；再转化1A751感受态，在淀粉酶同源臂作用下，P43-DPE和lox71-spc-lox66整合至1A751染色体上；利用Cre/lox系统将spc抗性基因敲除，得一株食品级安全的产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的1A751/lox-DPE，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.002，保藏编号：CCTCC NO:M 2015258。发酵液总酶活达到6U/mL，具有重要的工业应用价值。CCTCC NO：M 201525820150428
【IPC分类】C12P19/24, C12N1/21, C12N15/74, C12R1/125, C12P19/02
【公开号】CN104946577
【申请号】CN201510294696
【发明人】江波, 沐万孟, 何伟伟, 张涛
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月2日