对植物赋予高产性的核酸、制备产量增加的转基因植物的方法、使植物的产量增大的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对植物赋予高产性的核酸、特别是含有源自稻野生种长雄野生稻 的假应答调节因子的启动子和/或假应答调节因子的编码区域的核酸。并且，本发明涉及 一种使用上述核酸使产量增加的转基因植物的制备方法及使植物的产量增大的方法。
【背景技术】
[0002] 1.有关使植物的数量性状增加的基因的研宄
[0003] 为了培育农业上有益的新品种，进行了使植物彼此杂交而筛选后代的杂交育种法 或诱发植物突变的突变育种法等。另外，近年来，还培育有导入有用基因并表达其功能的基 因重组植物。为了培育这样的新品种，有效的方法是聚集赋予了优异性质的基因，但在期望 进一步提高作物的生产率的情况下，可利用的基因仍然较少，特别希望对控制高产性状等 数量性状的基因进行确定。
[0004] 近年来，随着分子生物学方法的发展，可使用DNA标记物进行数量性状的基因分 析。并且，还在积极地进行利用遗传图谱，并利用分子生物学方法来进行克隆农业上有用 基因的研宄。在构建有遗传图谱的生物中，进行有通过显示特定的表达型的性状和标记物 的连锁分析、以及随后的染色体步移等而尝试确定控制其性状的基因的物理位置并进行分 离基因（图谱克隆法）。但是，通常只能粗略确定含有控制数量性状的基因的部位，只能 理论上确定含有大量基因的DNA片段。而且，作为可进行克隆大小的片段或者可通过转化 导入植物大小的片段，不容易确定。另外，制备详细的基因图谱、以图谱信息为基础对要得 到的基因进行确定并对基因进行克隆的作业需要长时间和大量工作量。实际上，虽然有 若干通过图谱克隆法对使数量性状增大的基因进行克隆的例子（非专利文献1:Ashikari et.al. 2005、非专利文献2:Miuraet.al. 2010)，但其数量仍然非常有限。
[0005] 已知非洲野生的稻野生种长雄野生稻（0.longistaminata)虽然与作为栽培种的 栽培稻（O.sativaL.)具有相同的A基因组，但与栽培种相比，显示较大的生物质。本发明 人培育在稻栽培品种"Shiokari"中导入长雄野生稻的长花药的过程中，显示生长旺盛性的 BC7F6系统"No. 645"。然后，成功地利用图谱克隆将赋予生长旺盛性的区域缩小至第7染 色体最末端部约180kb。然后，对该区域的约82kb进彳丁喊基序列确定，对以其为基础制备的 转化体进行调查，但无法得到显示生长旺盛性的转化体（非专利文献3)。
[0006] 2?植物的钟相关基因
[0007] 关于植物的钟相关基因，在使用拟南芥（Arabidopsis:拟南芥属）的研宄中，发现 CIRCADIANCLOCKASS0CIATED1(CCA1),LATEELONGATEDHYP0C0TYL(LHY),TIMINGOFCAB EXPRESSION(T0C1)这样的3个基因。而且，已明确：构成植物的昼夜节律时钟的基础的机 制是这些基因表达的反馈环路。其中，T0C1基因作为假应答调节因子（Pseudoresponse regulator:PRR)之一而熟知。以下，将假应答调节因子记为PRR。作为拟南芥中所确定的 PRR基因，目前包含TOCl(PRRl)在内已知有PRR3、PRR5、PRR7、PRR9这5个。并且，发现按 照PRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1 (T0C1)的顺序，通过表达量上升/衰减而引起昼夜交替现 象（非专利文献 4:Matsushikaet.al. 2000)。
[0008]然后，在单子叶植物的稻中，确定了 5种与双子叶植物的拟南芥的PRR基因对应 的直系同源物，明确这些直系同源物与拟南芥同样地显示昼夜节律。并且，这些稻的直系 同源物、即OsPRRl、0sPRR37、0sPRR59、0sPRR73、0sPRR95分别定位于稻的基因组上的第 1染色体、第7染色体、第11染色体、第3染色体、第9染色体（非专利文献5:Murakami et.al. 2003)。另外，有向拟南芥的PRR7基因突变株导入以拟南芥PRR7的启动子对稻 0sPRR37cDNA的表达进行控制的构建体而显示功能互补的报告（非专利文献6:Murakami et.al. 2006) 〇
[0009]另外，在粳稻品种"日本晴"和籼稻"卡萨拉斯（kasalath) "之间，对OsPRR基 因的表达谱进行比较，结果非常相似，表明在粳稻和籼稻之间非常保守（非专利文献7 : MurakamiMet.al. 2005)。
[0010] 可是，关于PRR基因，报告有：通过将组成型启动子连接于该基因，植物的产量增 加。具体而言，已知有向稻导入将稻中组成型表达的启动子（G0S2启动子）连接于源自番 茄的PRR2结构基因而成的构建体，结果稻的产量增加的实例（专利文献1)，或者向稻导入 将组成型启动子（RICEACTIN启动子）连接于源自拟南芥的PRR5基因而成的构建体，结果 稻的茎数增加且高度伸长的实例（专利文献2)。但是，迄今为止不存在着眼于PRR的启动 子的例子。
[0011] 现有技术文献
[0012] 专利文献
[0013] 专利文献1 :美国专利申请公开2011/0145949
[0014]专利文献 2 :W02011/049243
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献 1:AshikariM.，SakakibaraH.，LinS.，YamamotoT.，Takashi T. ,NishimuraA. ,AngelesER. ,QianQ. ,KitanoH. ,andMatsuokaM. (2005)Cytokinin oxidaseregulatesricegrainproductionScience309:741-745
[0017] 非专利文献 2:MiuraK. ,IkedaM. ,MatsubaraA. ,SongX.J. ,ItoM. ,Asano K.,MatsuokaM. ,KitanoH.andAshikariM. (2010)0sSPL14promotespaniclebranching andhighergrainproductivityinriceNatureGenetics42:545-549
[0018] 非专利文献3:前川雅彦、小森俊之"稻野生种长雄野生稻染色体部分导入系 统中的生长旺盛性所涉及的原因基因分离和功能冬野生種才y寸'?口y芊只夕s 于一夕染色体部分導入系統(乙朽汀§生育旺盛性(乙係打§原因遺伝子単離t機能解析， QT2002) 40-43 "研宄成果第473集"利用基因组育种的有效的品种育成技术的开发-QTL 基因分析的推进-(yyA育種CA3効率的品種育成技術?開発一QTL遺伝子解析?推 進一）"平成21年2月20日发行编辑发行农林水产省农林水产技术会议事务局
[0019]非专利文献 4:MatsushikaA.，MakinoS.，KojimaM.andMizunoT. (2000) CircadianWavesofExpressionoftheAPRR1/T0C1FamilyofPseudo-Response RegulatorsinArabidopsisthaliana:InsightintothePlantCircadianClockPlant CellPhysiol. 41:1002-1012
[0020] 非专利文献 5:MurakamiM.，AshikariM.，MiuraK.，YamashinoT.andMizuno T. (2003)TheEvolutionarilyConservedOsPRRQuintet:RicePseudo-Response RegulatorsImplicatedinCircadianRhythmPlantCellPhysiol.44:1229-1236
[0021] 非专利文献 6 :MURAKAMI，M.，Y.TAG0,etal. (2007)."Characterizationofthe RiceCircadianClock-AssociatedPseudo-ResponseRegulatorsinArabidopsis thaliana.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry71 (4):1107-1110.
[0022] 非专利文献 7:MurakamiM.，MatsushikaA.，AshikariM.，Yamashino T.andMizunoT. (2005)Circadian-associatedricepseudo-response regulators(OsPRRs):InsightintothecontroloffloweringtimeBiosci. Biotechnol.Biochem. 69:410-414
[0023]非专利文献 8 :Harushima，Y.，Yano,M.，Shomura，A.，Sato,M.，Shimano,T.，Ku boki,Y. ,Yamamoto,T. ,Lin,S.Y. ,Antonio,B.A. ,Parco,A. ,Kajiya,H. ,Huang,N. ,Yama moto,K. ,Nagamura,Y. ,Kurata,N. ,Khush,G.S. ,andSasaki,T. (1998)Ahigh-density ricegeneticlinkagemapwith2275markersusingasingleF2population. Genetics，148, 479-494.
[0024]非专利文献 9:Hieietal(1994)Efficienttransformationofrice(Oryza SativaL)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofboundariesofthe T-DNAPlantJ. 6:271-282.
[0025]非专利文献 10:Komarietal(1996)VectorscarryingtwoseparateT-DNAs forco-transformationofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens andsegregationoftransformantsfreefromselectionmarkers.PlantJ. 10, 165 -174.
[0026]非专利文献 11:Dittaetal(1980)BroadhostrangeDNAcloningsystem forgram-negativebacteria:constructionofagenebankofRhizobiummeliloti. ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica 77:7347-7351.
[0027]非专利文献 12:Ishidaetal. (2007)Agrobacterium-mediatedtransformation ofmaize.NatureProtocols2:1614-1621.
[0028]非特专利文献 13 :0gisoetal. (2010)TheroleofcaseinkinaseII infloweringtimeregulationhasdiversifiedduringevolution.Plant Physiology. 152:808-820
【发明内容】
[0029] 发明所要解决的问题
[0030] 如上所述，需要开发一种使植物的数量性状增加的方案。因此，本发明要解决的问 题在于，提供一种可对植物赋予高产性的核酸。并且，本发明提供一种使用这样的核酸使产 量增大的转基因植物及使植物的产量增大的方法。
[0031] 用于解决课题的技术方案
[0032] 本发明人等利用图谱克隆对位于长雄野生稻的第7染色体最末端部的赋予生长 旺盛性的区域进行研宄，缩小至第7染色体最末端部约180kb。确定了该区域的82kb的碱 基序列，5处存在lkbp以上的较大的缺失，在末端侧还存在约3kbp的插入。因此，虽然缩小 至约180kb，但由于该差异，难以进行进一步缩小。
[0033] 本发明人等也考虑"日本晴"的全长cDNA的位置，对该82kb区域设计并制制备了 7个构建体并进行了研宄。其结果，明确了：位于约82kb区域的PRR7基因同源物是赋予高 产性的原因基因。并且，本发明人等发现，令人吃惊的是，长雄野生稻的高产性不仅由基因 区域赋予，长雄野生稻的启动子区域贡献较大。
[0034] 基于以上见解，本发明提供一种含有长雄野生稻中假应答调节因子基因的启动子 的碱基序列的核酸及该启动子与假应答调节因子的结构基因可操作地连接而成的核酸。这 样的核酸可对植物赋予高产性。
[0035] 本发明优选通过以下记载的方案来进行，但并不限定于此。
[0036] [方案 1]
[0037] 一种核酸，其含有：
[0038] (1)序列号1的34845-35044所示的碱基序列、或
[0039] (2)与序列号1的34845-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0040] [方案2]
[0041] (1)序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或
[0042] (2)与序列号1的33045-35044所不的喊基序列具有至少90%的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0043] [方案3]
[0044] 一种核酸，其含有：
[0045] (1)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或
[0046] (2)与序列号1的26779-35044所不的喊基序列具有至少80 %的同一性，且显不 促进植物基因转录的活性的碱基序列。
[0047] [方案4]
[0048] 一种核酸，其是源自长雄野生稻的碱基序列，其至少包含由序列号1的 34845-35044所示的碱基序列，且显示促进植物基因转录的活性。
[0049] [方案5]
[0050] 根据方案4所述的核酸，其含有由序列号1的33045-35044所示碱基序列构成的 核酸的片段。
[0051] [方案 6]
[0052] 根据方案4或5所述的核酸，其含有由序列号1的26779-35044所示碱基序列构 成的核酸的片段。
[0053] [方案 7]
[0054] -种核酸，其通过使下述核酸可操作地连接而成：
[0055] (1)方案1~6中任一项所述的核酸，以及
[0056] (2)编码（a)~（c)规定的蛋白质的核酸，其中，
[0057] (a)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一 性的氨基酸序列；
[0058] (b)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0059] (c)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0060][方案8]
[0061] 根据方案7所述的核酸，其能够增大植物的产量。
[0062][方案9]
[0063] 一种载体，其含有方案1~8中任一项所述的核酸。
[0064][方案10]
[0065] 一种转基因植物，其含有方案7或8所述的核酸。
[0066][方案11]
[0067] 根据方案10所述的转基因植物，其中，所述植物为单子叶植物。
[0068][方案12]
[0069] 根据方案11所述的转基因植物，其中，所述植物为稻或玉米。
[0070][方案13]
[0071] 一种制备产量增大的转基因植物的方法，其包括：将方案7或8所述的核酸或方案 9的载体导入植物的工序。
[0072][方案14]
[0073] 根据方案13所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。
[0074][方案15]
[0075] 根据方案14所述的方法，其中，所述植物为稻或玉米。
[0076][方案16]
[0077] -种使植物的产量增大的方法，其包括：将方案7或8所述的核酸导入植物。
[0078][方案17]
[0079] -种用于对产量增加的植物进行筛选的DNA标记物，其含有序列号1的 26779-35044所示碱基序列和/或序列号1的35825-46721所示碱基序列中的15~2000 个碱基。
[0080][方案18]
[0081] 一种方法，其包括：对植物中方案17所述的DNA标记物进行检测，并在检测出该 DNA标记物时将该植物判断为高产性。
[0082][方案19]
[0083] -种方法，其包括：使用含有序列号1的34845-35044所不碱基序列、或与序列号 1的34845-35044所不喊基序列具有至少90%的同一性的喊基序列的核酸来提尚植物基因 的转录活性。
[0084][方案20]
[0085] 一种方法，其包括：使用含有序列号1的33045-35044所示的碱基序列、或与序列 号1的33045-35044所示的碱基序列具有至少90%的同一性的碱基序列的核酸来提高植物 基因的转录活性。
[0086] [方案 21]
[0087] -种使植物的产量增大的方法，其包括：将可操作地连接的下述（1)及（2)的核酸 导入植物，其中，
[0088] (1)包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸：
[0089] (a)序列号1的26779-35044所示的碱基序列、或包含该碱基序列的一部分构成且 显示促进植物基因转录的活性的片段；或
[0090] (b)与上述（a)所示的碱基序列具有至少90%的同一性且显示促进植物基因转录 的活性的喊基序列；
[0091] (2)编码下述（c)~（e)规定的蛋白质的核酸：
[0092] (c)与序列号3所示氨基酸序列或序列号5所示氨基酸序列具有至少80%的同一 性的氨基酸序列；
[0093] (d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基酸 序列或与其具有至少90%的同一性的氨基酸序列；且
[0094] (e)具有抑制LHY(LateElongatedHypocotyl)基因及CCA1(Circadian Clock-Associated1)基因的转录的活性。
[0095] [方案 22]
[0096] -种核酸，其编码具有序列号3所示氨基酸序列的蛋白质。
[0097] [方案 23]
[0098] -种蛋白质，其具有序列号3所示氨基酸序列。
[0099] [方案 24]
[0100] 一种核酸，其由下述（1)及（2)的核酸可操作地连接而成，其中，
[0101] ⑴包含下述（a)或（b)规定的碱基序列的核酸：
[0102] (a)序列号19所示碱基序列；或
[0103] (b)与序列号19所示的碱基序列具有至少80%的同一性且显示促进植物基因转 录的活性的碱基序列，
[0104] (2)对由下述（c)~（e)规定的蛋白质进行编码的核酸：
[0105] (c)序列号17所示氨基酸序列、或与序列号Y所示氨基酸序列具有至少80%的同 一性的氨基酸序列；
[0106] (d)含有植物的假应答调节因子蛋白质中假受体结构域的氨基酸序列或与其具有 至少90%的同一性的氨基酸序列、以及植物的假应答调节因子蛋白质中CCT基序的氨基