3-差向异构酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，以及一种编码所述蛋白的 核酸分子。本发明还涉及一种载体和一种含所述核酸分子的宿主细胞。本发明还涉及一种 用所述蛋白合成阿洛酮糖的方法，以及按这种方式制造的阿洛酮糖。
【背景技术】
[0002] 阿洛酮糖是一种"零热量"甜味剂，并有认为与葡萄糖类似的甜度。其还具有类似 于其他醣类的填充和褐变属性。阿洛酮糖的主要目标市场是食品和饮料制造商，在其产品 中，目前所用为葡萄糖、果糖或高果糖浆，而且正寻求显著减少热量却不显著改变糖成分所 赋予的其他属性，如：填充作用、褐变、质地和甜度。
[0003] 在美国，阿洛酮糖并非通常认为是安全（GRAS)的物质，但目前有一项待定的GRAS 通知（GRN400)。阿洛酮糖存在于加工甘蔗和甜菜糖蜜、经蒸汽处理的咖啡、小麦植物产品 和高果糖玉米糖浆。阿洛酮糖的典型日总摄入量估计为每天0.2克以上。D-阿洛酮糖是 D-果糖的C-3差向异构体，而阿洛酮糖和果糖结构的差异使得阿洛酮糖不能被人体代谢， 因而其热量为零。由于阿洛酮糖不含热量，因此，认为其是一种有前途的候选甜味填充剂， 而且，据称在具有甜味的同时还能保持与典型单糖相似的性质。
[0004] 酮糖-3-差向异构酶可使果糖和阿洛酮糖互相转化。号为8030035的美国专利和 公布号为W02011/040708的PCT公开了可将来自农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)并 具阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白与D-果糖反应，从而制造D-阿洛酮糖（阿洛酮糖 的另一名称）。
[0005][0006] 号为100832339的韩国专利公开了一种中华根瘤菌（Sinorhizobium)YB-58菌株， 该菌株能够将果糖转化成阿洛酮糖，并公开了一种用中华根瘤菌YB-58菌株的真菌体制造 阿洛酮糖的方法。
[0007] 号为1020090098938的韩国专利申请公开了一种用大肠杆菌制造阿洛酮糖的方 法，其中，大肠杆菌是表达一种编码阿洛酮糖-3异构酶的多核苷酸。
[0008] 本发明的目的是改进阿洛酮糖的现有制备技术。本发明的目的是提供一种酮 糖-3-差向异构酶，其在全细胞系统中的转化率和体积产率高于之前报导的。
【发明内容】
[0009] 本发明源于对三种酮糖-3-差向异构酶的鉴别及表征，其示例性氨基酸序列分别 示于编号2、4和6的序列。可用该酮糖-3-差向异构酶将果糖转化成阿洛酮糖。之前已将 这些蛋白确定为假想蛋白，或确定为具有塔格糖异构酶活性。然而，本发明人现惊奇地发现 这些酶有阿洛酮糖-3-差向异构酶活性。
[0010] 本发明的第一方面提供一种含多肽序列的蛋白，该序列与编号2的序列、编号4的 序列或编号6的序列有至少70%的序列同一性，其特征在于，所述蛋白具有酮糖-3-差向异 构酶活性。
[0011] 方便而言，该多肽序列与编号2的序列，编号4的序列或编号6的序列有至少 80%、90%、95%或99%的序列同一性，或有100%的序列同一性。
[0012] 优选地，该多肽序列含编号13的序列。
[0013] 优选地，该蛋白固定于固体基质。
[0014] 本发明的第二方面提供一种本发明第一方面的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。
[0015] 本发明的第三方面提供一种核酸分子，该核酸分子包含编码本发明第一方面所述 蛋白的多核苷酸序列。
[0016] 优选地，该核酸分子包含多核苷酸序列，其中：
[0017] i)该多核苷酸序列与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%、80%、90%、95% 或99%的序列同一性，或是100%的序列同一性；或
[0018] ii)该多核苷酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有 与编号5、编号1或编号3所不序列互补的序列。
[0019] 本发明的第四方面提供一种载体，其特征在于载体包含本发明第三方面所述的核 酸分子。
[0020] 本发明的第五方面提供一种宿主细胞，其特征在于宿主细胞包含本发明第三方面 所述的重组核酸分子。
[0021] 方便而言，该宿主细胞是一种酵母、细菌或其他微生物，或一种哺乳动物、植物或 其他细胞的培养物。
[0022] 优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
[0023] 本发明的第六方面提供一种由本发明第一方面所述蛋白制造的阿洛酮糖。
[0024] 本发明的第七方面提供一种制造阿洛酮糖的方法，包括：
[0025] i)提供本发明第一方面所述的蛋白；并
[0026] ii)在可将果糖基质转化为阿洛酮糖的条件下将蛋白与果糖基质接触。本发明亦 提供一种制造阿洛酮糖的方法，所述方法包括：在可将果糖基质转化为阿洛酮糖的条件下， 将本发明第一方面所述蛋白与果糖基质接触。
[0027] 优选地，所述蛋白存在于宿主细胞中。
[0028] 可选地，该蛋白呈分离形式。
[0029] 为方便起见，这些条件包括将蛋白与果糖基质保持在25°C至75°C之间，优选保持 在50°C至60°C之间，更优选保持在52°C至55°C之间，更优选为55°C。
[0030] 优选地，所述条件包括将蛋白和果糖基质保持在pH4至pH10之间。
[0031] 优选地，所述条件包括将果糖基质浓度保持在75%至95% (W/V)之间。
[0032] 本发明的第八方面提供一种含多核苷酸序列的核酸分子，其中：
[0033] i)所述多核苷酸序列与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一,性； 或
[0034]ii)所述多核苷酸序列在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，其具有与编号 5、编号1或编号3所示序列互补的序列。
[0035] 该核酸分子编码一种具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽。如本发明的一方面所 述，该核酸分子可呈分离形式。
[0036] 本发明的第九方面提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含重组核酸分子，所述核酸 分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其 中该多核苷酸序列的特征在于：
[0037] i)与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一性；或
[0038] ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，该多核苷酸具有与编号5、编号1 或编号3所示序列互补的序列。
[0039] 本发明的第十方面提供一种载体，所述载体包含核酸分子，所述核酸分子包含多 核苷酸，所述多核苷酸编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的多肽，其中该多核苷酸序列的 特征在于：
[0040] i)与编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一,性；或
[0041] ii)在高度严谨条件下杂交得到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号 1或编号3所示序列互补的序列。
[0042] 本发明的第十一方面提供一种制备阿洛酮糖的方法，该方法包括下列步骤：
[0043] i)提供一种包含核酸分子的载体，所述核酸分子具有多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列编码具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白，其中该多核苷酸序列的特征在于：a)与 编号5、编号1或编号3的序列有至少70%的序列同一性，或b)在高度严谨条件下杂交得 到一种多核苷酸，所述多核苷酸具有与编号5、编号1或编号3所示序列互补的序列；
[0044] ii)合成具有酮糖-3-差向异构酶活性并被多核苷酸序列编码的蛋白；
[0045] iii)将果糖与具有酮糖-3-差向异构酶活性的蛋白接触，并将果糖和蛋白保持在 可将果糖转化成阿洛酮糖的条件下；并
[0046] iv)至少对步骤iii)制造的阿洛酮糖进行部分纯化。
[0047] 在本文中，术语"多肽"、"肽"和"蛋白"可互换使用，用以指代氨基酸残基聚合物。 这些术语亦适用于一个或多个氨基酸残基经修饰或残基非天然存在的氨基酸聚合物，例如 天然存在氨基酸及天然存在氨基酸酸聚合物的相应人工化学模拟物。多肽未必呈"分离"形 式，即未必处于天然存在时其周围组分之外。
[0048] 本文所用术语"氨基酸"指天然存在和合成的氨基酸，以及具有与天然存在的氨基 酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指由遗传密码编码的氨基 酸，以及在细胞中翻译后经修饰的氨基酸（例如：羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸丝氨 酸）。短语"氨基酸类似物"指与天然存在的氨基酸基本化学结构U碳与氢、羧基、氨基、 R基团结合）相同，但有一个经修饰的R基团或经修饰的骨干（如丝氨酸、亮氨酸、蛋氨酸亚 砜、蛋氨酸甲基锍）的化合物。短语"氨基酸模拟物"指一类与天然存在的氨基酸结构不同 但有类似功能的化合物。应当理解为：由于遗传密码的简并性，编码特定多肽的核酸分子可 能会具有一系列多核苷酸序列。例如：密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码丙氨酸这种氨基 酸。
[0049]使用BLASTP算法第 2.2.2 版（Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden，AlejandroA.Schaffer,JinghuiZhang，ZhengZhang，WebbMiller，andDavid J.Lipman(1997)， "GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofprotein databasesearchprograms"，NucleicAcidsRes. 25:3389-3402)及默认参数，可确定两 个序列的百分比"同一性"。尤其是，可用URLhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/访问 互联网进行BLAST算法评价。
[0050] 本文所用术语"酮糖-3-差向异构酶活性"指一种能催化酮糖的立体化学转化，特 别是果糖向阿洛酮糖的转化的酶。例如，在一个实施例中，"酮糖-3-差向异构酶活性"指与 相同条件下不含酶的反应混合物相比，所加每毫克酶（〇. 1单位/毫克）使果糖与阿洛酮糖 的互变率增加至少10微摩尔/分钟的能力。在其他实施例中，认为使果糖与阿洛酮糖的互 变率增加至少〇. 05单位/毫克或0. 2单位/毫克即具有"酮糖-3-差向异构酶活性"。以下 提供了一种测定酶使D-果糖向阿洛酮糖转化的活性的适宜方法。将