专利名称：通过超量表达yerP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法
技术领域：
本发明涉及通过超量表达J^rP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。背景技术：
枯草芽孢杆菌OfeCiBm ·5油^Vi1S)是目前公认的安全微生物之一，其抗菌代谢产物丰富多样，尤其是脂肽类抗菌物质，不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能，因此不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。枯草芽孢杆菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一种可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物质的枯草芽孢杆菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作为一种生物表面活性剂，与化学表面活性剂相比，其具有拥有生物降解能力，低毒，结构丰富的优点，随着对工业原料的环境适应性要求的提高， 其应用于环境保护，石油开采方面潜力将会越来越大。但实际中，其并未在工业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是因为它生产成本巨大，所以提高其产量便成为降低其生产成本的核心问题。目前，世界范围内，提高其产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化发酵条件， 而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。但随着对抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。J^r/7基因(Gene ID: 154684518)，其表达产物YerP蛋白是枯草杆菌中surfactin 抗菌肽的免疫蛋白，可以免疫surfactin对细胞自身的伤害，相关研究表明，YerP蛋白可以免除枯草杆菌分泌的surfactin对自身的伤害。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC 9943为出发菌株，以枯草杆菌表达载体 PHCMC04为骨架构建一个J^rP基因超量表达载体pHCMC-YerP，通过电转化将其转入到枯草杆菌ATCC9943中使J^rP基因超量表达，构建了一个高产抗菌肽菌株FMB 45。三、发明内容技术问题
本发明的目的是利用分子生物学技术，构建J^rP基因超量表达载体，通过电转化将其转入到枯草杆菌ATCC 9943中，从而构建一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株FMB 45。技术方案
1、通过超量表达J^rP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 (DyerP基因超量表达载体pHCMC_YerP的构建
根据枯草芽孢杆菌P43启动子基因设计引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢杆菌 {Bacillus subtilis)klCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增P43启动子基因，获得300 bp基因片段；设计引物YerP-F和YerP-R，以枯草芽孢杆菌(feci/A/s subtil is) ATCC 9943 基因组DNA为模板PCR扩增YerP基因，获得3195 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至PMD19-T载体，转化大肠杆菌(fecAericAia cWi) DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为p/￥J_T、pFerP- ,于_20°C条件下保存备用；
权利要求
1.通过超量表达J^rP基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于 (DyerP基因超量表达载体pHCMC_YerP的构建设计引物P43-F和P43-R，以枯草芽孢杆菌(feci/A/s subtil is) ATCC 9943基因组 DNA为模板PCR扩增P43启动子基因，获得300 bp基因片段；设计引物YerP-F和YerP-R， 以枯草芽孢杆菌(Mcillus subtiHs)kTCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增YerP基因表达框，获得3195 bp基因片段；扩增得到的两个基因分别克隆至PMD19-T载体，转化大肠杆 ^Escherichia co7i)DH5a,经验证、测序正确后，分别命名为 p/￥J_T、pVerP- ,于-20°C 条件下保存备用；
2.权利要求1所述方法获得的超量表达J^rP基因菌株FMB45。
3.权利要求2所述超量表达J^rP基因菌株FMB45在生产枯草芽孢杆菌抗菌肽中的应用。
4.权利要求2所述超量表达J^rP基因菌株FMB45生产的枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
全文摘要
本发明涉及通过超量达yerP基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pHCMC04为骨架构建一个基因超量表达载体pHCMC-YerP，通过电转化将其转入到枯草杆菌ATCC9943中使yerP基因超量表达，构建了一个高产抗菌肽菌株FMB45。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高。
文档编号C12P21/02GK102220367SQ20111010539
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月27日 优先权日2011年4月27日
发明者别小妹, 吕凤霞, 张充, 曹国强, 钟蕾, 陆兆新 申请人:南京农业大学