是合适的，条件是所选定的生长条件和参考生长条件之间的差异驱动衍生自！^插 入突变体初始集合的测试培养物中的可回收TnA插入突变体的分布变化。
[0036] 在某些实施方式中，所述选择的生长条件特征在于存在一种或多种不存在（或在 参照条件下以不同的，例如较低或较高浓度存在）的选择性试剂。在这样的背景下，所述术 语"选择性试剂"广义上用于涵盖当用于本发明方法中时引起基因组TnA插入的分布和/或 频率变化的任何试剂（或试剂组合）。
[0037] 因此这种试剂包括但不限于：环境污染物；毒素；抗生素；碳源；氮源；能源；其它 微生物（例如，酵母，病毒，细菌和/或植物）；pH;压力；温度；盐浓度；杀虫剂；放射性材 料；烃；油残余物；工业废弃产品；医疗废弃产品；废水残余物等。
[0038] 以下列出了根据所述设计细菌的预想生物技术用途适用于提供本发明方法的选 择生长条件的示例性非限制性的选择性试剂：
[0039] 生物治理（生物修复，bioremediation)-砷，金属，例如重金属，特别是铅，采铀， 钯，铬和镉；多核芳烃，氯代溶剂，酚，油，杀虫剂和磷酸盐（酯）。
[0040] 微生物增强的米油（microbialenhancedoilrecovery)-原油和重油馈分
[0041] 污水处理-亚硝酸盐类，氨，磷酸盐类和类雌激素化合物
[0042] 食品生产-乳糖和醋酸。
[0043] 生物燃料的生产-二氧化碳，氢，阳光，氧，纤维素和半纤维素
[0044] 能量产生-废水，海洋沉积物，淡水沉积物，河流水，乙酸盐（酯），丙酸盐（酯）和 丁酸盐（酯）
[0045] 生物生产和疫苗-Luria-Bertani或LB肉汤，Terrific肉汤（TB)，2YT或化学定 义的培养基。
[0046] 生物消化/生物降解-秸杆组分，纤维素废弃物和塑料。
[0047] 益生菌-其它细菌，例如厚壁菌门（Firmicutesphylum)的成员。
[0048] 感染的治疗-病原细菌，植物，根瘤农杆菌，动物，金黄色葡萄球菌，人体组织和艰 难梭菌（Clostridiumdifficile)，人共生细菌或人互惠细菌。
[0049] 话用于本发_所沭方法的细菌
[0050] 本发明的方法可以应用于任何细菌的设计（工程化，engineering)。所选择的细 菌将尤其取决于所述预期的生物技术用途。
[0051] 因此，本发明的方法在以下细菌中抗生素靶的识别中找到了应用：(a)革兰氏阳 性，革兰氏阴性和/或革兰氏可变细菌；(b)产芽孢细菌；(c)无芽孢细菌；(d)丝状细菌； (e) 胞内细菌；（f)专性需氧菌；（g)专性厌氧菌；(h)兼性厌氧菌；（i)微需氧细菌和/或 (f) 条件致病细菌病原体。
[0052] 在某些实施方式中，本发明的方法应用于以下细菌属：不动杆菌属（例如，鲍曼 不动杆菌）；气单胞菌（例如，嗜水气单胞菌）；芽孢杆菌（例如，炭疽芽孢杆菌）；拟杆菌 类（例如，脆弱拟杆菌）；博德特氏菌（例如，百日咳博德特氏菌）；疏螺旋体（例如，伯氏 疏螺旋体）；布鲁氏囷属（例如，牛布鲁氏囷，犬布鲁氏囷，羊布鲁氏囷和猪布鲁氏囷）；伯 克霍尔德菌属（例如，洋葱伯克霍尔德菌复合体）；弯曲杆菌（例如，空肠弯曲杆菌）；衣原 体（例如，沙眼衣原体，猪型沙眼衣原体和鼠型沙眼衣原体）；嗜衣原体属（例如（例如， 肺炎嗜衣原体，家畜嗜衣原体（C.pecorum)，鹦鹉热嗜衣原体，牛嗜衣原体，猫嗜衣原体和豚 鼠嗜衣原体）；柠檬酸杆菌（例如，弗氏柠檬酸杆菌）；梭状芽胞杆菌（例如，肉毒梭菌，艰 难梭菌，产气荚膜梭菌和破伤风梭菌）；棒状杆菌属（例如，白喉棒状杆菌和谷氨酸棒状杆 菌）；肠杆菌（例如，阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）；肠球菌（例如，粪肠球菌和屎肠球菌）； 埃希菌属（例如，大肠杆菌）；黄杆菌属（Flavobactoria);弗朗西斯氏菌（例如，土拉弗朗 西斯菌）；梭杆菌属（例如，坏死梭杆菌）；嗜血杆菌（例如，睡眠嗜血菌，流感嗜血菌和副 流感嗜血菌）；螺杆菌（例如，幽门螺杆菌）；克雷伯氏菌属（例如，产酸克雷伯氏菌和肺炎 克雷伯菌）；军团菌属（例如，嗜肺军团菌）；钩端螺旋体菌属（例如，问号钩端螺旋体）； 李斯特菌（例如，单核细胞增生性李斯特菌）；莫拉菌属（例如，卡他莫拉菌）；摩根氏菌 属（如摩氏摩根菌）；分支杆菌属（例如，麻风分支杆菌和结核分枝杆菌）；支原体（例如， 肺炎支原体）；奈瑟氏菌属（例如，淋病奈瑟氏菌和脑膜炎奈瑟氏菌）；巴氏杆菌（例如，多 杀性巴氏杆菌）；消化链球菌；普氏菌属；变形杆菌属（例如，奇异变形杆菌和普通变形杆 菌），假单胞菌属（例如，铜绿假单胞菌）；立克次体（例如，立克次氏立克次体）；沙门氏 菌属（例如，血清型，伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）；沙雷氏菌属（例如，粘质沙雷氏 菌）；志贺氏菌属（例如，弗莱斯纳志贺氏菌（S.flexnaria)，痢疾志贺氏菌和宋内志贺氏菌 (S.sonnei));葡萄球菌（例如，金黄色葡萄球菌，溶血葡萄球菌，中间葡萄球菌，表皮葡萄 球菌和腐生葡萄球菌）；寡养单胞菌属（例如，嗜麦芽寡养单胞菌）；链球菌属（例如，无乳 链球菌，变形链球菌，肺炎链球菌和化脓链球菌）；密螺旋体（Treponema)(例如，苍白密螺 旋体（T.pallidum));弧菌属（例如，霍乱弧菌）和耶尔森氏菌属（例如，鼠疫耶尔森氏杆 菌）。
[0053] 以下列出了根据预想的生物技术用途适于本发明方法的示例性非限制性细菌：
[0054] 生物治理-不动杆菌，假单胞菌，产碱杆菌，鞘氨醇单胞菌，红球菌属，分支杆菌 属，地杆菌属，贪铜菌属和脱硫弧菌属。
[0055] 微生物增强采油-不动杆菌属，芽孢杆菌属，假单胞菌属，红球菌属，节杆菌属，克 雷伯氏菌属和梭菌。
[0056] 污水处理-不动杆菌，硝化细菌属，硝化球菌属和硝化螺旋菌属。
[0057] 食品生产-醋酸菌属。
[0058] 生物燃料生产-真养罗氏菌，产氢盐厌氧菌属（halanaerobium hydrogeniformans)，大肠杆菌，蓝细菌，丙酮丁醇梭菌，运动发酵单胞菌和极端嗜热厌氧纤 维素降角军菌（caldicellulosiruptorobsidiansis)〇
[0059]能源产生-地杆菌属（Geobacter)，脱硫单胞菌属，变形菌属，陶厄氏居泥杆菌 (PelobacterThauera)，芽孢杆菌和脱氯单胞菌属
[0060] 生物生产-大肠杆菌属，短芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌属，新月 柄杆囷属，链霉囷属，
[0061] 生物消化/生物降解
[0062] 真养罗氏菌属，产氢盐厌氧菌属，大肠杆菌，蓝细菌属，丙酮丁醇梭菌，运动发酵单 胞菌属，极端嗜热厌氧纤维素降解菌（Caldicellulosiruptorobsidiansis)，
[0063] 疫苗
[0064] 新月柄杆菌属，大肠杆菌属，沙门氏菌属
[0065] 益生菌-双歧杆菌属，厚壁菌门、人类共生菌属和人类互惠菌属的成员。
[0066] 感染的治疗-竞争性"好"细菌（例如，人类共生菌属或人类互惠菌属），植物，土 壤杆菌（Agrobacterium)，人葡萄球菌和双歧杆菌的无毒菌株。
[0067] 基因组设计
[0068] 本发明的方法可以包括提供其中至少一种所述不利基因被去除或破坏和/或至 少一种所述有利基因过表达的设计的（工程化的，engineered)突变体细菌的步骤，从而使 所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下存活和/或生长改善。
[0069] 对于不利/非必需基因的去除或破坏，在细菌中染色体基因缺失/替换的各种实 验方案在本领域内是已知的，这些方案使靶向基因组序列能够采用携带所定义突变那些的 拷贝进行特异性替代。
[0070] 有两种方法是特别有用的：第一（"进-出（IN-0UT) "）方法是基于将质粒DNA整 合至所述细菌染色体中并随后解离该共合体（cointegrate)。第二（"线性片段"或重组设 计（recombineering))方法是基于在线性DNA分子末端通过短同源臂介导的同源重组。
[0071]这些方法综述于例如，Madyagoletal. (2011)FoliaMicrobiol56:253-263中， 其公开内容结合于本文中作为参考。
[0072] 这种方法可以用于缺失所述细菌基因组的较大片段（largetract)，并且如果用 于消除对所需生物技术应用非必需的所有（或基本上全部）基因（即，另外地对所述细菌 细胞施加代谢负担的所有非必需基因），则这种方法可以称为"基因组最小化"。
[0073] 在一些实施方式中，所述突变体细菌可以设计成具有比野生型基因组小10%， 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%或大于 90% 的"最小化的"基因组。
[0074] 对于有利基因使所述突变体细菌表现出在所选择的生长条件下存活和/或生长 改善的过表达，广泛多样的已知技术中任何一种都可以使用，包括尤其是化学诱导的（或 u.v.诱导的）点突变的引入，强启动子的插入，核糖体结合位点，抑制物结合位点的去除和 密码子使用的优化。
[0075] 突夺体集合
[0076]本发明的方法涉及通过转座子诱变生产突变体细菌集合。所述突变体集合的大小 会影响所述方法的分辨率：随着所述集合尺寸增加，具有!^插入的越来越多的不同基因将 被表示（因此有效地被检测）。随着所述集合尺寸减小，所述方法分辨率会降低，基因检测 将不太有效，且越来越多的基因将根本不会被检测。
[0077] 理想的是，在本发明的方法中产生的突变体集合在以下意义上是全面的，即表示 插入每个基因中。为实现这一点所需的TnA插入突变体的数目（S卩，所述突变体集合大小） 取决于各种因素，包括：（a)所述细菌基因组的大小；(b)所述基因的平均大小；和（c)任何 1^插入位点偏差。
[0078] 对于后者，细菌基因组的某些区域（特别是富含GC的区域）吸引低频率的插入。 因此，优选插入频率和集合尺寸足够大以确保插入到难插入的区域。
[0079] 一般而言，需要1个转座子/25bp的最小插入率以获得全面的集合/文库，这通常 对于具有4~7Mb的基因组尺寸的细菌具有最小集合尺寸0. 5X105至1X105,例如5X105， 优选至少约1X106个突变体。在许多情况下，1X10 6个突变体将允许识别~300, 000个不 同的插入位点并对应于1个转座子插入/13~23bp(或约40~70个不同插入位点/基 因）。
[0080] 然而，本发明的方法不一定需要全面的突变体集合（按照以上定义的意义）以返 回有用信息。相反，可以使用小于理想的全面集合的集合尺寸，条件是分辨率降低（和随之 而来的不能检测某些基因）是可以容忍的。例如，当所述方法设计成反复执行直到所述靶 被识别时，情况可能就是这样：在这些实施方式中，所述有效的集合尺寸随着所述方法的每 次重复而增加。
[0081] 转座子诱夺
[0082]转座子，有时也称为可转座元件（transposableelement)，是能够将其自身拷贝 插入到其它多核苷酸中的多核苷酸。术语转座子对于本领域技术人员是公知的并且包括能 够基于序列组织，例如在各端的短的反向重复；在所述端部直接重复的长末端重复（LTR); 和在RNA转录本的3'端的polyA(5'端经常短截）加以区分的转座子种类。
[0083] 转座体（Transposome)是转座酶-转座子复合物，其中所述转座子不编码转座酶 活性。因此，一旦插入，所述转座子是稳定的。优选为了确保突变体集合稳定性，所述转座 子不编码转座酶而以转座体（即，作为