专利名称：：蜂王浆中β-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法
技术领域：
：本发明涉及蜂王浆中药物残留的检测方法，特别是一种蜂王浆中萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盘尼西林G、双氯青霉素和苯唑西林九种e-内酰胺类药物残留总量的快速提取和酶联免疫测定方法。
背景技术：
：e-内酰胺(Beta-Lactams)是指化学结构中具有P-内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环P-内酰胺类等其他非典型P-内酰胺类抗生素。e-内酰胺类的抗菌作用机理均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解，从而达到抑制细菌的生长。在蜜蜂养殖业中该类药物被用来防治欧洲幼虫腐臭病、中蜂囊状幼虫病、美洲幼虫病等。食用了含有3-内酰胺类抗生素的食品对人体会造成潜在危害(1)过敏反应；(2)赫氏反应；(3)胃肠反应。最重要的是，这类药物很容易造成细菌产生耐药性。目前世界各个国家都对动物使用P-内酰胺和食品中残留进行了严格的控制。在我国，动物源性食品中阿莫西林和氨苄西林的MRL为5(Vg/kg，奶及奶制品中MRL为10昭/kg;日本规定在蜂蜜中阿莫西林残留量不得超过8^tg/kg，奈夫西林残留量不得超过5pg/kg，氨苄青霉素残留量不得超过9pg/kg，苄青霉素残留量不得超过4ng/kg，蜂王浆中残留量则参照一律标准(l(Wkg)。长期以来3-内酰胺残留的检测手段主要有大型分析仪器测试。对于肉类、水产品中3-内酰胺的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法、气质联用法(GC-MS)、液质联用法(LC-MS)等。另外，微生物法也是该类药物残留主要测定方法。近年来酶联免疫法(ELISA)和放射免疫法(CharmII)等生物学筛选方法得到应用，我国已制定了利用放射免疫法(CharmII)检测动物源性食品中e-内酰胺残留的标准方法，但我国迄今为止还没关于动物源性食品中3-内酰胺残留ELISA检测的方法，更是没有关于蜂王浆样品中e-内酰胺残留量的筛选方法。这是因为一方面是蜂王浆所含活性成分多样，组成复杂，有大量干扰物质，在具体操作时更增加了难度和不稳定性；另一方面是由于3-内酰胺类药物在溶液中极易降解，制备相应的抗体非常困难。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种蜂王浆中P-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法，其实现对P-内酰胺类药物残留量的快速提取为此，本发明采用的技术方案为蜂王浆中P-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法，其步骤如下1)蜂王浆样品中加入体积比为48%_52%的甲醇水溶液，充分混匀；2)在15土2"下进行高速离心，直至清亮；3)取上清液加入稀释洗涤缓冲液；4)用碱或酸将pH值调节到6.57.5;5)用酶联免疫检测试剂盒进行检测；上述的稀释洗漆缓冲液为检测试剂盒自带或磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0。上述的蜂王浆中e-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法，甲醇水溶液的体积比优选50%。上述的蜂王浆中3-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法，所述的P-内酰胺类药物为萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盘尼西林G、双氯青霉素和苯唑西林。无论在酸性还是碱性条件下用其它有机溶剂(如乙腈)来萃取蜂王浆中的3-内酰胺类抗生素，样品本底干扰大，回收率低，这是因为P-内酰胺类药物较不稳定，在pH值小于5和pH值大于9时都会发生一定程度的降解；相关文献表明，在使用SPE净化的方法中，要使e-内酰胺类药物的损失最小，必须考虑SPE柱的碳含量，C-18柱填料的含碳量至少为17%;另外用一庚垸磺酸钠缓冲液(pH为2.0)提取王浆中该类药物时，e-内酰胺发生的较多的降解，因此回收效果不佳；而用磷酸盐缓冲液沉淀蛋白效果较差，蜂王浆中的蛋白质易与P-内酰胺类药物形成共价键，净化效果不理想。通常，样品要与脱蛋白溶剂一起匀质，可以增加溶剂与试样的接触面积，与提取剂一起通过振荡脱蛋白，达到沉淀蛋白和提取e-内酰胺的效果。本发明的研究结果表明以50%甲醇(酸性)作为蜂王浆样品的脱蛋白沉淀剂和其中P-内酰胺药物的提取效果最理想，处理后的样品溶液可以直接进行ELISA检测。本发明以直接以50%甲醇来沉淀蜂王浆中的蛋白质和提取残留的3-内酰胺，处理后样品中残留的P-内酰胺与酶标记氨苄西林共同竞争结合至包被有抗体的微孔板上氨苄西林抗体，通过洗涤除去未结合的3-内酰胺和酶标记氨苄西林，然后加入底物显色剂，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值与标准曲线比较，得出试样中3-内酰胺的含量。本发明对设备要求简单，操作容易，便于企业自检，自我控制原料质量；也可以为大型分析仪器LC-MS/MS使用前先行筛选样品，降低仪器分析成本；本发明的测定低限可以达至UlOng/kg，满足了国内外对蜂王浆产品中0-内酰胺残留限量的测定要求。具体实施例方式实施例(以英国RANDOX公司生产的酶联免疫检测试剂盒对提取物进行ELISA测定)1)交叉反应测试在检测试剂盒所带的稀释缓冲液中添加不同浓度的P-内酰胺类药物，进行选择性试验(结果见表l)，不同物质的交叉反应率以下公式进行计算交叉反应率(％)=I5o(氨苄西林)/I5Q(待测物)XiooIso为反应中产生50%最大抑制率的e-内酰胺类药物或待测物浓度。不同P-内酰胺药物的交叉性数据如下表1:_抗生素_交叉性％~萘夫西林(Naficillin)iii~氨节西林(Ampicillin)100阿莫西林(Amoxicillin)94哌拉西林(Pioeracillin)92阿洛西林(Azlodllin)89氯唑西林(Cloxacillin)69盘尼西林G(PenicillinG)56双氯青霉素(dicloxillin)52苯唑西林(Oxacillin)51美坦西林(Metampicillin)30盘尼西林V(PenicillinV)22羧节西林(Carbenicillin)8替卡西林(Ticarcillin)6先锋霉素类eCephalosporins)_O.01从交叉反应结果可见，该试剂盒对萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盘尼西林G、双氯青霉素和苯唑西林具有良好的交叉性，对美坦西林和盘尼西林V的交叉性为20309()，但对其他氟喹诺酮类交叉反应都小于10%，说明该试剂盒可以用于蜂王浆中萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盘尼西林G、双氯青霉素和苯唑西林残留量的检测。2)本发明的具体测定步骤如下称取5g蜂王浆样品，精确到0.1g，置于50mL具塞试管中，加入10mL50。/。甲醇，充分混匀；15。C下6000rpm离心10min直至清亮，取0.5mL上清液加入lmL稀释洗涤缓冲液(检测试剂盒自带)；用30%NaOH/lmol/LHC1溶液将pH调节到6.57.5，用7检测试剂盒检测。在不同的空白样品中分别添加三个浓度的氨苄西林，每个添加浓度测定5个平行样，并进行3批实验(不同检测日期，不同标准曲线，不同批次试剂盒)。测定数据见表2。在三个添加浓度对蜂王浆样品的平均回收率在83%93%,相对标准偏差4.3%7.3%。以上结果表明本发明的方法具有良好的准确性和精密性。5pg/kg10pg/kg50|ag/kg测定值l4.68测定值24.37测定值34.64测定值44.41测定值54.76测定值64.7测定值74.9测定值84.4测定值94.1测定值IO4.13测定值ll4.29测定值124.6测定值133.85测定值144.56测定值154.57平均回收率(％)89.3相对标准偏差(％)6.39.138.668.138.749.818.488.939.98.348.788.679.610,159.29.2390.56.648.244.141.740.450.749,451.140.242.343.844.746.448.551.147.892.18.43)方法的假阳性率和假阴性对于100阴性样品进行测定，结果显示有4个阳性样品(浓度分别为8.6|ug/kg、10.5pg/kg、12.4iLig/kg和13.8iLig/kg)。以LC-MS/MS对这4个样品进行确证，结果显示为阴性。假阳性率=1-测定阴性/(测定阳性+测定阴性)=4%对20个测定结果为阳性的王浆样品和24个添加氨苄西林和阿莫西林的王浆样品以ELISA进行测定，见表3-4，结果均为阳性，表明建立的ELISA方法的假阴性率为0。表3阳性蜂王浆样品的ELISA和LC-MS/MS结果比对<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4添加样品中的ELISA结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4)验证实验选择了5家实验室进行本方法的验证实验，结果表明在各种空白样品中分别添加三个浓度的氨苄西林、阿莫西林、萘夫西林和哌拉西林均良好的回收率，见表5，说明建立的测定方法在实验室间也有着良好的重现性。符合GB/T6379《测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性》的要求。表5蜂王浆样品的实验室间添加回收率(％)和精密度(CV%)氨苄西林阿莫西林萘夫西林哌拉西林5吗/kg106.8%109.8%/1,292.2%103.6%/5.184.4%99.0%/5.885.8%95.0%/4.599.0%104%/2.097.3%103%/2.384.5%93.4%/3.685.8%95.7%/4.750pg/kg98.8%108.8%/3.788.4%99.2%/4.483.6%95.8%/5.685.4%97.6%/4.9权利要求1、蜂王浆中β-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法，其步骤如下1)蜂王浆样品中加入体积比为48％-52％的甲醇水溶液，充分混匀；2)在15±2℃下进行高速离心，直至清亮；3)取上清液加入稀释洗涤缓冲液；4)用碱或酸将pH值调节到6.5～7.5；5)用酶联免疫检测试剂盒进行检测；上述的稀释洗涤缓冲液为检测试剂盒自带或磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0。2、根据权利要求1所述的蜂王浆中P-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法，其特征在于甲醇水溶液的体积比选用50%。3、根据权利要求1或2所述的蜂王浆中内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法，其特征在于所述的P-内酰胺类药物为萘夫西林、氨苄西林、阿莫西林、哌拉西林、阿洛西林、氯唑西林、盘尼西林G、双氯青霉素和苯唑西林。全文摘要本发明涉及一种蜂王浆中β-内酰胺类药物残留量的酶联免疫测定方法。目前没有关于蜂王浆样品中β-内酰胺残留量的筛选方法。本发明采用的步骤如下1)蜂王浆样品中加入体积比为48％-52％的甲醇水溶液，充分混匀；2)在15±2℃下进行高速离心，直至清亮；3)取上清液加入稀释洗涤缓冲液；4)用碱或酸将pH值调节到6.5～7.5；5)用酶联免疫检测试剂盒进行检测；上述的稀释洗涤缓冲液为检测试剂盒自带或磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0。本发明实现了对β-内酰胺类药物残留量的快速提取和测量，测定低限可以达到10μg/kg，满足了国内外对蜂王浆产品中β-内酰胺残留限量的测定要求。文档编号C07D499/76GK101587119SQ200910099399公开日2009年11月25日申请日期2009年6月11日优先权日2009年6月11日发明者张晓峰,施伟良,朱振江,陈笑梅申请人:浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心