细菌设计的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及设计（工程化，engineering)适用于生物技术应用，包括蛋白、次级 代谢产物（secondarymetabolite)和生物燃料的生产，生物催化，生物治理（生物修复， bioremediation)，生物转化，生物降解，生物学控制，药物开发，药物筛选，疫苗，益生菌，生 物传感器和药物递送载体（drugdeliveryvehicle)的细菌细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 细菌在生物技术的许多方面都找到了应用，包括用作生产异源蛋白和肽（包括酶 和治疗性抗体）的宿主，作为次级代谢产物或其衍生物的源，作为生物学控制，生物降解， 生物燃料生产，生物催化和生物治理的试剂和作为益生菌，疫苗组分和药物递送体系。
[0003] 天然细菌菌株对于生物技术用途并未优化。合成生物学这一新兴领域的目标之一 是设计（工程化，engineering)更易于处理和/或更有效的作为生物技术工具的新型生物。
[0004] -种方法可以称为"粉碎（ground-up) "方法（例如，见W02008/024129)。这涉及 到只包含那些生长必不可少的基因的最小化的人工细菌DNA基因组的合成。这然后用于 产生按照需要可以向其增加所需的生物合成路径，信号传导途径或分解代谢功能的裸"框 架"（bare"chassis"）。这种方法目前是不切实际的，因为基因产物和调控元件会协同和 串扰于整个细胞的环境中，其方式当前还不完全理解并因此不能作为正式模块进行处理。
[0005] 另一种方法称为"剥离（stripdown) "方法。目前这在链霉菌（Streptomyces spp.)有用的次级代谢产物的生产中找到了应用。此处，不是生长必需的基因和其它遗传 物质将被去除（"剥除（strippedout)"），而逐个重新引入用于选定的生物合成路径的那 些。例如，Komatsu等（Komatsuetal. (2010)PNAS107(6) :2646-2651)描述了用于编码 次级代谢产物生物合成的基因的异源表达的设计的（工程化，engineered)细菌的构建，这 涉及从工业微生物阿维链霉菌（Streptomycesavermitilis)基因组中系统地删除非必需 基因。
[0006] 所述"剥离"方法需要识别对于所选条件下存活和/或生长非必要的（和从而代 谢高成本性的以及因此不利的）基因的方法。
[0007] 此外，这种方法将受益于互补功能基因组分析还识别出有利于所提出的生物技术 应用的基因。在后一种情况下，"剥离（stripdown)/增产（rev-up)"方法随后能用于最小 化由非必要（不利的）基因所引起的代谢负担，同时放大直接或间接有助于所述生物技术 应用的基因（即，有利基因）的有益作用。
[0008]转座子定向插入位点测序（transposondirectedinsertion-sitesequencing) (TraDIS-见Langridgeetal. (2009)GenomeResearch19:2308-2316)最近已经被描述 并用于识别：（a)必需基因；(b)有利生长的（但非必需的）基因；（c)在特定条件下不利生 长的基因；和（d)参与对某些条件提供耐受性的基因（"壁龛特异性的（niche-specific)" 必需基因）。类似的技术已描述于例如，Gawronskietal. (2009)PNAS106:16422-16427; Goodmanetal. (2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal. (2009)Nat. Methods6:767-772和Gallagheretal. (2011)mBio2(1) :e00315-10,并且这种技术现在 统称为"Tn-seq"方法。
[0009] 现在本发明人已经发现，TraDIS能够适于为细菌生物设计（生物工程， bioengineering)目的明确地识别出不利的和有利的基因的问题提供非常巧妙的解决方 案。这通过使用活化转座子（TnA)而实现。这些转座子包括启动子从而使转座子在合适的 插入位点插入到细菌DNA中增加了插入位点处或接近基因的转录。因此采用1^的诱变产 生插入失活的突变体（其中所述！^破坏了基因表达，通常在插入到编码区中之后）以及 插入活化的突变体（通常在转座子已插入到基因的上游，从而使所述启动子驱动所述基因 高水平的转录（以及因此产生更高水平的表达）。
【发明内容】
[0010] 根据本发明，提供了生产在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突 变体细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011] a)通过采用活化转座子（TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述、包 含能够增加其插入位点或附近的基因转录的启动子；
[0012] b)由所述突变体集合在所选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下生长细 菌以产生两种以上测试培养物；和
[0013] c)比较测试培养物之间的!^插入的分布以识别出在所选择的生长条件下不利于 生长和/或存活的第一类基因和在所选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基 因。
[0014] 通常情况下，与第一类的（不利的）基因相关的TnA插入发生于编码区（从而使 所述基因被!^插入失活）或所述编码区外部但是在所述编码序列的互补DNA链上（导致 反义RNA的产生或启动子活性破坏），然而与第二类的（有利的）基因相关的!^插入却定 向发生于所述编码区的上游，由此所述1^的启动子驱动所述基因的升高的转录（从而进 行表达）。
[0015] 这种方法可以进一步包括以下步骤：提供设计的（工程化的，engineered)突变体 细菌，其中至少一种所述不利基因被去除或破坏和/或至少一种所述有利基因过表达，从 而使所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下改善的存活和/或生长。在这些实施方 式中，多种所述不利基因可以去除或破坏同时多种有利基因过表达。
[0016] 按照这种方式，可以设计（工程化，engineer)或选择显著更好地适于所选生长条 件（从而适于所述生物技术用途）的突变体细菌。
[0017] 在这些实施方式中，所述方法可以进一步包括分离和培养所述设计的（工程化 的，engineered)突变体细菌并随后将其进行再一轮的诱变，培养和比较（如以上步骤(a)-(c)中定义），并可以可选地进一步包括以下步骤：提供第二轮设计的（工程化的， engineered)突变体细菌，其中至少一种所述另外的不利基因被去除或破坏和/或至少一 种所述另外的有利基因过表达，从而使所述突变体细菌在所选择的生长条件下相对于所述 第一轮诱变之后产生的所述设计的（工程化的，engineered)突变体细菌表现出进一步改 善的存活和/或生长。
[0018] 因此，本发明的方法优选是重复的，并还可以包括另外轮的诱变和重复实施步骤 (a)至（c)(如上所定义）以提供在所述环境挑战存在下相对于前一轮的设计的突变体细菌 表现出更进一步改善的存活和/或生长的第三，第四，第五（或更多）轮突变体细菌。
[0019] 在这些实施方式中，每一轮期间采用的选择的生长条件可以是相同或不同的。
[0020] 本发明的其它方面和优选实施方式定义和描述于以下陈述的其它权利要求中。
【具体实施方式】
[0021] 本文提及的所有出版物，专利，专利申请和其它参考文献出于所有目的以其全文 结合于本文中作为参考，就好像每个单独出版物，专利或专利申请专门地且各自地指出以 其全部引述的内容结合于本文中作为参考。
[0022] 宙义和一般优诜
[0023] 当在本文中使用时以及除非另外明确指出，否则以下术语预想具有以下含义（除 了所述术语在本领域内可能具有的任何更宽（或更窄）的含义之外）：
[0024] 除非上下文另有所需，本文中单数的使用应理解为包括复数，反之亦然。涉及实体 使用的术语"一个"或"一种"应该理解为是指一种或多种所述实体。同样，术语"一个"（或 "一种""一种或多种"，和"至少一种"在本文可互换使用。
[0025] 正如本文所用的，术语"包含"或其变体如"包括"或"包括了"，应该理解为是指 包含任何所述的整数（例如，特征，要素，特性，属性，方法/过程步骤或限制）或整数的组 (例如，特征，要素，特性，性质，方法/过程步骤或限制），但并不排除任何其它整数或整数 的组。因此，正如本文所用的，术语"包括"是包含性的或开放式的，并且并不排除另外的， 未列举的整数或方法/过程步骤。
[0026] 所述术语"基因"是描述由占据染色体或质粒中的特定位置并决定生物中具体特 性或特性的组的DNA序列构成的遗传单元的术语。基因可以通过指定构成蛋白或蛋白部分 (结构基因）的多肽链；或编码RNA分子；或通过指定构成影响或以任何方式调节其它基因 的操作或抑制这种操作（例如，通过以顺式作用）的结构实体的核酸决定生物特性；或通过 其它尚未定义的机理影响表型。
[0027] 所述术语"基因组DNA"是本文中用于定义染色体DNA有别于染色体外维持的质粒 DNA的本领域术语。
[0028] 所述术语"基因组"是本文中用于定义生物体整个遗传互补的本领域术语，因此包 括染色体，质粒，噬菌体和任何其它起到遗传物质作用的DNA或RNA。
[0029] 所述术语"革兰氏阳性细菌"是定义基于某些细胞壁染色特性一起分组的特定类 细菌的本领域术语。
[0030] 所述术语"低G+C革兰氏阳性细菌"是基于所述DNA中碱基的组成定义所述 革兰氏阳性中进化相关细菌的特定子类类型的本领域术语。所述子类包括链球菌属 (Streptococcusspp.)，葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)，李斯特菌属(Listeria spp.)，芽孢杆菌（Bacillusspp.)，梭状芽孢杆菌属（Clostridiumspp.)，肠球菌属 (Enterococcusspp.)和乳酸杆菌（Lactobacillusspp. ) 〇
[0031] 所述术语"高G+C革兰氏阳性细菌"是基于所述DNA中碱基的组成定义所述 革兰氏阳性中进化相关细菌的特定子类类型的本领域术语。所述子类包括放线菌纲 (actinomycetes)(放线菌类（actinobacteria))包括放线菌属（Actinomycesspp.)，节杆 菌属（Arthrobacterspp.)，棒状杆菌属（Corynebacteriumspp.)，弗兰克氏菌属（Frankia spp.)，微球菌属（Micrococcusspp.)，小单抱菌属（Micromonosporaspp.)，分支杆菌属 (Mycobacteriumspp.)，诺卡氏菌属（Nocardiaspp.)，丙酸杆菌属（Propionibactoria spp.)和链霉菌属（Streptomycesspp. ) 〇
[0032] 所述术语"革兰氏阴性细菌"是定义基于某些细胞壁染色特性一起分组的特定类 细菌的本领域术语。革兰氏阴性细菌属的实例包括克雷伯氏菌属（Klebsiella)，不动杆 菌属（Acinetobacter)，埃希氏菌属（Escherichia)，假单胞菌属（Pseudomona)，肠杆菌属 (Enterobacter)和奈瑟菌属（Neisseria)。
[0033] 牛长备件的诜择
[0034] 本发明的方法允许设计在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突 变体细菌，并涉及相对一种或多种参考条件，在选择的生长条件下检测TnA插入的分布和/ 或频率的差异。
[0035] 所述生长条件根据所述最终生产的设计细菌的所需生物技术应用进行选择：任何 条件都