与转座酶的复合物）的形式提供，正如以下所述。
[0084] 正如本文中所用术语"活化的转座子"（下文缩写为"TnA"）定义包含启动子使 得转座子插入增加所述插入位点或其附近的基因转录的转座子。这种转座子的实例描述 于Troescheletal. (2010)MethodsMolBiol. 668:117-39 和Kimetal. (2008)Curr Microbiol. 57(4) : 391-394 中。
[0085] 所述活化的转座子/转座体能够通过广泛多样的本领域技术人员公知的标准方 法中任一种引入到所述细菌基因组（包括染色体和/或质粒DNA)中。例如，Tn#座体能 够通过电穿孔（或任何其它合适的转化方法）引入。
[0086] 优选这种转化方法产生1X103~5X10 3个转化体/ngDNA，且这种转化效率一般 可使用电穿孔实现。
[0087] 可替代的，使用1^的转座子诱变可以体外进行且重组分子转化/转染到细菌细 胞中。在这些实施方式中，转座体可以通过将市售转座酶与所述转座子DNA片段混合根据 标准方案进行制备。所得转座体随后与感兴趣的质粒的质粒DNA混合以允许转位，然后使 用电转化将所述DNA引入到宿主细菌菌株中，从而产生质粒转座子突变体集合。
[0088] 在诱变体外实施的实施方式中，有可能将转座体与基因组DNA体外混合随后将所 述诱变的DNA(可选地，在片段化和/或环化之后）引入宿主细菌菌株（例如，通过电穿孔）， 由此内源性重组机器将其结合至所述基因组中。这种方法可以尤其适用于细菌是天然感受 态的（naturallycompetent)(例如，不动杆菌属）和/或能够通过同源交叉（例如，双重 交叉）重组事件结合DNA的情况。
[0089] 话用于本发明方法的活化转座子
[0090] 任何合适的活化转座子可以用于本发明的方法。合适的转座子包括基于Tn3和类 Tn3(II类）转座子的那些，包括yS(TnlOOO)，Tn501，Tn2501，Tn21，Tn917 及其相关物。 此外还有TnlO,Tn5,TnphoA，Tn903,噬菌体Mu和相关的可转座噬菌体。多种合适的转座子 也可以商购获得，包括例如所述EZ-Tn5?〈R6Kyori/KAN-2>转座子。
[0091] 优选的转座子是携带抗生素抗性基因的那些（其能够用于识别携带转座子的突 变体），包括Tn5,TnlO和TnphoA。例如，TnlO在其IS元件之间携带四环素抗性基因而Tn5 携带编码提供卡那霉素，链霉素和博来霉素抗性的多肽的基因。其它合适的抗性基因包括 包含氯霉素乙酰转移酶（提供氯霉素抗性）的那些。
[0092] 当然，有可能在转座子中的抗生素抗性基因的编码区或别处通过在IS元件之间 插入抗生素抗性基因的不同组合，或通过在转座子嵌合末端（mosaicend)(优选的）之间 插入抗生素抗性基因的组合，或通过改变所述转座子的多核苷酸序列，例如通过进行冗余 碱基取代或不影响所述转座子的转位或抗生素抗性特性的任何其它类型的碱基置换，而产 生新的转座子。这种转座子都包括在本发明的范围之内。
[0093] 在许多实施方式中，单个转座子用于产生所述突变体集合。然而，如以上的解释， 获得全面集合或文库所需的Tn插入突变体的数量（S卩，所述突变体集合尺寸），尤其取决于 任何Tn插入位点偏差。因此，在所述转座子插入位点偏差发生的情况下，可以使用两种以 上不同的转座子以减少或消除插入位点偏差。例如，可以采用基于Tn5和TnlO的两种不同 转座子的组合。
[0094] 话用于活化转座子的启动子
[0095] 在所述TnA中存在的启动子的性质依赖于所述转座子和最终细菌宿主的性 质。通常，要选择驱动所述插入位点附近或邻近DNA的高水平转录的高效向外定向 (outward-oriented)的启动子。
[0096] 所述启动子可包括：（a)普里布诺盒（Pribnowbox) (-10个元件）；(b)_35元件和 /或（c)UP元件。
[0097] 例如，所述lac启动子能够与EZ-Tn5?〈R6Kyori/KAN-2>转座子一起使用，且这 种构建体（construct)适用于检测例如大肠杆菌，肠杆菌属和肠杆菌科家族的其它成员， 如克雷伯氏菌属。其它合适的启动子包括：rplj(大核糖体亚基蛋白；中等强度启动子）； tac(人工lac/trp杂合体；强启动子）和rrnB(核糖体RNA基因启动子；非常强的启动子）。
[0098]确宙Tm插入的分布
[0099] 转座子插入的分布优选通过所述TnA插入位点邻近或附近（5'和/或3'）细菌DNA 测序（例如，通过对包含TnA-基因组DNA连接头的DNA测序）进行测定。通常情况下，对 所述TnA-端或两端侧翼或邻近的细菌DNA进行测序。
[0100] 测序的邻近DNA长度不必是太长，优选相对较短（例如，小于200个碱基对）。
[0101] 多种方法能够用于使用DNA测序以测定所述！^插入分布：这样的方法最近已被 称为Tn-seq方法（vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods6:767-772)。例如，Tn-seq方 法包括扩增的Tn连接头的亲合纯化（Gawronskietal. (2009)PNAS106:16422-16427); 使用专用限制位点将适配子连接到所述转座子末端远端的基因组序列中（Goodmanet al. (2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods 6:767-772);选择性扩增（Langridgeetal. (2009)GenomeResearch19:2308-2316)和携 带Tn接头的单链DNA圆环的产生，其在通过核酸外切酶消化消除基因组DNA之后用作扩增 和测序的模板（Gallagheretal. (2011)mBio2(1) :e00315_10)。
[0102] 任何合适的高通量测序技术都可以使用，且有许多商用测序平台适用于本发明 的方法。基于边合成边测序（SBS)的测序平台（Sequencing-by-synthesis(SBS)-based sequencingplatform)尤其合适于本发明的方法：例如，Illumina?系统生成数百万相对 短的序列阅读（54, 75或100bp)，并且是特别优选的。
[0103] 其它合适的技术包括基于可逆染料终止子的方法。本文中，DNA分子首先附连至 载波片上的引物并进行扩增从而形成本地克隆菌落（桥扩增）。加入四种类型的ddNTP，并 冲洗掉非结合的核苷酸。与焦磷酸测序不一样，所述DNA每次只能延伸一个核苷酸。照相 机拍摄荧光标记的核苷酸的图像，然后从所述DNA中连同末端3'阻断剂一起化学去除所 述染料，允许进行下一循环。
[0104] 能够短序列阅读的其它系统包括SOLiD?和离子激流（IonTorrent)技术（二者 都由AppliedBiosystems?销售）。SOLiD?技术采用通过连接测序。本文中，固定长度的 所有可能的寡核苷酸的集合根据测序位置进行标记。寡核苷酸经过退火和连接；通过DNA 连接酶针对匹配序列优选连接导致在该位置产生所述核苷酸的信号信息。在测序之前，通 过乳液PCR扩增所述DNA。所得到的珠粒，各自仅含有相同DNA分子的拷贝，沉积于载玻片 上。所述结果是堪比Illumina测序的量和长度的序列。
[0105]IonTorrentSystemsInc.已经开发出了一种基于使用标准测序化学（但具有基 于新型半导体的检测系统）的系统。这种测序的方法，相对于其它测序系统中使用的光学 方法，是基于所述DNA聚合期间释放的氢离子的检测。包含有待测序的模板DNA链的微孔 充满单一类型的核苷酸。如果所引入的核苷酸互补于先导模板核苷酸，则它结合到生长的 互补链中。这导致触发过敏性离子传感器的氢离子的释放，这表明已发生反应。如果均聚 物重复存在于所述模板序列中，则在单个循环中可以结合多个核苷酸。这导致相应数量的 释放的氢和按比例地更高的电子信号。
[0106] 基因的功能1平价
[0107] 通过比较测试培养物之间！^插入的分布识别的基因可以进一步通过直接或间接 评价其功能的各种技术进行表征。按照这种方式，基本功能可以明确地指定于所述基因。
[0108] 合适的技术包括生物信息学，其中所述（全部或部分）推定的必需基因的序列用 于查询含有来自测试细菌和/或其它物种的信息的序列数据库，以识别出其基本生物化学 功能已经指定和/或已经证明是必需的基因（例如，其它物种中的直系同源基因）。
[0109] 合适的生物信息学程序对于本领域技术人员而言是公知的，并包括BasicLocal AlignmentSearchTool(BLAST)程序（Altschuletal. (1990)J.Mol.Biol. 215:403-410 和Altschuletal.(1997)Nucl.AcidsRes.25:3389-3402)。合适的数据库包括，例如， EMBL，GENBANK，TIGR，EBI，SWISS-PROT和trEMBL。
[0110] 可替代地，或另外地，所述（全部或部分）基因序列用于查询包含信息的序列 数据库，以识别先前使用现有技术中所述的传统Tn-seq方法（例如，正如Gawronskiet al. (2009)PNAS106:16422-16427；Goodmanetal. (2009)CellHostMicrobe6:279-289； vanOpijnenetal. (2009)Nat.Methods6:767-772；Langridgeetal. (2009)Genome Research19:2308-2316;Gallagheretal. (2011)mBio2(l):e00315-10中所述）和/或 TO01/07651所描述的技术（其内容结合于本文中作为参考）构建的必需基因。
[0111] 尽管启动子存在于插入序列中，许多！^插入将破坏基因/DNA的功能并允许识别 必需的/重要的DNA区域，如在标准Tn-seq(包括TraDIS)。然而，一些转座子将相对于特 异性DNA区域进行适当定位，由此由所述插入启动子驱动的那些特异性区域的转录，相对 于内源性转录显著地增强。通过在不同条件下生长所述突变体集合并重复所述测序，有可 能观察到阅读数的变化，这不仅指示哪个DNA区域有助于生长和/或存活，而且还指示相对 贡献。更高水平的特定抗生素靶转录（由转座子插入的启动子驱动）将有利于细菌存活并 将插入位点连接至DNA区域附近。
[0112] 所述插入启动子的位置能够相对于其对相关下游DNA序列的转录增加贡献进行 评价。这种技术数学/技术上直接的生物信息学组件允许识别插入的启动子序列对所推测 基因转录的贡献。例如，部分基因转录本可以仍然编码足够的信息，以允许翻译短截的但具 有功能的蛋白。生物信息学将允许在毗邻于有待考虑的插入转座子的基因下游的基因上实 施转录通读，其中那里没有定义的RNA转录终止序列。
[0113] 例如，基因A，B和C上游的转座子/启动子可以生成所有三个基因（A-C)的多顺 反子转录本，B上游是基因B和C的多顺反子转录本而C上游只有基因C。如果在抗生素中 前两个转座子的阅读较高而第三个较低，则所述抗生素靶将是基因B。
[0114] 本发_的设计的突夺体细菌的牛物抟术应用
[0115] 这些应用包括：生物治理；微生物增强采油；废水处理；污水处理；食品生产；能 量生产；生物生产；生物消化/生物降解；疫苗；生物传感器；益生菌；生物催化；生物学控 制；和药物递送载体。
[0116] Mffi
[0117]