一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术的制作方法
【专利摘要】本发明一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术属于采用定点突变的葡萄糖异构酶（GI）和D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）催化枣汁生产阿洛酮糖【技术领域】；为解决高热量糖给人们造成的健康问题，本发明提供了一种以红枣浓缩汁中D-葡萄糖、D-果糖作为底物，采用多酶偶联及固定化技术将重组酶葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶共固定化后双酶偶联促进生产低热量D-阿洛酮糖的方法，具体为：通过树脂在一定条件下将双酶吸附，然后加入交联剂交联得到固定化酶，利用所述固定化酶对红枣汁进行催化，将其中的果糖和葡萄糖逐步转化为D-阿洛酮糖。
【专利说明】一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术
【技术领域】
[0001]本发明一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术属于采用定点突变的葡萄糖异构酶(GI)和D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)催化枣汁生产阿洛酮糖【技术领域】。
【背景技术】
[0002]红枣集营养、保健、药用功能于一体，列入卫生部第一批药食兼用果品。红枣富含糖类物质，含糖量居各类果品之首，比制糖原料甘蔗、甜菜还高。鲜枣含糖量达20%-36%，干枣含糖量高达50-80%，枣中的糖类可分为以下三类:单糖(主要是葡萄糖和果糖)、双糖和多糖，其中果糖含量占43.95%、葡萄糖占42.32%、蔗糖占3.85%、低聚糖及多糖占9.86%。
[0003]我国红枣糖质资源丰富，红枣浓缩汁中富含葡萄糖以及果糖等原料。然而果糖与葡萄糖都是高能量物质，摄入会给机体带来巨大的生理压力，导致肥胖人群比例不断增大，糖尿病和心血管疾病人群逐年增加，并呈现出低龄化趋势。尽管没有显著证据证明肥胖与糖尿病和心血管疾病直接相关，但控制能量摄入对促进健康、减少脂肪积累，降低糖尿病和心血管疾病等慢性病的发生的作用已经得到公认。含有较高能量的高糖食品逐渐淡出货架，低热量、具有更多功能营养特性的功能食品在市场中受到欢迎。
[0004]D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，且在甜味强度和种类方面与D-果糖非常相似。然而，与D-果糖不同 ，D-阿洛酮糖在体内同化作用过程中很难代谢，且具有较低程度的热量供给。因此，D-阿洛酮糖能用作膳食的有效成分。当前广泛用作非糖甜味剂的糖醇在多于规定剂量摄取时会引起副作用，如腹泻，而D-阿洛酮糖没有这样的副作用，而且D-阿洛酮糖具有通过抑制脂肪生成酶的活性而减少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖能够用作甜味剂，该甜味剂还对有助于重量减轻。就此而论，D-阿洛酮糖作为饮食的甜味剂吸引了大量的兴趣，并且在食品工业中存在着的对开发高效生产D-阿洛酮糖的方法增加的需要。这是因为D-阿洛酮糖仅作为在theriae处理或葡萄糖异构化反应过程中的中间体，非常少量地存在于在自然界中，且不能化学合成。
[0005]木糖异构酶(xyloseisomerase, Xiase, EC 5.3.1.5),又称葡萄糖异构酶(glucose isomerase, GIase),在胞外可以催化D-葡萄糖至D-果糖的异构化反应,是食品工业生产上以淀粉为原料制备果葡糖浆的关键酶之一。
[0006]D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,缩写为DPE)是目前能实现D-果糖到D-阿洛酮糖之间生物转化的一种主要酶，属于酮糖3-差向异构酶家族，最适底物为D-阿洛酮糖。因此，应用基因工程技术制备葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组酶，可以有效地将D-葡萄糖转化为D-果糖、再由D-果糖转化为D-阿洛酮糖。
[0007]单酶体系应用中存在着对环境敏感、性质不稳定易失活，产物难分离提纯的问题。固定化酶技术不仅能节约酶的成本，提高酶的使用稳定性，简化后续分离步骤，更可以通过将几种酶进行联合固定化以实现多酶体系的协同反应，在反应过程中减小酶与底物的作用范围，增大酶周围的反应物浓度，提高反应的效率。随着多酶体系的研究应用，多酶体系共固定和共反应已成为一个活跃的研究领域，是酶工程领域的前沿之一。
[0008]多酶体系的固定化可分为建立在单酶固定化基础上的混合固定化酶技术和新发展起来的多酶共固定化技术。混合固定化酶是将单酶分别固定到不同载体上在同一反应体系中混合，但由于这种酶固定在不同载体上，反应中物质传递要克服两重扩散屏障，使酶促反应受到限制，需要进一步改善载体传质性能。
[0009]多酶共固定化是指将多种酶固定在同一载体上，能将不同酶的特点充分发挥并相互结合起来，排除测定物中的干扰因素，从而利用酶的协同效应使催化效率高于单一固定化酶。多酶共固定化技术的应用还解决了混合固定化中多酶间的传质问题，通过减小传质距离缩短了底物的转运时间，同时提高了多酶体系的效率和使用周期，更加有利于产物的分离提取，从各方面降低了生产的成本。随着固定化技术的深入研究，大量新型的综合性固定化载体及简便的固定化方法得到广泛应用，这将使多酶偶联反应体系在工业化生产中发挥更大的作用。
【发明内容】
[0010]为解决高热量糖给人们造成的健康问题，本发明提供了一种以红枣浓缩汁中D-葡萄糖、D-果糖作为底物，采用多酶偶联及固定化技术将重组酶葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶共固定化后双酶偶联促进生产低热量D-阿洛酮糖的方法。
[0011]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，按照以下步骤进行:
第一步，固定化
将定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶液加入树脂中，每1.0g树脂加酶量:0.5~2ml混合酶液，吸附温度为25°C~35°C，吸附pH=6.5~7.5，吸附时间10(Tl40min，然后加入·交联剂，交联25~35min得到固定化酶，所述交联剂体积份数为0.039T0.06% ；
本发明采用的定点突变的葡萄糖异构酶为将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸得到的突变的葡萄糖异构酶；
第二步，催化红枣汁生产阿洛酮糖
将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:6(T7(TC ;pH值:5.(T7.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为广5:1 ；5^10小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。
[0012]所述第一步中，混合酶液中的定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重量份比为4:1。
[0013]作为优选,混合酶液中的定点突变的葡萄糖异构酶的浓度为l_8mg/mL。
[0014]所述树脂为双酚A环氧乙烯基酯。
[0015]所述双酚A环氧乙烯基酯可以采用其他食品级的树脂等效替代，如:Amberliteresins IRA-120 S^Amberlite resins IRA-400 ZLB^Amberlite resins IRA-94^Amberliteresins XAD7^ Amberlite resins XAD8、Amberlite resins XAD7HP、Amberlite resinsXAD761、Amberlite resins XAD2、Amberlite resins XAD16、Sephadex resin LH-60-120、Duolite resins A568 或Duolite resins A7 (Sigma - Aldrich, St.Louis, MO)。[0016]所述交联剂为戊二醛。
[0017]所述戊二醛可以用饱和硼酸与lwt%的CaCl2溶液的混合溶液或50 wt %的NaNO3溶液和I wt %的CaCl2溶液的混合溶液等效替换。
[0018]与现有技术相比本发明具有以下有益效果。
[0019]1、在单酶催化的反应中，酶法合成前体一般通过多步化学合成反应得到，其过高的合成成本和繁琐的步骤往往影响了目标产品的竞争力；而在底物偶联多酶反应体系中，可以从来源广泛或成本低廉的化合物出发，以一种酶催化得到的合成中间体，再经另一种酶催化得到目标产物，减少了中间体的分离提取步骤，缩短了反应流程，可以大大降低分离成本并减少环境污染。
[0020]2、本发明将两种酶固定在同一载体上，两种不同酶的特性充分发挥并相互结合起来，排除测定物中的干扰因素，从而利用酶的协同效应，减小了传质距离缩短了底物的传递时间，提高了双酶体系的效率和使用周期，有利于产物的分离提取，降低了生产成本，使催化效率高于单一固定化酶和混合固定化酶。
[0021]3、用离子交换树脂进行固定化可通过离子交换吸附的方式，但是吸附法固定在树脂上的酶蛋白结合的不够牢固，在使用过程中容易脱落，故本发明选择了吸附与交联相结合的方法，以增加固定化效果；选择了加酶量、吸附时间、吸附pH、吸附温度、交联剂用量、交联时间等6个因素进行了固定化优化实验。
[0022]4、本 发明对技术方案的说明:定点突变的GI和DPE固定化酶的制备:以预处理的树脂为载体，加入适当量的酶液，并加入一定量的戊二醛进行交联。选择加酶量、吸附时间、吸附pH、吸附温度、交联剂用量、交联时间6个因素进行了固定化优化实验。通过测定两酶的回收率，得出最优固定化条件为:每1.0g树脂加酶量0.5^2ml酶液(加酶量超过2ml时，载体上的酶分子密度增大，位阻效应加剧，酶分子失活，会造成固定化酶活力回收率下降)，吸附时间10(Tl40min，吸附温度为25°C~35°C，吸附pH=6.5~7.5，交联时间25~35min，戊二醛体积分数为0.039T0.06%，在此条件下，两酶回收率分别达到20%、25%。
[0023]将上述制备两种酶共固定化后以枣汁中葡萄糖、果糖为底物，偶联反应生产低热量D-阿洛酮糖。
[0024](I)为保证枣汁的原味，对pH值进行小范围的调节，发现pH5.(T7.0时，能够生成70g/L以上的阿洛酮糖。HPLC检测红枣糖转化结果如图1所示。
[0025](2)两酶在枣汁中的基本反应条件:温度:6(T70°C;pH值:5.0^7.0 ;红枣汁与固定化酶的比例为3:广1:1 ;6~10小时候达到平衡，每小时取样。图2为模拟枣汁的葡萄糖和果糖含量，双酶偶联促进阿洛酮糖生成的反应进程。
[0026]反应达到平衡时，葡萄糖，果糖，阿洛酮糖的比例大约为45:40:15。以IL红枣汁为原料，能够生成阿洛酮糖大约为85g。红枣浓缩液中稀少糖含量达到7.0%。
[0027](3)模拟枣汁葡萄糖、果糖含量，取IOmL溶液，图3为加入7.35mg Ca2+后双酶偶联生成阿洛酮糖的平衡反应。
[0028]结果表明:枣汁成分复杂，Ca2+含量过多会严重抑制GI的活性，当果糖生成阿洛酮糖，平衡向右进行时，葡萄糖无法再生成果糖。本发明中的GI是产生定点突变后的酶，热稳定性提高的同时，空间构象的变化减小了 Ca2+对反应进程的抑制作用。【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为HPLC检测的红枣糖转化图。
[0030]图2为以模拟枣汁中糖含量不添加Ca2+为反应液的双酶偶联反应进程图。
[0031]图3为以模拟枣汁中糖含量添加Ca2+为反应液的双酶偶联反应进程图。
【具体实施方式】
[0032]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例中采用的定点突变的葡萄糖异构酶为将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸得到的突变的葡萄糖异构酶。
[0033]实施例1
一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，按照以下步骤进行: 第一步，固定化
将定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶液加入双酚A环氧乙烯基酯树脂中，每1.0g树脂加酶量2ml混合酶液，两个酶添加的比例为4:1，其中定点突变的葡萄糖异构酶的浓度为lmg/mL，吸附温度为35°C，吸附pH=7.5，吸附时间140min，然后加入交联剂戊二醛，交联时间35min，所述交联剂体积份数为0.06%，得到固定化酶；
第二步，双酶偶联催化枣汁生产D-阿洛酮糖
将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:70°C ;pH值:7.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为2:1 ;10小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。
[0034]实施例2
一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，按照以下步骤进行: 第一步，固定化
将定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶液加入双酚A环氧乙烯基酯树脂中，每1.0g树脂加酶量0.5ml混合酶液，两个酶添加的比例为4:1，其中定点突变的葡萄糖异构酶的浓度为5mg/mL，吸附温度为25°C，吸附pH6.5，吸附时间lOOmin，然后加入交联剂戊二醛，交联时间2 5min，所述交联剂体积份数为0.03%，得到固定化酶；第二步，双酶偶联催化枣汁生产D-阿洛酮糖
将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:60°C ;pH值:5.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为1:1 ;6小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。
[0035]实施例3
一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，按照以下步骤进行: 第一步，固定化
将定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶液加入双酚A环氧乙烯基酯树脂中，每1.0g树脂加酶量Iml混合酶液，两个酶添加的比例为4:1，其中定点突变的葡萄糖异构酶的浓度为6mg/mL，吸附温度为30°C，吸附pH=7，吸附时间120min，然后加入交联剂戊二醛，交联时间30min，所述交联剂体积份数为0.05%，得到固定化酶；
第二步，催化枣汁生产D-阿洛酮糖
将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:65°C ;pH值:6.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为3:1 ;8小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。[0036]实施例4
一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，按照以下步骤进行: 第一步，固定化
将定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶液加入Amberliteresins IRA-400 ZLB树脂中，每1.2g树脂加酶量:1.5ml混合酶液，两个酶添加的比例为4:1，其中定点突变的葡萄糖异构酶的浓度为4mg/mL，吸附温度为35°C，吸附pH=7.2，吸附时间125min，然后加入交联剂，交联30min得到固定化酶，所述交联剂体积份数为0.06% ;所述交联剂为饱和硼酸与lwt%的CaCl2溶液的混合溶液；
第二步，催化红枣汁生产阿洛酮糖
将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:65°C ;pH值:6.8 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为2:1 ;6小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。 [0037]实施例5
一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，按照以下步骤进行: 第一步，固定化
将定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶液加入Amberliteresins XAD761树脂中，每1.0g树脂加酶量:0.8ml混合酶液，两个酶添加的比例为4:1，其中定点突变的葡萄糖异构酶的浓度为3mg/mL，吸附温度为32°C，吸附pH=6.6，吸附时间llOmin，然后加入交联剂，交联30min得到固定化酶，所述交联剂体积份数为0.05% ;所述交联剂为50 wt %的NaNO3溶液和I wt %的CaCl2溶液的混合溶液；
第二步，催化红枣汁生产阿洛酮糖
将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:65°C ;pH值:7.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为4:1 ；5小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。
[0038]本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从那一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
【权利要求】
1.一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，其特征在于按照以下步骤进行: 第一步，固定化 将定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合酶液加入树脂中，每1.0g树脂加酶量:0.5~2ml混合酶液，吸附温度为25°C~35°C，吸附pH=6.5~7.5，吸附时间10(Tl40min，然后加入交联剂，交联25~35min得到固定化酶，所述交联剂体积份数为0.039T0.06% ;所述定点突变的葡萄糖异构酶为将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸得到的突变的葡萄糖异构酶； 第二步，催化红枣汁生产阿洛酮糖 将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:6(T7(TC ;pH值:5.(T7.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为1-5:1 ；5-10小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。
2.根据权利要求1所述的一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，其特征在于:所述第一步中，混合酶液中的定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重量份比为4:1。
3.根据权利要求1所述的一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，其特征在于:所述树脂为双酚A环氧乙烯基酯。
4.根据权利要求1所述的一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，其特征在 于:所述交联剂为戊二醛、饱和硼酸与lwt%的CaCl2溶液的混合溶液或50wt %的NaNO3溶液和I wt %的CaCl2溶液的混合溶液。
5.根据权利要求2所述的一种应用于红枣浓缩汁生产阿洛酮糖的双酶偶联与固定化技术，其特征在于:所述混合酶液中定点突变的葡萄糖异构酶的浓度为l_8mg/mL。
【文档编号】C12P19/24GK103789378SQ201310720309
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】张佳, 张佩舜, 李奠础, 郑丽萍, 张富刚, 康振奎, 王晓艳, 冯俊敏, 巩晋龙, 王小鹏 申请人:山西天骄食业有限公司