花重量（以下为每穗重）进行性状调查。2008年除对照的"Shiokari"以外，对作为 参考品种的、仅将长雄野生稻的第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 240" 进行栽培。
[0258] 将各构建体5系统的农业性状数据的平均值示于表5。Fr4构建体与对照的 "Shiokari"相比，直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗粒数、种子育性、每穗重、基杆直径 的7个性状大幅提高，与此相对，剩余的6个构建体在全部的性状中与"Shiokari"相同或 为其以下。
[0259][表 5]
[0260] 重组体的性状评价试验
[0261]
[0262] 接着，对于Fr4系统中其特性最显著地被显示的Fr4_4,对个体分别进行PCR，考察 导入基因的有无与性状测定值大小的关系。将其结果示于表6和图4。基因持有个体与缺 失个体相比，明确在长昼条件下（14小时30分钟），直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗 粒数、每穗重、基杆直径方面提高。另外，基因持有个体与缺失个体相比，还明确了着粒密度 (每lcm穗的粒数）高。
[0263] 根据以上的结果，明显教导对"Shiokari"赋予高产性的基因组片段为Fr4片段。
[0264] [表6]
[0265] 系统Fr4_4中基因的有无和产量性状的关系
[0266]
[0267] 2009年将在2008年栽培的Fr4_4的基因持有个体及基因缺失个体的后代（T2代） 与对照的"Shiokari"、"No. 240" 一起栽培（1个系统12个个体），评价产量性状。播种在 2009年5月1日进行，在5月11日向放入了水稻田土壤的3. 5升的桶中各移植4个个体。 栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭体系 温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中在无施肥条件下进行。收获在8月19日进行。 对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖 花重量（以下为每穗重）进行性状调查。
[0268] 将结果示于表7。基因持有个体的后代Fr4-4_1和Fr4-4_2与基因缺失个体的后 代Fr4-4-3相比，明确在天长条件下（14小时30分钟），直到出穗为止的天数、杆长、穗长、 每穗粒数、每穗重、基杆直径方面提高。另外，基因持有系统与缺失系统相比，还明确了着粒 密度（穗每lcm的粒数）高。另一方面，可知Fr4-4-3的总性状测定值与"Shiokari"大致 相同。
[0269] 根据以上的结果，得出了对"Shiokari"赋予多产的基因组片段为Fr4片段的 结论。若参照日本晴序列（AP005199)的注释信息，则Fr4片段中包含日本晴全长cDNA AK066112的等位基因，推测该基因赋予高产性。另外，K066112基因座在Murakamiet al. (2005)中记载为OsPRR37。因此，推测长雄野生稻所具有的PRR7基因为对"Shiokari" 赋予多产的原因基因。而且，认为该Fr4片段中含有对PRR7基因进行编码的区域及用于使 其表达的的区域。
[0270][表 7]
[0271] 系统Fr4_4的T2后代的评价试验
[0272]
[0273]实施例4 :长雄野牛稻PRR基闵的编码厌域的效果的确认
[0274] 根据实施例3的结果，认为长雄野生稻所具有的PRR7基因为赋予高产性的基因。 为了对其进行确认，调查长雄野生稻的PRR基因的编码区域对产量相关性状造成的影响。
[0275] 具体而言，如下制备构建体：使作为启动子的泛素启动子、作为终止子的长雄野生 稻的PRR基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因的编码区域连接而成。泛素启动子 为通常用于单子叶植物的组成型启动子，认为适合用于观察PRR基因的效果。将这些构建 体导入栽培稻"Yukihikari"而实施产量相关性状的评价。
[0276] 使用重叠延伸（overlapextension)PCR等常规方法来构建构建体：其用于使源 自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域（序列号2)在泛素启动子的控制下进行表达。具体 而言，如下制备构建体：将含有PSB200的泛素启动子及泛素内含子的区域进行PCR扩增，并 在其相邻下游，将嵌合基因插入于PSB200的多克隆位点，所述嵌合基因通过对长雄野生稻 的翻译开始点上游区域（序列号1的第35045号碱基至第35824号碱基）、序列号2及长 雄野生稻的翻译终止点下游区域（序列号1的第46722号碱基至第49157号碱基）连接而 成。另外，使用仅持有选择标记基因（潮霉素抗性基因）的质粒作为对照。
[0277] 使用上述持有2种构建体的大肠杆菌，通过实施例2中记载的方法进行三亲交配 (triparentalmating)及向栽培稻"Yukihikari"的转化。转基因稻在驯化后，在封闭体 系温室中栽培。PRR7基因以及对照的构建体分别独立培育60个个体、20个个体的转化体。 供试60个个体中，观察到18个个体显示（1)植被高度较高、（2)茎粗、（3)直到出穗为止的 天数长这样的与高产性相关特性的个体。对于该18个体，对成熟期观察穗的性状进行观察 时，在全部个体中，观察到：（1)种子育性低（低于20% )、（2)穗未从止叶充分地抽出、（3) 颖花处于开颖而未闭颖等任一种状况。而且，最终的种子产量与对照相比，大幅降低（图 5)。另一方面，剩余的42个个体显示与对照的20个体大致相同的特性，未观察到上述的不 良性状。
[0278] 根据以上的结果，无法确认长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码区域为赋予高 产性的基因。
[0279] 实施例5 :将源自长雄野牛稻的启动子和各种PRR基闵编码厌域连接而成的构律 体的效果
[0280] 根据实施例4的结果，无法得出长雄野生稻所具有的PRR7基因的编码区域为赋予 高产性的基因的结论。因此，发明人等进行了潜心研宄，结果考虑长雄野生稻的PRR7基因 的启动子区域对于长雄野生稻的PRR7基因的表达是否是必须的，制备构建体并导入至栽 培稻，实施产量相关性状的评价，所述构建体使作为启动子的长雄野生稻的PRR7基因的启 动子区域、作为终止子的长雄野生稻的PRR7基因的终止子区域与长雄野生稻的PRR7基因 的编码区域连接而成。另外，作为用于对长雄野生稻PRR7基因的效果进行评价的对照，制 备构建体进行实验，所述构建体使通常的栽培稻"日本晴"的PRR7基因的编码区域与上述 启动子及终止子连接而成。
[0281] 长雄野牛稻PRR基闵及栽培稻"日本晴"PRR基闵的分离
[0282] 使用RNeasyPlantMiniKit(QIAGEN)，从长雄野生稻染色体片段导入系统 "No. 645"及"日本晴"的幼苗中提取总RNA。按照试剂盒的手册进行了操作，但未使用添加 于RLT缓冲液的巯基乙醇，而添加了DTT使其最终浓度为40mM来代替。利用附属的RNase 1^66￥3七61'(40~50 1^1)使总謝4溶出后，进行0似86处理（1'111?130 0嫩-；1^'66 1(；[1：，41]113；[011)。 将处理后的RNA溶液利用琼脂糖凝胶电泳检查浓度及纯度，然后，通过QuantiTectRev. Transcriptionkit(QIAGEN)进行cDNA合成。为了以得到的cDNA溶液作为模板分离PRR 基因的编码区域，使用以下的2种引物进行RT-PCR。下述的longi-PRR2F与序列号1的 35847-35869所示的碱基序列对应，longi-PRR2R与序列号1的46713-46735所示的碱基 序列对应。
[0283] longi-PRR2F:ACCAAACCGCCGGCTCTGCCCTC(序列号6)
[0284] longi-PRR2R:GGTAGGTAGGTAGGTCATCTGTC(序列号7)
[0285] 使用该结果得到的碱基序列确定"No. 645"持有的源自长雄野生稻的PRR7结构基 因的碱基序列（序列号2)。推测该碱基序列为对由740个氨基酸构成的蛋白质（序列号3) 进行编码的碱基序列。在序列号3中，相当于氨基酸编号62~176的区域为PR结构域，相 当于氨基酸编号676~722的区域为CCT基序。另外，日本晴的PRR7结构基因的碱基序列 (序列号4)也使用同样的方法进行确定，推测该碱基序列为对由742个氨基酸构成的蛋白 质（序列号5)进行编码的碱基序列。在序列号5中，相当于氨基酸编号62~176的区域 为PR结构域，相当于氨基酸编号678~724的区域为CCT基序。
[0286] 将由分离的日本晴来源、长雄野生稻来源及拟南芥来源的PRR基因的翻译区域所 编码的氨基酸序列的序列对比示于图6。并且，将由分离的日本晴来源、长雄野生稻来源及 拟南芥来源的PRR基因的翻译区域所编码的氨基酸序列的同一,性（identity) %和相似性 (similarity) %的值示于图7。
[0287] 含有各PRR基闵的构律体的制各
[0288] 通过以下的步骤制备下述构建体：其将分离的cDNA插入于源自长雄野 生稻的PRR7基因的启动子区域和终止子区域之间而成。PCR使用PrimeSTARMAX DNAPolymerase(TAKARA-BI0 株式会社），连接使用DNALigationKit"Mighty Mix"（TAKARA-BI0株式会社）。另外，将下述构建体的制备策略图解并示于图8。
[0289] (1)包含源自长雄野生稻的PRR7基因的编码区域的构建体（以下为longi构建 体）
[0290] 以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物进行PCR。下述的 longi-PRR1F与序列号1的34019-34044所示的碱基序列对应，longi-PRR1R与序列号1 的35838-35861所示的碱基序列对应。
[0291]longi-PRR1F:CGCTTCGAAGATATCATCATCATTCATGTATGAG(序列号 8)
[0292]longi-PRR1R:AGCCGGCGGTTTGGTTGTGATGAG(序列号 9)
[0293] 接着，对得到的PCR产物和上述源自"No. 645 "的RT-PCR产物进行测试，使用 longi-PRR1F及longi-PRR2R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq(TAKARA-BI0 株式会社） 对得到的PCR产物添加A-Tai1后，克隆于pCR-XL-T0P0 (Invitrogen株式会社），然后，为了 破坏PCR-XL-T0P0上原本存在的PstI部位，在EcoRV处理后，进行自我连接。自我连接后， 进行利用SacI及PstI的消化以及利用CIAP(TAKARA-B10株式会社）的脱磷酸化。利用琼 脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段（包含图8的片段1)。
[0294]另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用以下的2种引物进行PCR。 下述的longi-PRR3F与序列号1的46721-46744所示的碱基序列对应，longi-PRR3R与 序列号1的49137-49157所示的碱基序列对应。
[0295]longi-PRR3F:ACCTACCTACCTACCTACGCAATG(序列号 10)
[0296] longi-PRR3R:GCTAGAATTCGAGCTCTCCAGGGAGCAGGGA(序列号11)
[0297] 对得到的PCR产物和上述源自"No. 645"的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR 2F及longi-PRR3R进行重叠延伸PCR。将得到的PCR产物利用SacI及PstI消化后，利用 琼脂糖对反应液进行电泳，回收2. 6kb片段（图8的片段2)用于插入。该2. 6kb片段与序 列号1的4605649156所示的碱基序列对应（其中，46108-46595为内含子，因此受到剪接而 成为46056-46107和46596-49156串联结合而成的序列）。
[0298] 使用上述2种回收片段进行连接。将得到的质粒利用SacI及Notl消化后，利 用琼脂糖对反应液进行电泳，回收6. 5kb片段（图8的片段3)。使回收的片段3克隆于 PSB200 (利用SacI及Notl进行消化后，进行CIAP处理）。对得到的质粒进行测试，利用 Notl及EcoRV进行消化以及利用CIAP进行脱磷酸化。利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收 载体片段（包含片段3)。另一方面，利用Notl及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进 行消化，利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收7. 3kb片段（片段4)。该7. 3kb片段与序列号 1的26779-34022所示的碱基序列对应，使用两片段进行连接，得到目标质粒。
[0299] (2)含有源自日本晴的PRR7基因的编码区域的构建体（以下为日本晴构建体）
[0300] 以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR1F及longi-PRR1R 进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR IF及longi-PRR2R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq对得到的PCR产物添加A-Tail后，克 隆于PCR-XL-T0P0。利用PstI及Notl对得到的质粒进行消化后，利用琼脂糖反应液进行电 泳，回收3. 9kb片段（源自日本晴cDNA-图8的片段1)作为插入物。
[0301] 另外，以实施例2的Fr4构建体的质粒作为模板，使用longi-PRR3F及longi-PRR 3R进行PCR。对得到的PCR产物和上述源自日本晴的RT-PCR产物进行测试，使用longi-PRR 2F及longi-PRR3R进行重叠延伸PCR。使用Ex-Taq对得到的PCR产物添加A-Tail后，克 隆于PCR-XL-T0P0。利用SacI及PstI对得到的质粒进行消化后，利用琼脂糖对反应液进行 电泳，回收2. 6kb片段（源自日本晴cDNA-图8的片段2)作为插入物。该2. 6kb片段与序 列号1的46056-49156所示的碱基序列对应（其中，46108-46595为内含子，因此受到剪接 而成为将46056-46107和46596-49156串联结合的序列）。
[0302] 将上述2种插入片段与pSB200 (利用SacI及Notl进行消化后，进行CIAP处理） 一起测试，进行连接。对得到的质粒进行测试，利用Notl及EcoRV进行消化以及利用CIAP 进行脱磷酸化。利用琼脂糖对反应液进行电泳，回收载体片段（包含源自日本晴cDNA-图 8的片段3)。
[0303] 另一方面，利用Notl及EcoRV对实施例2的Fr4构建体的质粒进行消化，利用琼 脂糖对反应液进行电泳，回收7. 3kb片段（图8的片段4)。使用两片段进行连接，得到目标 质粒。该7. 3kb片段与序列号1的26779-34022所示的碱基序列对应。
[0304] 使用持有（1)及（2)中得到的目标质粒的大肠杆菌，通过实施例2中记载的方法 进行三亲交配及"Shiokari"的转化。转基因稻在进行驯化后，在封闭体系温室中栽培。对 各构建体独立培育60个体的转化体，采种T1种子。从各构建体中按照采种量从多到少的 顺序选择18个个体，供于T1的评价试验。
[0305] 就T1代而言，1个构建体测试18个系统（1个系统为12个个体）。播种在6月25 日进行。在移植前分别对个体切下叶，浸渍于潮霉素溶液，将对潮霉素显示抗性的个体（推 测为持有基因的个体）作为移植的对象。在7月12日，在放入有稻用育苗土的容量570ml 的聚乙烯制罐中各移植1个个体（1个系统为12个罐、合计12个个体）。对施肥而言，在每 个罐中，将N、P、K各设为0. 21g、0. 33g、0. 05g。作为对照，除"Shiokari"以外，将仅将长雄 野生稻的第7染色体末端区域导入"Shiokari"而成的系统"No. 240"作为参考品种进行栽 培。栽培在日本Tobacco产业株式会社植物InnovationCenter的重组体评价专用的封闭 体系温室（14小时30分钟昼长的长昼条件）中进行。对出穗日、杆长、穗数、基杆直径、以 最大穗为对象的穗长、每穗粒数、种子育性、每穗受精颖花重量（以下为每穗重）进行性状 调查。
[0306] 将结果示于表8。首先，对于Longi构建体和日本晴构建体，分别观察全部18个 系统的平均值，与对照"Shiokari"相比，导入了两构建体的植物的直到出穗为止的天数、杆 长、穗长、每穗粒数、每穗重、基杆直径均明显提高。另外，导入了任一构建体的植物与对照 "Shiokari"相比，直到出穗为止的天数、杆长、穗长、每穗粒数、每穗重、基杆直径均显著提 高。并且，导入了Longi构建体的总18个系统、及导入了日本晴构建体的总18个系统的着 粒密度（穗每lcm的粒数）的平均值分别为5. 15粒/cm、4. 80粒/cm，明显比"Shiokari" 的着粒密度的平均值4. 40粒/cm高。
[0307] 以上，确认了PRR7基因是赋予高产性的原因基因。并且，若综合考虑实施例3和 实施例4的结果，则令人吃惊的是，可得到长雄野生稻的高产性与PRR7基因的编码区域相 比，启动子区域做出贡献的可能性较高这样的结果。
[0308] 此外，在表8中，若比较Longi构建体和日本晴构建体的植物的产量，则前者的效 果比后者的效果显著。因此，作为与启动子一起导入植物的结构基因，与日本晴PRR7基因 的结构区域相比，LongiPRR7基因的结构区域更合适。
[0309][表 8]
[0310] 野生稻长雄野生稻（0?longistaminata)及栽培稻日本晴的PRR基因的cDNA构建 体的产量相关性状的评价
[0311]
[0312] 实施例6 :长雄野牛稻和"日本晴"的PRR基闵表汰的分析
[0313] 根据实施例5的结果，推测PRR7基因的启动子区域对多产产生影响，因此，为了对 长雄野生稻的PRR7基因启动子和栽培稻"日本晴"的PRR7基因启动子的表达的不同进行 调查，使用"日本晴"和"No. 240"（通过杂交将长雄野生稻的PRR7基因导入"Shiokari"的 取代系统）的F1进行PRR7基因的表达分析。
[0314] 对"日本晴" (2个个体）、"No. 240" (2个个体）及"日本晴"和"No. 240"的F1 (4个 个体）进行测试，在播种3周后对最新的完全展开叶进行取样，通过实施例3中记载的方法 对总RNA进行提取及cDNA合成。另外，还准备未添加逆转录酶而进行调整的样品，用作阴性 对照。另外，使用在RNA提取时得到的DNase处理前的核酸溶液的一部分，准备总DNA溶液。 以得到的总DNA溶液及cDNA溶液作为模板，使用2种引物（CGAGGTACCATACACCTGTGGCTT(序 列号12)和GCATCTGAGTTTGACTTCATGTTG(序列号13))在以下的反应条件下进行PCR。
[0315]
[0316] 94°C 2 分钟
[0317] 94°C 30 秒钟
[0318] 60°C 30 秒钟
[0319](将94°C、30秒钟和60°C、30秒钟进行35个循环）
[0320]利用限制酶HpyCH4V(NewEnglandBiolabs株式会社）对PCR产物（130bp)在 37°C下处理一夜后，使用3%MetaphorAgarose(TAKARA-BI0株式会社）进行电泳。
[0321] 在将日本晴的总DNA溶液及cDNA溶液用作模板的情况下，PCR产物被HpyCH4V切 断，与此相对于，在将No. 240的总DNA溶液及cDNA溶液用作模板的情况下，PCR产物未被 HpyCH4V切断（图9A)。由上可以确认，通过本方法，可以识别来自日本晴等位基因的PCR 产物和来自长雄野生稻等位基因的PCR产物。
[0322] 因此，比较使用F1的样品进行HpyCH4V处理后的条带图案，结果显示，将cDNA溶 液用作模板的情况与将总DNA溶液用作模板的情况相比，未被HpyCH4V切断的PCR产物的 比率高。根据本结果，显示向日本晴导入了长雄野生稻基因的取代系统的F1与源自日本晴 的PRR7的等位基因表达量相比，源自长雄野生稻的PRR7的等位基因的表达量较多（图9B)