编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸和使用其生产阿洛酮糖的方法
【专利摘要】提供了阿洛酮糖3?差向异构酶、编码该酶的多核苷酸、携带该多核苷酸的重组载体、含有该重组载体的重组细胞及它们的用途。KCCM11405P20130329
【专利说明】
编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸和使用其生产阿洛酮糖 的方法
技术领域
[0001] 本公开涉及阿洛酮糖3-差向异构酶、编码该阿洛酮糖3-差向异构酶的多核苷酸、 携带该多核苷酸的重组载体、含有该重组载体的重组细胞及它们在生产阿洛酮糖中的用 途。
【背景技术】
[0002] 阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，甜度为D-果糖的70%。与D-果糖不同，阿洛 酮糖在体内很大程度上不被代谢，因此发现用于在血糖控制、齿洞预防和肝脏的脂肪生成 抑制中用作各种功能食品的糖成分。
[0003] 广泛用作糖替代物的糖醇在摄入一定量或更多量时具有引起腹泻的副作用，而已 知阿洛酮糖没有副作用。
[0004] 因此，阿洛酮糖已经引起人们对将其用作甜味剂有广泛兴趣，但是由于阿洛酮糖 在自然界很少发现，因此其有效生产是应用于食品工业的前提条件。
[0005] 通常，阿洛酮糖通过化学方法由D-果糖通过钼酸根离子的催化作用生产得到。同 时，最近已知使用来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的阿洛酮糖差向异构 酶的生物学方法是最有效的方法之一。化学方法具有在糖蜜处理或葡萄糖异构化过程中只 产生极少量阿洛酮糖的缺点，该方法昂贵，且产生副产物。此外，生物学方法的缺点在于生 产成本高，且产量低。
[0006] 因此，需要可以在适于工业化的温度和pH条件下以高产量且无副产物产生的方式 生产阿洛酮糖的方法。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] -种实施方式提供能够将D-果糖转化为阿洛酮糖的酶的氨基酸序列。
[0009] 另一种实施方式提供编码该酶的多核苷酸。
[0010] 再一种实施方式提供携带该多核苷酸的重组载体。
[0011] 又一种实施方式提供含有该重组载体的重组细胞。
[0012] 又一种实施方式提供用于生产阿洛酮糖的组合物，所述组合物包含选自由以下组 成的组中的至少一种:酶、编码所述酶的多核苷酸、携带所述多核苷酸的重组载体和含有所 述重组载体的重组细胞。
[0013] 还有一种实施方式提供一种使用选自由以下组成的组中的至少一种生产阿洛酮 糖的方法:酶、编码所述酶的多核苷酸、携带所述多核苷酸的重组载体和含有所述重组载体 的重组细胞。
[0014] 技术方案
[0015] 从土壤中分离并鉴定具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的高活性的新型粘着剑菌 (Ensifer adhaerens)菌株(粘着剑菌SYG29;登记号:KCCM11405P)。对粘着剑菌菌株的全部 基因的分析首先揭示出编码负责将D-果糖转化为阿洛酮糖的酶的多核苷酸及其核苷酸序 列。
[0016] 另外，将该多核苷酸插入重组载体中，并使其表达以提供具有由D-果糖生产阿洛 酮糖的活性的酶，从而完成了本发明。
[0017] 即，在本发明中，鉴定功能未知的蛋白的氨基酸序列和编码该蛋白的基因的核苷 酸序列，该蛋白被认为是能够以高产量生产阿洛酮糖的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。因此，本 发明的一个方面涉及该基因和该蛋白在生产阿洛酮糖中的用途以及该蛋白作为D-阿洛酮 糖差向异构酶的用途。
[0018] 一种实施方式提供了一种蛋白，该蛋白包含SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，或基 本由该氨基酸序列组成。该蛋白可能具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性。因此，另一种实 施方式提供阿洛酮糖差向异构体酶，该阿洛酮糖差向异构酶包含SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列或基本由该氨基酸序列组成，并且具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性。该酶可能 具有D-阿洛酮糖3-差向异构化活性。例如，该蛋白或该酶可以得自（源自）粘着剑菌，但是不 限于此。
[0019]该蛋白或该酶可以具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，但是只要该氨基酸序列 保留将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性(例如，D-阿洛酮糖3-差向异构化活性），就可通过置 换、插入和/或缺失使其突变。例如，该蛋白或该酶可以在保留将D-果糖转化为阿洛酮糖的 活性的情况下包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、90%或更 高、95%或更高、98%或更高或99%或更高的同源性的氨基酸序列。
[0020] 如通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)测得的，具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1共有至少70%的同源性的氨基酸序列的蛋白或酶 的分子量范围可以为27~33kDa，例如29~31kDa。
[0021]根据本发明的另外的方面，本发明提供编码包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基 本由该氨基酸序列组成的蛋白的多核苷酸。此外，本发明的又一方面提出包含(携带)编码 该蛋白的多核苷酸的重组载体。本发明的又一方面提供含有(包含）该重组载体的重组细 胞，即用该重组载体转化的细胞。因此，该重组细胞可以表达所述蛋白。
[0022]编码该蛋白的多核苷酸可以包含以下，或基本由以下组成：SEQ ID N0:2所示的核 苷酸序列或与SEQ ID N0:2具有基本同一性的核苷酸序列。如本文所使用的，术语"基本同 一性"是指，如通过比对程序所分析的，多核苷酸包含与参考序列相比具有至少70%序列同 一^性、至少80 %序列同一1性、至少90 %序列同一1性、至少95 %序列同一1性、至少98 %序列同 一性、至少99%序列同一性或100%序列同一性的序列，并且通过该多核苷酸序列编码的蛋 白保留将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性。
[0023] 本领域普通技术人员将容易意识到，具有基本同一性的编码与参考酶活性相同的 酶蛋白的多核苷酸可通过借助本领域公知的基因工程技术进行置换、插入或缺失一个或多 个核苷酸来制备。两个或多个序列之间的同一性比较可以使用本领域已知的计算机程序来 计算并用百分比（％)表示。
[0024] 多核苷酸可以自身单独使用，或者可以以被重组载体携带的方式使用。术语"重组 载体"是指能够递送可操作地连接的感兴趣的多核苷酸的重组核酸分子。感兴趣的多核苷 酸可以可操作地连接至选自启动子和转录终止因子中的至少一个转录调控元件。此外，多 核苷酸可以可操作地连接至例如化学化合物诱导元件或温度敏感元件。化学化合物诱导元 件可以选自由乳糖操纵子、T7启动子和trc启动子组成的组。源自T7噬菌体的T7启动子也含 有T7终止子。
[0025] 可以使用本领域公知的方法将重组载体构建为克隆或表达用载体。任何适合在基 因重组中使用的载体都可以用作重组载体。例如，该载体可以选自由质粒表达载体、病毒表 达载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒)和具有相同功能的病毒载体组 成的组，但并不限于它们。详细地，重组载体可以适于在大肠杆菌中表达，并且可以基于选 自由口￡1\口131^1'1'(^1^和口1](]组成的组中的一种进行构建。
[0026] 只要具有允许蛋白表达(过量表达)的表达系统，任何微生物都可以用作重组载体 转化为的宿主细胞。例如，大肠杆菌可能是有用的。大肠杆菌的实例包括但不限于:BL21、 厕109、1(-12、1^392、1^1、0115€[和13110，优选121(0￡3)。此外，宿主细胞可能是从包括以下 的肠细菌和菌株中可选择的：芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subti 1 is)和苏云金芽抱杆菌（Baci 1 lus thuringiensis);棒状杆菌（Corynebacteria spp ?)，诸如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum);沙门氏菌属（Salmonella spp.)，诸如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium);粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens);和各种假单胞菌属(Pseudomonas spp.) 0
[0027] 对于重组载体转化为宿主细胞，其可以通过本领域中公知的任何方法来实现。例 如，该方法的示例性的非限制性实例包括：原生质体融合法、电穿孔法、基因枪法 (projectile bombardment)和病毒载体感染法。
[0028] 如上所述，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白为 具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的高活性的酶蛋白。因此，该包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列 或基本由该氨基酸序列组成的蛋白或表达该蛋白的重组细胞可以有用地用于阿洛酮糖的 生产。
[0029] 根据本发明的再一方面，本发明提出一种用于生产阿洛酮糖的组合物，包含选自 由以下组成的组中的至少一种:包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组 成的蛋白、编码该蛋白的多核苷酸、携带该多核苷酸的重组载体、含有该重组载体的重组细 胞、该重组细胞的培养物和该重组细胞的裂解物。用于生产阿洛酮糖的组合物可以用于由 用作底物(base)的D-果糖生产阿洛酮糖。含有由重组细胞生产的酶蛋白的该培养物可以包 含该重组细胞，或者可以另外为不含细胞的形式。所述裂解物可以来源于重组细胞的裂解 或可以包含通过使裂解物离心得到的上清液，以使其在任何一种情况下都含有由重组细胞 产生的酶蛋白。除非本文另作说明，重组细胞是指选自由菌株的细胞群、菌株的培养物和菌 株的裂解物组成的组中的至少一种。
[0030] 根据本发明的又一方面，本发明提供一种使用选自以下中的至少一种生产阿洛 酮糖的方法:包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白、编码该蛋 白的多核苷酸、携带该多核苷酸的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、该重组细胞的培 养物和该重组细胞的裂解物(下文统称为"酶蛋白"）。该生产阿洛酮糖的方法包括酶蛋白与 D-果糖的反应。在一种实施方式中，酶蛋白与D-果糖之间的反应可以通过使酶蛋白与D-果 糖接触来进行。在另一种实施方式中，酶蛋白与D-果糖之间的接触可以通过例如将酶蛋白 与D-果糖混合或使D-果糖与固定在支持物上的酶蛋白接触来进行。在另外的实施方式中， 酶蛋白与D-果糖之间的反应可以通过在含有D-果糖的培养基中培养重组细胞的细胞群来 进行。酶蛋白与D-果糖之间的反应导致D-果糖转化，从而由D-果糖生产阿洛酮糖。
[0031 ] 在生产阿洛酮糖的方法中，当使用在反应混合物中浓度为0.001mg/ml~2 .Omg/ ml、0?003mg/ml~2.Omg/ml、0?003mg/ml~1?Omg/ml、0.Olmg/ml~2?Omg/ml或0?01mg/ml~ 1. Omg/ml的酶蛋白时，可以在阿洛酮糖的生产中带来效率。当使用浓度低于下限的酶蛋白 时，阿洛酮糖的转化率可能差。另一方面，过高浓度的酶蛋白降低阿洛酮糖生产的工业经济 性。
[0032]为了在该方法中有效地生产阿洛酮糖，使用在反应混合物中浓度为40~80% (重 量/体积），例如浓度为55~75% (重量/体积）的用作底物的D-果糖。D-果糖的浓度低于下限 可能以这种方式降低阿洛酮糖的经济可行性。另一方面，如果D-果糖的浓度高于上限，D-果 糖不太容易溶解。因此，浓度优选落入该范围内。D-果糖可以为在缓冲液或水（例如，蒸馏 水)中的溶液的形式。
[0033]在较高的pH值下，酶蛋白活性更强。它们在约为7或高于7的pH下，或在约为7.5或 高于7.5的pH下，例如在7.5~10的pH下保持90%或更高的活性(参见图5)。当考虑这种对于 酶蛋白最佳的条件时，反应可以在以下pH下进行:pH为7或更高或pH为7.5或更高，例如，pH 为7~ll、pH为7~10、pH为7~9、pH为7.5~11411为7.5~10或口11为7.5~9。另外，反应可以 在30°C或更高的温度，例如40°C或更高的温度下进行。然而，底物D-果糖在70°C或更高的温 度下可能有变褐的倾向。因此，反应可以在40~70°C，例如42~65°C、45~62°C、50~60°C或 52~57°C的温度条件下进行。另外，较长的反应时间导致较高的阿洛酮糖转化率。推荐使反 应进行1小时或更长，例如2小时或更长、3小时或更长、4小时或更长、5小时或更长或6小时 或更长。然而，反应时间优选设定在48小时内，因为当反应时间延长超过48小时时，阿洛酮 糖的转化率的增量变得微小，或者可能减小。因此，反应时间可以设定为1~48小时、2~48 小时、3~48小时、4~48小时、5~48小时或6~48小时。考虑到工业和经济方面，反应时间可 以落入1~48小时、2~36小时、3~24小时、3~12小时或3~6小时的范围内，但是并不限于 此。选择该条件使由D-果糖到阿洛酮糖的转化率最大。
[0034] 另外，当在生产阿洛酮糖的方法中使用重组细胞时，其浓度可以设定为在整个反 应混合物为511^((1〇￥:干细胞重量)/1111或更高，例如5~10〇11^((1〇￥)/1]11、10~9〇11^((1〇￥)/1]11、 20 ~80mg(dcw)/ml、30 ~70mg(dcw)/ml、40 ~60mg(dcw)/ml 或 45 ~55mg(dcw)/ml。如果细胞 群的浓度低于下限，表现出差的阿洛酮糖转化活性或几乎没有阿洛酮糖转化活性。另一方 面，浓度超过上限意味着细胞拥挤，所述细胞有可能起到阿洛酮糖的整个转化率优化的障 碍物的作用。
[0035] 具有阿洛酮糖转化活性的酶蛋白可以表现出活性受金属离子控制的金属酶的性 质，因此，金属离子的存在可能促进由酶蛋白催化的反应，从而提高阿洛酮糖的产量。能够 促进阿洛酮糖的产量提高的金属离子可以选自由以下组成的组:铜离子、锰离子、钙离子、 镁离子、锌离子、镍离子、钴离子、铁离子、铝离子及它们的任意组合。例如，可以使用锰离子 和镁离子中的任意一种或二者。当金属离子的量低于O.lmM时，对阿洛酮糖的产量的提高只 有略微作用。因此，使用量为O.lmM或更大的金属离子。另一方面，当金属离子的量超过5mM 时，与该过剩的量相比，添加的作用是微小的。这样，金属离子的量设定为5mM或更少。例如， 使用量为0.1 mM~5mM，例如0.1~2mM或0.5~1.5mM的金属离子。
[0036] 因此，用于生产阿洛酮糖的组合物可以进一步包含其种类和量为如上所述的金属 离子。同样，用于生产阿洛酮糖的方法可以进一步包括其添加种类和量为如上所述的金属 离子。在一种实施方式中，可以向底物D-果糖或D-果糖与酶蛋白的混合物中添加金属离子。 在另一种实施方式中，金属离子可以添加到固定有酶蛋白的支持物中（在添加 D-果糖之前） 或固定有酶蛋白的支持物与D-果糖的混合物中（在添加 D-果糖之后），或者金属离子可以以 与D-果糖的混合物的形式添加或单独与D-果糖一起添加。使用时，可以在向培养基中添加 金属离子之后、之前或在向培养基中添加金属离子的同时在培养基中培养重组细胞。
[0037] 只要为长时间保持菌株或由该菌株产生的酶蛋白的活性创建环境，就可以使用任 何用于将该菌株或该酶蛋白固定到其上的支持物。例如，褐藻酸钠可以用作该支持物。褐藻 酸钠，一种天然存在的在褐藻的细胞壁中大量发现的胶体多糖，由0-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸组成，二者之间为共价m-4键。考虑到将菌株或酶稳定地固定于其上，线性聚合 物可能对于阿洛酮糖的产量有利。在一种实施方式中，可以使用1.5~4.0% (重量/体积)的 褐藻酸钠溶液(例如，褐藻酸钠水溶液），例如约2.5 % (重量/体积）的褐藻酸钠溶液来固定 菌株。作为实例，使菌株的细胞群、含有由该菌株产生的酶的培养肉汤或该菌株的裂解物与 1~2体积的褐藻酸钠水溶液混合，使用注射器栗和真空栗将该混合物滴入0.2M的钙离子溶 液中，以形成该菌株的细胞群、含有由该菌株产生的酶的培养物或该菌株的裂解物固定于 其上的珠。可以使用通常的方法(例如，透析、沉淀、吸附、电泳、亲和色谱法或离子交换色谱 法)将酶从菌株、菌株的培养物或菌株的裂解物中纯化出来。
[0038] -种实施方式提供用于生产阿洛酮糖的方法，包括使选自由以下组成的组中的至 少一种与D-果糖反应(或接触）：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、编码该蛋白的多核 苷酸、携带该多核苷酸的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、该重组细胞的培养物和该 重组细胞的裂解物。
[0039] 在一种实施方式中，用于生产阿洛酮糖的方法可以包括：制备和纯化阿洛酮糖差 向异构酶蛋白，所述阿洛酮糖差向异构酶蛋白包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列共有70%或更高的同源性的氨基酸序列；以及使该蛋白与D-果糖反 应(或接触）。
[0040] 在一种实施方式中，用于生产阿洛酮糖的方法包括:培养和分离表达包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白的重组细胞；以及使该重组细胞 或从该重组细胞分离出的酶蛋白与D-果糖反应(或接触）。
[0041] 重组细胞的培养可以在培养基中和在本领域技术人员根据菌株(宿主细胞)的性 质容易选择的条件下进行。例如，培养可以为连续型培养、半连续型培养或分批型培养 (batch-type culture)，但不限于此。培养基包含溶液和用于支撑宿主细胞（例如大肠杆 菌)或细胞内含物的固体、半固体或刚性支持物，并且可以选自由标准2YT、LB、S0B和TB培养 基组成的组。
[0042] 通常，重组细胞的培养物可以在适合培养宿主细胞(例如，大肠杆菌）的条件下获 得。例如，可以在35 °C~37 °C下在以150~250rpm搅拌下培养重组细胞。为了诱导酶蛋白的 过量表达，可以添加诱导物，例如本领域中通常使用的诱导物。作为实例，当诱导元件为乳 糖操纵子或trc启动子时，可以使用乳糖或IPTG(异丙基硫代半乳糖吡喃糖苷)作为 诱导物。诱导的时间可以由本领域普通技术人员适当地确定。
[0043] 可以通过离心和/或过滤从培养物分离重组细胞。酶蛋白可以汇集在通过均质化 菌株并离心匀浆获得的上清液中，或者可以通过分级分离上清液并任选地通过色谱法纯化 级分得到。例如，将分离的菌株悬于50mM磷酸盐缓冲液中、裂解并离心。将上清液负载到Ni-NTA柱(Qiagen)中，随后用20mM和250mM的咪唑洗脱酶蛋白。
[0044] 在该方法中，与D-果糖的反应可以在用于优化酶蛋白活性的条件下进行，例如在7 或更高的pH或7.5或更高的pH下，例如在7~11、7~10、7~9、7.5~11、7.5~10或7.5~9的 pH下，和/或在40~70°C的温度下，例如在42~65°C、45~62°C、50~60°C或52~57°C的温度 下。可以使用在反应混合物中浓度为40~70% (重量/体积），例如50~75 % (重量/体积）的 D-果糖。已知D-果糖在该范围内，该方法可以经济有效地产生阿洛酮糖。
[0045] 另外，如果使用分离的重组细胞，优选在与D-果糖反应之前用例如0.85 % (重量/ 体积)NaCl清洗两次或更多次。
[0046] 此外，与D-果糖的反应可以在由锰和镁组成的至少一种金属的离子存在下进行。 可以使用浓度为〇. ImM~5mM，例如0.1~2mM或0.5mM~1.5mM的金属离子。金属离子浓度小 于下限不能为酶的活性带来充分的促进。当使用浓度高于上限的金属离子时，与使用的量 相比，获得的作用的增量微小。
[0047] 使用本发明的方法由D-果糖生产阿洛酮糖后，可以通过本领域技术人员可容易 地，例如，从由离心、过滤、结晶、离子交换色谱法及组合组成的组中选择的通常方法纯化 阿洛酮糖。
[0048] 有益效果
[0049] 根据本发明所述的新型阿洛酮糖差向异构酶蛋白是具有生产阿洛酮糖的活性的 酶，在工业可应用的条件下热稳定性优异，具有长的半寿期，并且便于由D-果糖以高产量大 量生产阿洛酮糖。因此，预期根据本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶和使用该酶生产阿洛 酮糖的方法有用地用在各种食品、药品和化妆品工业中。
【附图说明】
[0050] 图1是举例说明根据本发明的一种实施方式的纯化程序的SDS-PAGE的图片（泳道 1:粗酶;泳道2:硫酸铵;泳道3:热处理;泳道4: Hi-trap Q;泳道5和6:羟基磷灰石;泳道7、8、 9和 10 :Hi_trap苯基）。
[0051] 图2是根据本发明的一种实施方式的用于表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白的重 组载体的裂解图谱。
[0052] 图3是表示一种实施方式的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性与使用的金属离子的 种类的曲线图。
[0053]图4是表示一种实施方式的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性与温度的曲线图。 [0054]图5是表示一种实施方式的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性与pH(_ :McilVaine 缓冲液;?:甘氨酸-NaOH缓冲液)的曲线图。
[0055]图6是表不一种实施方式的D-阿洛酮糖3-差向异构酶在55 °C和60 °C下的活性与时 间的曲线图。
[0056]图7是一种实施方式的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的双倒数(Lineweaver-Burk)图。
[0057]图8是表示使用一种实施方式的D-阿洛酮糖3-差向异构酶由高浓度D-果糖生产的 阿洛酮糖的产量(转化率)的曲线图。
[0058]图9是表示由高浓度果糖生产阿洛酮糖的一种实施方式的D-阿洛酮糖3-差向异构 酶的活性的HPLC色谱图。
[0059]图10为表示由高浓度果糖生产阿洛酮糖的实施例1的菌株的活性的HPLC色谱图。 [0060] 图11表示菌株KCCM11405P(5 ' -3 '）的16S核糖体RNA的核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0061] 通过以下给出的用于举例说明本发明而不解释为本发明的限制的实施例可以获 得对本发明的更好理解。
[0062] 实施例1:对具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性的土壤细菌粘着剑菌的培养 [0063]将粘着剑菌菌株(粘着剑菌SYG29;登记号:KCCM11405P)在含有1%阿洛酮糖的基 本培养基(KH2PO4 2.4g/L、K2HP〇4 5.6g/L、（NH4)2 ? S〇4 2.6g/L、MgS〇4 ? 7H20 0.1g/L、酵母 提取物lg/L)中在30°C下震荡培养24小时。以4000rmp离心20分钟从培养物中分离细胞群。
[0064]菌株为按如下方式选择的生产阿洛酮糖的菌株。
[0065] 使lg根际土壤悬于10mL 0.85%(重量/体积）的NaCl中，从该悬液中吸取100yl(微 升)平铺在琼脂平板上，并在30°C下孵育。在琼脂平板上形成的菌落中，选择形状和大小不 同的那些菌落。将所选择的菌落接种到基本培养基（KH2P〇4 2.4g/L、K2HP〇4 5.6g/L、 (NH4)2 ? S〇4 2.6g/L、MgS〇4 ? 7H20 0.1g/L、酵母提取物lg/L)中，并在30°C下震荡培养24小 时。离心分离细胞群。将该细胞群悬于l〇〇yL 50mM的PIPES(哌嗪-N，N'_双(2-乙磺酸））缓冲 液(pH为8.0)中，并使用超声处理器(ColepParmer)使该细胞群裂解。在4°C下将裂解物以 12000rmp离心10分钟后，分离由此形成的上清液，并用作粗酶。将10mM阿洛酮糖作为底物在 30°C下用该粗酶处理8小时。
[0066] 通过薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)监测由阿洛酮糖到D-果糖的转 化。TLC分析使用20cmX 5cm硅胶(硅胶60F254(Merck，德国））固相进行，用85:15的乙腈和水 的混合物作为流动相展开3.5分钟，进行2次。对于HPLC，使用配备有Aminex HPX-87C柱 (BI0-RAD)的折射率检测器（Agilent 1260RID)。将水用作流动溶剂，在80°C下流速为 0?6ml/min〇
[0067] 将通过TLC分析发现将阿洛酮糖转化为D-果糖的菌株接种到含有1 % (重量/体积） 果糖和0.05% (重量/体积)阿洛酮糖的基本培养基中，并在30°C下培养24小时。通过离心分 离细胞群。该细胞群用0.85% (重量/体积）的NaCl清洗，以40mg-dcW/ml的浓度悬于含有 400g/L果糖和ImM猛离子的50mM的PIPES缓冲液(pH为8.0)中，并使其与D-果糖在70°C下反 应6小时，随后通过在100 °C下将反应混合物加热5分钟使反应终止。HPLC分析证实产生了阿 洛酮糖。对于HPLC，在如上所述的条件（溶剂:水;温度:80°C;流速:0.6ml/min)下使用配备 有Aminex HPX-87C柱(BI0-RAD)的折射率检测器(Agilent 1260RD)。结果在图10中给出。如 通过HPLC分析所分析的，最终选择发现生产最大量阿洛酮糖的菌株。
[0068] 该菌株于2013年3月29日保藏在韩国微生物培养中心，登记号为KCCM11405P。在图 11中示出了该菌株的16S核糖体RNA的核苷酸序列(5 '->3 '）。
[0069] 实施例2:源自粘着剑菌的阿洛酮糖差向异构酶的纯化
[0070]将实施例1中分离的细胞群悬于含有ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)的50mM PIPES缓冲 液(pH为7.0)中，并使用超声处理器(Col e-Parmer)在4°C下使其裂解40分钟。在4°C下以 13000rmp离心裂解物20分钟后，将上清液用作粗酶。
[0071] 通过向该粗酶中添加50~60%的饱和硫酸铵（（NH4)2 ? S〇4)使蛋白沉淀，随后在4 °C下以13000rmp离心20分钟以分离蛋白沉淀物。50mM PIPES缓冲液(pH为7.0)透析12小时， 得到部分纯化的酶。
[0072] 将该部分纯化的酶在60°C下热处理10分钟后，在4°C下以8000rpm离心20分钟。将 上清液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH为8.0)进行平衡，并使其经过Hi-trap Q离子交换色谱 柱(Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典)处理。将结合的蛋白用高达1.0M的NaCl梯度进 行洗脱。之后，测量该部分的活性，并将活性部分汇集并浓缩。
[0073]通过Hi-trap Q分离的样品用10mM磷酸钠(pH为6.8)缓冲液进行平衡，然后负载到 生物凝胶羟基磷灰石柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上，随后用10~100mM的磷酸钠(pH为 6.8)的浓度梯度洗脱。测试活性后，将活性部分汇集并浓缩。
[0074]此外，将通过生物凝胶羟基磷灰石柱分离的样品用含有1.5M硫酸铵的50mM磷酸钠 (pH为7? 0)进行平衡，吸附到Hi-trap苯基柱(Amersham Biosciences，乌普萨拉，瑞典）上， 并用1.5~0M的硫酸铵的梯度进行洗脱。
[0075]根据上述的5步法从粘着剑菌菌株中纯化出酶，结果总结在表1中。
[0076]每步的纯化程度通过SDS-PAGE评价。在20mA的电场下，在12%的聚丙烯酰胺凝胶 上进行SDS-PAGE。结果在图1中示出。在图1中可以看到，读取分子量为约30kDa的经纯化的 感兴趣的蛋白（图1)。在使浓度为〇. 〇〇4mg/ml的经纯化的蛋白与50mM D-果糖在55°C下反应 10分钟后，将得到的反应混合物通过HPLC以与实施例1中相同的方式进行分析。HPLC(条件 与实施例1中的相同）的数据证明了经纯化的蛋白具有由D-果糖生产阿洛酮糖的活性。因 此，经纯化的蛋白具有与D-阿洛酮糖差向异构酶(起到将D-果糖转化为阿洛酮糖的作用)相 同的活性。
[0077] 实施例3:对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的N-端氨基酸序列的确定
[0078]在E-Mass. Co分析经纯化的蛋白的N-端氨基酸序列。揭示出了前44个氨基酸残基 的序列为:MQGFGVHTSMWTMNWDRPGAERAVAAAVKYAVDFIEIPMLNPPA。使用 BLAST 程序将该氨基酸 序列与GenBank数据库(NCBI)进行比对。BLAST搜索表明，经纯化的蛋白与中华根瘤菌属 (Sinorhizobium sp?)(费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)NGR234)的D-塔格糖差向 异构酶(登记号:YP002823363.1)共有约80 %的同源性。
[0079] 实施例4:D_阿洛酮糖3-差向异构酶的基因分离
[0080] 4-1.用于扩增感兴趣的基因的合成引物的设计
[0081]为了设计在扩增编码具有阿洛酮糖转化活性的蛋白的基因中使用的DNA引物，进 行了以下试验。在蛋白BLAST搜索(NCBI)的基础上，选择发现与实施例3的粘着剑菌的阿洛 酮糖转化酶的N-端氨基酸序列具有至少80%同源性的酶（登记号：￥?002823363.1、 YP006398480.1、YP005192599.1、NP437010.1)。鉴定出这些酶在邻近5'和3'端的区域中共 同具有分别编码糖ABC转运蛋白和糖类激酶的核苷酸序列。
[0082]使用覆盖分别编码糖ABC转运蛋白和糖类激酶的共同位于D-阿洛酮糖3-差向异构 酶基因的邻近5'和3'端的区域的基因的DNA片段来建立编码全部D-阿洛酮糖3-差向异构酶 的基因的完整DNA序列，其中，编码糖ABC转运蛋白和糖类激酶的基因仅用作用于获得完整 DNA序列的标记。
[0083] 基于上述基因，合成了下面的SEQ ID N0:4、5、6和7的引物，用于在扩增编码具有 阿洛酮糖转化酶活性的蛋白的DNA中使用。
[0084] SEQ ID N0:4:5，ACA TGA TCG GCT CCA ATC TC 3，
[0085] SEQ ID N0:5:5'TAT TTG ATG AAG TCG CGT GC 3'
[0086] SEQ ID N0:6:5'GCA CGC GAC TTC ATC AAA TA 3'
[0087] SEQ ID N0:7:5，GGC CGA GAT ACC AGC GCG C 3
[0088] 4-2.通过对粘着剑菌来源的染色体DNA进行PCR来获取部分编码阿洛酮糖转化酶 的DNA片段
[0089] 在通过离心从5mL在实施例1中制备的细胞培养物中分离细胞群后，将该细胞群使 用基因组DNA提取试剂盒(Bioneer Co.)，根据制造商提供的使用说明进行DNA提取。用来自 粘着剑菌(粘着剑菌SYG29;登记号:KCCM11405P)的染色体DNA用作模板，使用合成的DNA引 物对SEQ ID N0:4和5或SEQ ID N0:6和7通过PCR扩增感兴趣的基因。在热循环仪(Perkin Elmer. Co.)中进行PCR，以94°C持续1分钟、50°C持续1分钟和72°C持续1分钟进行30次循环。 在将2iU的PCR产物加样到1%琼脂糖凝胶上后，通过琼脂糖凝胶电泳测量，在约lkb处检测 到PCR产物。
[0090] 对每个DNA片段进行碱基序列测定鉴定出一部分编码阿洛酮糖转化酶的多核苷 酸。在鉴定的序列的基础上，将引物设计为含有Ndel和XhoI(SEQ ID N0:8:5'AGA TAT ACA TAT GCA GGG TTT TGG CGT CC 3'；SEQ ID N0:9:5'AAG GCT CGA GGA TCA ATC CGT ATT GCC GGG 3'），并用于对粘着剑菌菌株的染色体DNA进行PCR。在将2yl PCR混合物加样到琼 脂糖凝胶上后，通过在1%琼脂糖凝胶上电泳，在约〇.9kb处读取到PCR产物。其序列如SEQ ID N0:2所示。
[0091]碱基序列测定分析还检测出推定启动子序列，如SEQ ID NO: 3所示。
[0092] 4-3.D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的克隆
[0093]在插入到表达载体pET21a(Nobagen)的相同限制位点以构建新的重组表达载体 (称为pET21a/阿洛酮糖3-差向异构酶(pET-EDPE))之前，将通过PCR得到的多核苷酸（SEQ ID N0:2)用Ndel和XhoI(NEB)消化(参见图2)。通过热激(Sambrook和Russell:分子克隆）将 该重组载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3) (invitrogen)中。
[0094]将由此获得的转化体以104个CFU/ml的密度接种在5ml LB-氨苄青霉素培养基 (Difco)中，之后，在37°C下在以200rpm振荡的情况下孵育至600nm下的O.D.值为1.5。然后， 将该培养在培养箱中的200ml的LB-氨苄青霉素液体培养基中按比例扩大，该培养箱保持在 37 °C下，并以200rmp进行振荡。培养物在600nm下的0. D.值达到0.5时，用0.1 mM IPTG(异丙 基-0-D-硫代半乳糖苷)诱导感兴趣的酶的过量表达。从诱导的时间开始，在以150rpm振荡 的情况下，将细胞在16°C下孵育16个小时。
[0095]以4000rpm离心20分钟分离细胞群。在酶纯化中使用之前，将该细胞群用0.85% (重量/体积)NaCl清洗两次。
[0096] 实施例5:D_阿洛酮糖3-差向异构酶的纯化与表征 [0097] 5-1 .D-阿洛酮糖3-差向异构酶的纯化
[0098] 将实施例4-3中分离的细胞群悬于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、300mM NaCl，pH 7.0，10mM咪唑）中，并使用超声处理器（ColepParmer)在4°C下裂解20分钟。将裂解物以 13000rpm离心20分钟，将上清液负载到用裂解缓冲液预平衡的Ni-NTA柱（Ni-NTA Superflow，Qiagen)中，随后按顺序用含有20mM咪唑和250mM咪唑的50mM Tris-HCl/300mM NaCl(pH为7.0)进行洗脱。将通过用50mM Tris-HCl/含有250mM的咪唑的300mM NaCl(pH为 7.0)分级分离获得的最终洗脱液中存在的蛋白转移到缓冲液中，用于测量酶活性（50mM PIPES，pH为7.0)。
[0099] 5-2.D-阿洛酮糖3-差向异构酶对金属离子的依赖性
[0100] 为了考察实施例5-1中获得的D-阿洛酮糖差向异构酶对金属离子的依赖性，在ImM MgSCk或MnCl2存在的情况下，测量其活性。
[0101] 关于酶活性，1单位定义为，在使其与50mM果糖在50mM PIPES(哌嗪-N，N'_双(2-乙 磺酸））缓冲液(pH为7.0)中在金属离子的存在下于55°C反应时，催化由D-果糖产生1微摩尔 阿洛酮糖(每分钟）的酶的量。对于对照(无），未使用金属离子。
[0102] 通过使产生的阿洛酮糖的量(mM)除以使用的酶的量和反应时间，计算酶活性。通 过HPLC确定阿洛酮糖的量。HPLC分析使用87C (BI0-RAD)柱进行，用水（100 %体积/体积)作 为流动相，在80°C下流速为0.6ml/min进行展开。通过折射率检测器(Agilent 1260TID)检 测阿洛酮糖。
[0103]比较在每种金属离子存在的情况下测得的酶活性与对照的酶活性，结果在图3中 给出。由图3的数据显而易见的是，使用锰离子或镁离子时，实施例5-1的酶的活性增加，因 此是依赖于金属离子的。
[0104] 5-3.温度和pH对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的活性的影响
[0105]考察了 pH和温度对阿洛酮糖3-差向异构酶的活性的影响。在这方面，使酶与底物 果糖在不同pH值和温度下进行反应。
[0106]首先，在反应温度从40 °C变化到70 °C的情况下，测量pH为7.0时的酶活性。关于酶 活性的测量，参照实施例5-2的程序。结果在图4中给出。如在图4中可以看到，酶在50~60°C 的温度下表现出高转化活性，在55 °C时达到最大值。在图4中，Y轴上的相对活性表示为对照 的最大活性的百分比。
[0107] 此外，为了考察pH的影响，在pH为5.0~9.0的Mcilvaine缓冲液或pH为9.0~10.0 的50mM甘氨酸-NaOH缓冲液中反应后，测量55°C时的酶的活性。结果在图5中给出。如在图5 中可以看到，酶在碱性更强的条件下变得活性更强，在pH为7.5~10.0时保留有90%或更高 的活性。在这方面，在使0.5单位/ml的酶与50mM D-果糖在上面给出的各个pH和温度条件下 反应10分钟，随后在100°C下加热5分钟终止反应后，测量活性。
[0108] 由结果知道，根据本发明的阿洛酮糖3-差向异构酶在很大范围的温度和pH下的活 性没有太大波动，这对于工业适用性有利。因此，预期本发明的酶在阿洛酮糖的工业化方面 具有有利的应用。
[0109] 5-4.针对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性的测定
[0110] 为了考察阿洛酮糖3-差向异构酶随温度变化的稳定性，将在实施例5-1中纯化的 酶在55°C和60°C下热处理预定的时间（8小时），使0.5单位/ml经热处理的酶与50mM D-果糖 在含有ImM MnCl2的50mM PIPES缓冲液中于pH7.0和55°C下反应10分钟。通过在100°C下加 热5分钟终止反应。测量与热处理的时间相应的酶活性。
[0111]图6给出了结果。如在图6中可以看到，计算出在实施例5-1中纯化的酶在55°C和60 °C下的半寿期分别为约22小时和7小时。这些数据远高于以前报道的大部分阿洛酮糖3-差 向异构酶的数据，表明对于在工业上可能促进酶反应的温度，本发明的阿洛酮糖3-差向异 构酶的热稳定性优异。
[0112] 5-5.针对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的动力学参数的测定
[0113] 考察在实施例5-1中纯化的粘着剑菌来源的阿洛酮糖差向异构酶的反应速率。为 此，测定酶的动力学参数。
[0114] 将含有浓度为0.5单位/ml的所述酶和ImM MnCl2的50mM PIPES缓冲液与浓度为10 ~50mM不等的底物果糖一起在pH 7.0和55°C下孵育。通过在100°C下加热5分钟来终止反 应。
[0115] 结果在图7中给出。在图7中，根据米氏方程(Michaelis-Menten Equation)描述酶 反应的速率，其中计算出km和kcat分别为18.6mM和SSllJmirT1。
[0116] 另外，发现根据本发明的阿洛酮糖3-差向异构酶关于D-果糖的催化效率为135,高 于85(源自根癌土壤杆菌的常规阿洛酮糖3-差向异构酶的催化效率）。
[0117] 5-6.通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶由D-果糖生产高浓度的阿洛酮糖
[0118] 为了生产高浓度的阿洛酮糖，使在实施例5-1中纯化的0.1~0.5mg/ml的D-阿洛酮 糖3-差向异构酶与高浓度的D-果糖(400g/L)在含有ImM MnCl2的50mM PIPES缓冲液(pH为 7.0)中于55°C下反应。
[0119] 以与实施例5-2中相同的方式定量分析产生的阿洛酮糖，以确定从D-果糖到阿洛 酮糖的转化率。由于使用的是高浓度的果糖，因此在HPLC分析之前将在每个计划时间点取 出的样品稀释20倍。
[0120] 结果在图8中给出。当使用浓度为0.5mg/ml的酶时，如在图8中可以看到，阿洛酮糖 的产量达到118.6g/L，阿洛酮糖的转化率为约30 %。
[0121 ]同时，通过HPLC测量由高浓度的D-果糖通过生物转化得到的阿洛酮糖的生产率， 结果在图9中给出。
[0122] 【登记号】
[0123] 保藏单位:韩国微生物培养中心
[0124] 登记号:KCCM11405P
[0125] 保藏日期：2013年3月29日。
[0126] 国际承认用于专利程序的微生物倮存布达i佩斯条约 国际表_格 委托单位：株式会社三养吉尼克斯 由本页底部鉴定的国际保藏单位依椐 韩国首尔钟龙路永济洞263号， 细则第7.1条发出的原始存单 邮编110 725
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【主权项】
1. 一种阿洛酮糖差向异构酶，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。2. -种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的阿洛酮糖差向异构酶。3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。4. 一种重组载体，其携带根据权利要求2所述的多核苷酸。5. -种重组细胞，其含有根据权利要求4所述的重组载体。6. -种用于生产阿洛酮糖的组合物，包含选自由以下组成的组中的至少一种:包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、编码所述蛋白的多核苷酸、携带所述多核苷酸的重组载体、 含有所述重组载体的重组细胞、所述重组细胞的培养物和所述重组细胞的裂解物。7. 根据权利要求6所述的组合物，其进一步包含选自由以下组成的组中的至少一种:铜 离子、锰离子、镁离子、锌离子、镍离子、钴离子、铁离子、铝离子和钙离子。8. -种用于生产阿洛酮糖的方法，包括:使选自由以下组成的组中的至少一种与D-果 糖反应:包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、编码所述蛋白的多核苷酸、携带所述多核 苷酸的重组载体、含有所述重组载体的重组细胞、所述重组细胞的培养物和所述重组细胞 的裂解物。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，使用浓度为55~75 % (重量/重量)的所述D-果糖。10. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述反应在pH为7~10下进行。11. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述反应在40~70°C的温度下进行。12. 根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其进一步包括:添加选自由以下组成的 组中的至少一种:铜离子、锰离子、镁离子、锌离子、镍离子、钴离子、铁离子、铝离子和钙离 子。13. 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、编码所述蛋白的多核苷酸、携带所述多核 苷酸的重组载体或含有所述重组载体的重组细胞，用于在生产阿洛酮糖中使用。
【文档编号】C12N9/90GK105849260SQ201480071143
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年7月4日
【发明人】韩恩珍, 金慧贞, 安信惠, 田岁希, 朴钟辰, 李康杓
【申请人】株式会社三养社