一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及双酶共表达技术及双酶偶联与固定化技术，具体涉及一种定点突变葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达制备方法以及该双酶的偶联与固定化技术以及偶联固定双酶在红枣浓缩汁生产阿洛酮糖中的应用。为解决高热量糖给人们造成的健康问题，本发明提供了一种以红枣浓缩汁中D-葡萄糖、D-果糖作为底物，采用多酶偶联及固定化技术将重组酶葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶共固定化后双酶偶联促进生产低热量D-阿洛酮糖的方法；同时提供了对葡萄糖异构酶146位氨基酸定点突变，并与D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的方法。
【专利说明】一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及双酶共表达技术及双酶偶联与固定化技术，具体涉及一种定点突变葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达制备方法以及该双酶的偶联与固定化技术以及偶联固定双酶在红枣浓缩汁生产阿洛酮糖中的应用。
【背景技术】
[0002]红枣集营养、保健、药用功能于一体，列入卫生部第一批药食兼用果品。红枣富含糖类物质，含糖量居各类果品之首，比制糖原料甘蔗、甜菜还高。鲜枣含糖量达20%-36%，干枣含糖量高达50-80%，枣中的糖类可分为以下三类:单糖(主要是葡萄糖和果糖)、双糖和多糖，其中果糖含量占43.95%、葡萄糖占42.32%、蔗糖占3.85%、低聚糖及多糖占9.86%。 [0003]我国红枣糖质资源丰富，红枣浓缩汁中富含葡萄糖以及果糖等原料。然而果糖与葡萄糖都是高能量物质，摄入会给机体带来巨大的生理压力，导致肥胖人群比例不断增大，糖尿病和心血管疾病人群逐年增加，并呈现出低龄化趋势。尽管没有显著证据证明肥胖与糖尿病和心血管疾病直接相关，但控制能量摄入对促进健康、减少脂肪积累，降低糖尿病和心血管疾病等慢性病的发生的作用已经得到公认。含有较高能量的高糖食品逐渐淡出货架，低热量、具有更多功能营养特性的功能食品在市场中受到欢迎。
[0004]D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，且在甜味强度和种类方面与D-果糖非常相似。然而，与D-果糖不同，D-阿洛酮糖在体内同化作用过程中很难代谢，且具有较低程度的热量供给。因此，D-阿洛酮糖能用作膳食的有效成分。当前广泛用作非糖甜味剂的糖醇在多于规定剂量摄取时会引起副作用，如腹泻，而D-阿洛酮糖没有这样的副作用，而且D-阿洛酮糖具有通过抑制脂肪生成酶的活性而减少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖能够用作甜味剂，该甜味剂还对有助于重量减轻。就此而论，D-阿洛酮糖作为饮食的甜味剂吸引了大量的兴趣，并且在食品工业中存在着的对开发高效生产D-阿洛酮糖的方法增加的需要。这是因为D-阿洛酮糖仅作为在theriae处理或葡萄糖异构化反应过程中的中间体，非常少量地存在于在自然界中，且不能化学合成。
[0005]木糖异构酶(xyloseisomerase, Xiase, EC 5.3.1.5),又称葡萄糖异构酶(glucose isomerase, GIase),在胞外可以催化D-葡萄糖至D-果糖的异构化反应,是食品工业生产上以淀粉为原料制备果葡糖浆的关键酶之一。
[0006]D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3_epimerase,缩写为DPE)是目前能实现D-果糖到D-阿洛酮糖之间生物转化的一种主要酶，属于酮糖3-差向异构酶家族，最适底物为D-阿洛酮糖。因此，应用基因工程技术制备葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组酶，可以有效地将D-葡萄糖转化为D-果糖、再由D-果糖转化为D-阿洛酮糖。
[0007]单酶体系应用中存在着对环境敏感、性质不稳定易失活，产物难分离提纯的问题。固定化酶技术不仅能节约酶的成本，提高酶的使用稳定性，简化后续分离步骤，更可以通过将几种酶进行联合固定化以实现多酶体系的协同反应，在反应过程中减小酶与底物的作用范围，增大酶周围的反应物浓度，提高反应的效率。随着多酶体系的研究应用，多酶体系共固定和共反应已成为一个活跃的研究领域，是酶工程领域的前沿之一。
[0008]多酶体系的固定化可分为建立在单酶固定化基础上的混合固定化酶技术和新发展起来的多酶共固定化技术。混合固定化酶是将单酶分别固定到不同载体上在同一反应体系中混合，但由于这种酶固定在不同载体上，反应中物质传递要克服两重扩散屏障，使酶促反应受到限制，需要进一步改善载体传质性能。
[0009]多酶共固定化是指将多种酶固定在同一载体上，能将不同酶的特点充分发挥并相互结合起来，排除测定物中的干扰因素，从而利用酶的协同效应使催化效率高于单一固定化酶。多酶共固定化技术的应用还解决了混合固定化中多酶间的传质问题，通过减小传质距离缩短了底物的转运时间，同时提高了多酶体系的效率和使用周期，更加有利于产物的分离提取，从各方面降低了生产的成本。随着固定化技术的深入研究，大量新型的综合性固定化载体及简便的固定化方法得到广泛应用，这将使多酶偶联反应体系在工业化生产中发挥更大的作用。
[0010]应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培养，令其超量合成其他生物体内含量极微但却具有很高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的研究方向之一。中国科学技术大学生命科学学院独家承担国家科委863项目“葡萄糖异构酶的蛋白质工程”，经十五年科技攻关目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性质改良的基因重组葡萄糖异构酶；并利用基因工程方法构建表达量极高的基因重组链霉菌工业生产菌株，已具备将基因重组葡萄糖异构酶产业化的成熟的科技条件。一些研究者从菊芋假单胞菌(Pseudomonas cichorH )中分离纯化得到D-塔格糖3_差向异构酶(DTE),用重组表达的酶固定化制成的生物反应器以60%(w/v)的果糖为底物，转化率达到25%。研究者也将根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中D-塔格糖3-差向异构酶类似蛋白的基因重组表达得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase);另外,一些研究者从土壤中筛选得到根瘤菌i^inorhiZobium sp.)`，其渗透化细胞以70%的D-果糖为底物，15h反应后D-阿洛酮糖浓度达到37mg/mL。目前并没有公开将葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达来同时得到两种酶的文献，也没有对葡萄糖异构酶对146位氨基酸定点突变的公开内容。
【发明内容】
[0011]为解决高热量糖给人们造成的健康问题，本发明提供了一种以红枣浓缩汁中D-葡萄糖、D-果糖作为底物，采用多酶偶联及固定化技术将重组酶葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶共固定化后双酶偶联促进生产低热量D-阿洛酮糖的方法；同时提供了对葡萄糖异构酶146位氨基酸定点突变，并与D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的方法。
[0012]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，按照以下步骤进行:
第一步，获得目的基因
将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸，然后将突变后的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别进行PCR扩增；将扩增后的所述定点突变的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别纯化后，分别克隆所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列；
第二步，重组表达质粒的构建
将上述得到的定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列及pCDFDuet-1载体分别用及? HI和治7/7 I进行双酶切，将D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体分别用Bgl II琳Hind JJJ进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4连接酶于16°C连接过夜，转化疋cWi DH5a感受态细胞，链霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序；产物再将阳性转化子的质粒转入宿主菌中诱导表达得到重组菌；
第三步，将重组菌经离心收集，并超声破碎，再次离心即得到定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的粗酶液；
第四步，固定化
将得到的粗酶液加入树脂中，每1.0g树脂加酶量:0.5^2ml基因重组制备的粗酶液，吸附温度为25°C~35°C，吸附pH=6.5~7.5，吸附时间10(Tl40min，然后加入交联剂，交联25~35min得到固定化酶，所述交联剂体积份数为0.03%~0.06% ；
第五步，催化红枣汁生产阿洛酮糖
将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:6(T7(TC ;pH值:5.(T7.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为广5:1 ；5^10小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。
[0013]所述第一步中定点突变的步骤为:
以pET-28a-GI为模板，设计完全互补配对的上、下游突变引物；按以下程序进行PCR反应:95°C 3 min ；94 °C 30s, 60°C 30 s，68°C 6min，共 16 个循环；68°C IOmin ;PCR 产物经DpnI消化后，转化疋coli DH5 a感受`态细胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取转化子培养并测序，若测序发现未正确突变，则重新挑取单菌落测序或重新突变后测序，直至突变成功；
所述上、下游突变引物为:
F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC
R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。
[0014]所述第一步定点突变后的葡萄糖异构酶核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列进行PCR扩增的条件为:
突变葡萄糖异构酶核苷酸序列引物:
上游引物:5' -GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3'
下游引物:5, -GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3'
D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列引物:
上游引物:5' -CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3'
下游引物:5' -CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3'
PCR反应体系(50ML)为10\了&9缓冲溶液5叱，模板0嫩1叱，浓度为lOMmol.L—1的引物2ML，浓度为2.Smmol*^1的dNTPs 4ML，TaqDNA聚合酶0.3ML，超纯水35.7ML，混匀；反应条件:95°C 5min ；94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 2min，32 个循环；72°C IOmin0
[0015]所述第二步中，所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体的双酶切用酶为及丽和治w I;所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与p⑶FDuet-1载体的双酶切用酶为汝"/ II琳Hind III。
[0016]所述第二步中诱导表达的条件为:将构建好的重组菌在培养基中培养，于37°C水浴振荡培养过夜，按1%的接种量转接于装有30mL培养基的250mL三角瓶中，继续培养至OD600为0.6~0.8时，加入IPTG终浓度为诱导表达。
[0017]所述第四步中，作为优选调节粗酶液中的定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重量份比为4:1。
[0018]所述树脂为双酚A环氧乙烯基酯。
[0019]所述交联剂为戊二醛、饱和硼酸与lwt%的CaCl2溶液的混合溶液或50 wt %的NaNO3溶液和I wt %的CaCl2溶液的混合溶液，优选戊二醛。
[0020]与现有技术相比本发明具有以下有益效果。
[0021]1、芽孢杆菌来源的葡萄糖异构酶146位氨基酸为精氨酸(Arg)，在高温下，精氨酸容易发生脱氨反应。Arg处于2个0折叠中间的a转角处,Pro相对于Arg具备一定的刚性结构，形成的转角活动度小，可能影响GI的热稳定性。经定点突变后146位氨基酸精氨酸(Arg)变为脯氨酸(Pro)，Pro属于亚氨基酸，处于芽孢杆菌葡萄糖异构酶P转角的第2个氨基酸，有增强蛋白的热稳定性的作用。
[0022]2、离子半径越大，其水合离子半径越小，越有利于它钻入到凹陷的区域。对于Mg2+、Co2+和Mn2+等离子半径小于0.08 nm的激活离子，当离子和酶结合后，使活性部位(疏水区)外露，以便和底物结合。Ca2+等离子半径大于0.08 nm的抑制剂，水合半径更小，更易钻入活性口袋和酶紧密结合，使疏水区减少，反而有抑制酶活的作用。定点突变后，葡萄糖异构酶146位氨基酸精氨酸(Arg)变为脯氨酸。此氨基酸处于2个P折叠中间的a转角处，Pro相对于Arg具备一定的刚性结构，形成的转角活动度小。146位氨基酸接近GI的活性中心，GI空间构象发生微小变化，Ca2+不易钻入活性口袋，和酶活性中心结合松散，减小了干扰，提闻了果糖广率。
[0023]3、基因工程技术制备重组酶:自然界存在的葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶含量少，活力低，野生菌株培养不易(厌氧)以及酶制备较困难(产酶水平低)，大规模生产纯化工艺较为复杂，限制了其扩大应用。因此，通过基因重组技术构建工程菌，分泌表达高活性葡萄糖苷酶对其实现工业化具有重要意义。
[0024]4、菌种的选择:经筛选后，来源于芽孢杆菌属sp.)的葡萄糖异构酶活力与其它菌种来源相比活力最高；来源于沿--sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶与来源于其它菌种的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、D-塔格糖3-差向异构酶相比，热稳定性最好，D-果糖转化生成D-阿洛酮糖的效率最高，更适合D-果糖生成D-阿洛酮糖的工业生产。
[0025]5、质粒的选择:本发明需同时表达葡萄糖异构酶与D-阿洛酮糖3-差向异构酶两种酶，选择的pCDFDuet-1为原核共表达质粒，含两个17启动子，包括两个多基因结合位点，可共表达两个靶蛋白，克服了两个质粒在同一宿主中的不相容性。
[0026]6、重组酶的酶学性质:异源表达产物(重组酶)的性质常常因为分子操作和所采用的表达宿主细胞的生理特征而发生改变，本研究结果显示，重组酶葡萄糖异构酶(GI)和D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)的主要酶学性质与天然酶相比，没有本质上的改变。其中，最适作用温度、最适作用pH、热稳定性与天然酶相似；在金属离子依赖性方面，两酶共表达时除对Mg2+依赖性有所改变外，无显著改变。
[0027]7、在单酶催化的反应中，酶法合成前体一般通过多步化学合成反应得到，其过高的合成成本和繁琐的步骤往往影响了目标产品的竞争力；而在底物偶联多酶反应体系中，可以从来源广泛或成本低廉的化合物出发，以一种酶催化得到的合成中间体，再经另一种酶催化得到目标产物，减少了中间体的分离提取步骤，缩短了反应流程，可以大大降低分离成本并减少环境污染。
[0028]8、本发明将两种酶固定在同一载体上，两种不同酶的特性充分发挥并相互结合起来，排除测定物中的干扰因素，从而利用酶的协同效应，减小了传质距离缩短了底物的传递时间，提高了双酶体系的效率和使用周期，有利于产物的分离提取，降低了生产成本，使催化效率高于单一固定化酶和混合固定化酶。
[0029]9、用离子交换树脂进行固定化可通过离子交换吸附的方式，但是吸附法固定在树脂上的酶蛋白结合的不够牢固，在使用过程中容易脱落，故本发明选择了吸附与交联相结合的方法，以增加固定化效果；选择了加酶量、吸附时间、吸附pH、吸附温度、交联剂用量、交联时间等6个因素进行了固定化优化实验。
[0030]10、本发明对偶联与固定化技术方案的说明:GI和DPE固定化酶的制备:以预处理的树脂为载体，加入适当量的酶液，并加入一定量的戊二醛进行交联。选择加酶量、吸附时间、吸附pH、吸附温度、交联剂用量、交联时间6个因素进行了固定化优化实验。通过测定两酶的回收率，得出最优固定化条件为:每1.0g树脂加酶量0.5"2ml粗酶液(加酶量超过2ml时，载体上的酶分子密度增大，位阻效应加剧，酶分子失活，会造成固定化酶活力回收率下降)，吸附时间10(Tl40min，吸附温度为25°C~35°C，吸附pH=6.5~7.5，交联时间25~35min，戊二醛体积分数为0.039T0 .06%，在此条件下，两酶回收率分别达到20%、25%。
[0031]将上述制备两种酶共固定化后以枣汁中葡萄糖、果糖为底物，偶联反应生产低热量D-阿洛酮糖。
[0032](I)为保证枣汁的原味，对pH值进行小范围的调节，发现pH5.(T7.0时，能够生成70g/L以上的阿洛酮糖。HPLC检测红枣糖转化结果如图1所示。
[0033](2)两酶在枣汁中的基本反应条件:温度:6(T70°C;pH值:5.0^7.0 ;红枣汁与固定化酶的比例为3:广1:1 ;6~10小时候达到平衡，每小时取样。图2为模拟枣汁的葡萄糖和果糖含量，双酶偶联促进阿洛酮糖生成的反应进程。
[0034]反应达到平衡时，葡萄糖，果糖，阿洛酮糖的比例大约为45:40:15。以IL红枣汁为原料，能够生成阿洛酮糖大约为85g。红枣浓缩液中稀少糖含量达到7.0%。
[0035](3)模拟枣汁葡萄糖、果糖含量，取IOmL溶液，图3为加入7.35mg Ca2+后双酶偶联生成阿洛酮糖的平衡反应。
[0036]结果表明:枣汁成分复杂，Ca2+含量过多会严重抑制GI的活性，当果糖生成阿洛酮糖，平衡向右进行时，葡萄糖无法再生成果糖。本发明中的GI是产生定点突变后的酶，热稳定性提高的同时，空间构象的变化减小了 Ca2+对反应进程的抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为HPLC检测的红枣糖转化图。
[0038]图2为以模拟枣汁中糖含量不添加Ca2+为反应液的双酶偶联反应进程图。[0039]图3为以模拟枣汁中糖含量添加Ca2+为反应液的双酶偶联反应进程图。
[0040]图4为含有定点突变的酶葡萄糖异构酶的粗酶液热稳定。
[0041]图5为含有定点突变的酶葡萄糖异构酶的粗酶液和未突变酶葡萄糖异构酶粗酶液在80 0C时的热稳定性对比图。
[0042]图6为密码子优化后的定点突变的酶葡萄糖异构酶(Linel)和未突变的酶葡萄糖异构酶(Line2)的SDS-PAGE对比图。
[0043]图7为p⑶FDuet-1质粒载体图谱。
[0044]图8为蛋白质表达SDS-PAGE分析图。
[0045]图9为温度、pH值对阿洛酮糖生成量的影响折线图。
【具体实施方式】
[0046]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0047]本发明采用芽孢杆菌作为葡萄糖异构酶的酶源，大肠杆菌作为重组酶核苷酸序列宿主菌。
[0048]本发明前三步采用基因工程技术制备共表达重组酶的具体流程为:
菌种筛选_ GI定点突变—载体选择获得目的基因—重组表达质粒构建目的蛋白的诱导表达一? SDS-PAGE ?分析鉴定^酶学性质分析。
[0049]一、酶基因来源:
经初筛与复筛、分子鉴定及酶学性质研究筛选出葡萄糖异构酶活性最高的菌株，利用NCBI中的BLAST软件对活性最高菌株进行16SrDNA序列分析发现，该菌株与芽孢杆菌属{Bacillus印.)同源性最近。又根据同源序列搜索，并且下载一些相关菌种的16SrDNA序列，利用MEGA4.0软件来构建系统进化树，进一步探索该菌株与芽孢杆菌sp.).的亲缘关系,发现该菌株与5/7.进化距离最短,这与BLAST比对的结果一致。
[0050]D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase),根据根癌农杆菌的DPE的序列在NCBI上BLAST发现，根据Takara Bio Inc公司提供“保守假定蛋白”(ZP_04858451)的序列合成Mmiiiococcus sp.DPE基因的全部核苷酸序列。
[0051 ] 对葡萄糖异构酶定点突变位点的选择
对不同来源的葡萄糖异构酶进行蛋白质序列比对，并通过DS软件对不同嗜热细菌葡萄糖异构酶三维结构进行分析，发现来源于嗜热细菌葡萄糖异构酶的146位氨基酸为脯氨酸(Pro)，而此芽孢杆菌来源的葡萄糖异构酶均为精氨酸(Arg)。在高温下，精氨酸容易发生脱氨反应，此氨基酸处于2个P折叠中间的a转角处，Pro相对于Arg具备一定的刚性结构，形成的转角活动度小，可能影响GI的热稳定性。因此选择位点R146P进行定点诱变。
[0052]对葡萄糖异构酶的定点突变
【权利要求】
1.一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于按照以下步骤进行: 第一步，获得目的基因 将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸，然后将突变后的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别进行PCR扩增；将扩增后的所述定点突变的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别纯化后，分别克隆所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列； 第二步，重组表达质粒的构建 将上述得到的定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列及PCDFDuet-1载体分别用及? HI和治7/7 I进行双酶切，将D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体分别用Bgl II琳Hind JJJ进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4连接酶于16°C连接过夜，转化疋cWi DH5a感受态细胞，链霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序；产物再将阳性转化子的质粒转入宿主菌中诱导表达得到重组菌； 第三步，将重组菌经离心收集，并超声破碎，再次离心即得到定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的粗酶液； 第四步，固定化 将得到的粗酶液加入树脂中，每1.0g树脂加酶量:0.5^2ml基因重组制备的粗酶液，吸附温度为25°C~35°C，吸附pH=6.5~7.5，吸附时间10(Tl40min，然后加入交联剂，交联25~35min得到固定化酶，所述交联剂体积份数为0.03%~0.06% ； 第五步，催化红枣汁生产阿洛酮糖 将红枣汁加入所述固定化酶中，控制温度:6(T7(TC ;pH值:5.(T7.0 ;所述红枣汁与固定化酶的重量份比为广5:1 ；5^10小时候完成催化反应，得到D-阿洛酮糖混合液。
2.根据权利要求1所述的一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于所述第一步中定点突变的步骤为: 以pET-28a-GI为模板，设计完全互补配对的上、下游突变引物；按以下程序进行PCR反应:95°C 3 min ；94 °C 30s, 60°C 30 s，68°C 6min，共 16 个循环；68°C IOmin ;PCR 产物经DpnI消化后，转化疋coli DH5 a感受态细胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取转化子培养并测序，若测序发现未正确突变，则重新挑取单菌落测序或重新突变后测序，直至突变成功； 所述上、下游突变引物为:
F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC
R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。
3.根据权利要求1所述的一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于所述第一步定点突变后的葡萄糖异构酶核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列进行PCR扩增的条件为: 突变葡萄糖异构酶核苷酸序列引物: 上游引物:5' -GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3'下游引物:5, -GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3, D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列引物: 上游引物:5' -CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3' 下游引物:5' -CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3' PCR反应体系(50ML)为10\了&9缓冲溶液5叱，模板0嫩1叱，浓度为lOMmol.L—1的引物2ML，浓度为2.Smmol*^1的dNTPs 4ML，TaqDNA聚合酶0.3ML，超纯水35.7ML，混匀；反应条件:95°C 5min ；94°C 45s, 53°C 45s, 72°C 2min，32 个循环；72°C IOmin0
4.根据权利要求1所述的一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于:所述第二步中，所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体的双酶切用酶为及丽和治w I;所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与p⑶FDuet-1载体的双酶切用酶为汝"/ IIMHind III。
5.根据权利要求1所述的一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于:所述第二步中诱导表达的条件为:将构建好的重组菌在培养基中培养，于37°C水浴振荡培养过夜，按1%的接种量转接于装有30mL培养基的250mL三角瓶中，继续培养至OD6tltl为0.6~0.8时，加入IPTG终浓度为lmmol诱导表达。
6.根据权利要求1所述的一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于:所述第四步中，粗酶液中的定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重量份比为4:1。
7.根据权利要求1所述的一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于:所述树脂为双酚A环氧乙烯基酯。
8.根据权利要求1所述的一种生物转化红枣单糖开发含阿洛酮糖功能性枣汁的技术，其特征在于:所 述交联剂为戊二醛、饱和硼酸与lwt°/d^CaCl2溶液的混合溶液或50 wt %的NaNO3溶液和I wt %的CaCl2溶液的混合溶液。
【文档编号】C12N15/70GK103789377SQ201310720292
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】王晓艳, 门燕, 冯俊敏, 孙媛霞, 张佩舜, 朱玥明, 康振奎, 巩晋龙, 郑丽萍, 王小鹏, 李奠础 申请人:山西天骄食业有限公司, 中国科学院天津工业生物技术研究所, 山西天骄生物集团有限公司