专利名称：金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，主要涉及通过构建金银花cDNA文库技术获得查尔酮异构酶基因及其编码产物，属于药用植物基因工程领域。
背景技术：
药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。黄酮类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，且黄酮类成分也已被2010年药典作为金银花的质量控制标准。查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)是第1个被认识的黄酮类化合物合成相关酶，也是黄酮代谢途径中的关键酶之一，它催化柚皮苷查尔酮异构化形成有生物活性的二羟基黄烷酮，对植物具有非常重要的生理意义。因此查尔酮异构酶(LjCHI)基因的获得，为用基因工程手段提高金银花有效部位的含量提供重要基础。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的金银花黄酮类酶基因及其氨基酸序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因。本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。本发明所提供的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)，为以下核苷酸序列之一(I)SEQ ID No. 1 的 DNA 序列；(2)在严格条件下与SEQ ID No. 1的DNA序列杂交且编码具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质分子的DNA分子；(3)编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(4)编码对SEQ ID No. 2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质的核苷酸序列。本发明所提供的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)，其特征在于，是以下氨基酸序列之(1)具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID No. 2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的序列。含有本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列的重组载体，
3如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围含有本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列的宿主细胞， 如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述宿主细胞为有价值的活体材料。本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的金银花查尔酮异构酶 (LJCHI)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下所说的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因的DNA分子包括编码具有金银花查尔酮异构酶(LjCHI)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 1 中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在 40-55°C条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1_980的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. 1 中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列。本发明分离出的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因多肽包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID N0.2序列的多肽。本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的"DNA是指，该DNA 或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。本发明中术语“金银花查尔酮异构酶(LjCHI)(或多肽)”基因指编码具有金银花查尔酮异构酶(LjCHI)活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-980位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的编码框第1-980位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0. 1，中第1-980位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0. 2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与 SEQ IDN0. 1中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为，1-90个，较佳地，1-60个，更佳地，1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60 个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。本发明中术语“金银花查尔酮异构酶(LjCHI)蛋白或多肽”指具有金银花查尔酮异构酶(LjCHI)活性的SEQ ID N0. 2序列的多肽。该术语还包括具有与天然金银花查尔酮异构酶(LjCHI)相同功能的SEQ ID N0. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨
4基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括金银花查尔酮异构酶(LjCHI)的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的金银花金银花查尔酮异构酶(LjCHI)多肽的变异形式包括 同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与金银花查尔酮异构酶(LjCHI) DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用金银花查尔酮异构酶(LjCHI)多肽的血清获得的多肽或蛋白。本发明中金银花查尔酮异构酶(LjCHI)保守性变异多肽指与SEQ ID NQ. 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽可根据表1，进行替换而产生。本发明还包括金银花查尔酮异构酶(LjCHI)或多肽的类似物。这些类似物与天然金银花查尔酮异构酶(LjCHI)多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基 (如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸) 的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。表1 保守性变异多肽中的取代残基
权利要求
1.一种金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一(1)SEQID No. 1 的 DNA 序列；(2)在严格条件下与SEQID No. 1的DNA序列杂交且编码具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质分子的DNA分子；(3)编码SEQID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(4)编码对SEQID No. 2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
2.一种金银花查尔酮异构酶(LjCHI)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一(1)具有SEQID No. 2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID No. 2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的序列。
3.重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列。
4.宿主细胞，其特征在于其含有权利要求1所述的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列。
5.要求1所述的基因和权力要求2所述的氨基酸序列在金银花育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种查尔酮异构酶基因及其编码的蛋白酶与用途，该基因为首次从金银花的cDNA文库中得到，填补了我国传统中药材金银花中分离克隆出查尔酮异构酶基因的空白。本发明所提供的查尔酮异构酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的查尔酮异构酶基因可以通过生物技术提高金银花中黄酮类活性成分金银花黄酮类的含量，有助于金银花药材的品质改良，同时可以进行品种选育，具有很好的应用前景。
文档编号C12N1/19GK102465136SQ201010533198
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者秦双双, 袁媛, 黄璐琦 申请人:中国中医科学院中药研究所