过量表达mtp基因的植物内的产量增加的制作方法

专利名称：：过量表达mtp基因的植物内的产量增加的制作方法过量表达MTP基因的植物内的产量增加交叉参考相关申请本申请要求2005年7月19日提交的美国临时申请系列号60/700,562的优先权，该文献的完整内容在本文中引用作为参考。发明背景发明领域本发明总体涉及编码与根发育有关的多肽的核酸序列，其中所述的核酸序列助于植物生长并且最终影响在非生物性胁迫条件或非胁迫条件下的植物生产(即产量)。尤其，本发明涉及编码多肽的分离的核酸序列，其中所述多肽赋予植物增加的根生长、增加的产量和/或增加的耐干旱性、耐寒性和/或耐盐性，并涉及此类分离的核酸的用途。技术背景作物植物的产量对人类福利是重要的并且受物理环境下植物的生长直接影响。非生物性环境胁迫如干旱胁迫、盐度胁迫、热胁迫和冷胁迫是植物生长及生产力的主要限制性因素。由这些胁迫所引起的主要作物如大豆、稻、玉米(corn)和小麦(wheat)的作物损失和作物产量损失代表重要的经济因素和政治因素，并且是许多欠发达国家中食品短缺的原因。植物生物量对饲料作物如苜蓿(alfalfa)、青贮玉米(silagecorn)和干草而言是全部产量。众多对于产量的代表物已经用于谷物作物内。这些代表物中的主要代表是对植物尺度的评估。根据物种和发育期，植物尺度可以以多种方式进行测量，但是包括植物总干重、地上部分干重、地上部分鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、叶丛直径、叶长度、根长度、根质量、分蘖数和叶数目。众多物种在给定发育期内维持植物不同部分之间的恒定比率。使用这些异速生长关系来从尺度的这些量值中的一种量值外推到另一种量值。发育早期内的植物尺度一般与发育晚期中的植物尺度相关。具有较广的叶面积的较大植物一般可以比较小的植物吸收更多光线和二氧化碳，并且因此将有可能在相同时间内获得更大的重量。除了微环境优势或遗传优势的有效延续以外，这是植物最初不得不实现较大尺度的原因所在。对于植物尺度和生长速率而言，存在强烈的遗传因素，并且对一系列多样的基因型而言，情况也是如此。在一种环境条件下的植物尺度有可能与另一种环境条件下的尺度相关。以这种方式，将标准环境用作为对田间作物在不同位置和不同时间上遭遇到的多样及动态性环境的代表。收获指数(种子产量与地上部分干重的比率)在众多环境条件下是相对稳定的，并且因此可以经常得到植物尺度与谷物产量之间的密切联系。这些过程本身是关联的，因为主要的谷物生物量取决于植物的叶和茎拥有的现有或储备的光合作用生产力。因此，对植物尺度的选择(甚至在发育早期)已经用来作为未来生产潜力的指示物。当测试遗传差异对胁迫耐受性的影响时，与田野相比，将土壤特性、温度、水及营养素的可获性和光密度标准化的能力是温室环境或植物生长室环境的固有优势。然而，因缺少风或昆虫引起的不良授粉或成熟根或冠的生长空间不充足而导致对产量的人为限制可能制约这些受控环境测试产量差异的用途。因此，在生长室或温室内的标准化条件下，测量发育早期内的植物尺度是提供潜在的遗传性产量优势指示的标准惯例。在生活周期中，植物通常暴露于环境含水量降低的环境。大多数植物已经进化出对这些脱水条件的自我保护策略。然而，当千旱条件过于严重并且持续时间过长，则对多数作物植物的发育、生长、植物尺度和产量的影响是严重的。持续暴露于干旱引起在植物代谢方面最终导致细胞死亡并且因此导致产量损失的重大改变。开发胁迫耐受性植物因此是有可能解决或至少促进解决这些问题中某些问题的策略。然而，开发对这类胁迫表现抗性和/或耐受性的植物新品系的常规植物育种策略*相对緩慢并且需要特定抗性品系以便与所需要的品系杂交。有限的胁迫耐受性种质资源和亲缘较远的植物物种间杂交的不兼容性是常规育种中遭遇的严重问题。此外，在耐干旱、耐寒和耐盐的模式植物内引起耐干旱性、耐寒性和耐盐性的细胞过程在本质上是复杂的，并涉及细胞多种适应机制及众多代谢途径。胁迫耐受性的这种多因素性质不仅造成对耐受性的育种基本上不成功，而且还限制利用生物技术方法从遗传上设计胁迫耐受性植物的能力。因此，需要鉴定引起生长增加和/或胁迫耐受性增加的这些多因子过程中所涉及的基因和蛋白质。阐明在胁迫耐受性植物内表达的基因的功能不仅推动我们理解植物对环境胁迫的适应及耐受，还提供用于设计作物改良新策略的重要信息。根是高等植物的重要器官。植物根系统对所有陆生植物物种的正常生长和发育是重要的。除摄取水及营养素并且提供物理支持之外，根介导土壤孩史生物与其它植物之间复杂且知之甚少的通讯交流。在农学系统中，生产受土壤内水及营养素的可获得性的影响根生长对地上器官的生长和产量具有直接或间接影响，尤其在营养限制条件下。根还与植物次级产物如防御化合物和植物激素的产生有关。建立正确的根构型对植物有效利用环境中的可用水及营养素以使植物生长及生产最大化而言有重要影响。此外，在干旱条件下，根可以适应于继续生长而与此同时产生并向茎干发送抑制地上部分植物生长的早期警告信号。此外，作物植物改良的根生长还增强与杂草植物的竟争力并将通过增加水的获得性和摄取而改善在贫瘠地带内的生长。改良的根生长还与生态目的有关，如生物修复和预防/制止土壤侵蚀。较长的根不但可以减轻来自土壤的7jc耗竭效应，还可以改善植物的固定和支持能力，因而减少倒伏。另夕卜，较长的根具有覆盖较大体积的土壤的能力并改善营养素摄取。因此,改变根的生物量并且尤其增加根长度将改善植物生长以及增加作物产量。根还是众多重要的主要作物例如甜菜(sugarbeet)、马铃薯(potato)、树薯(manioc)(木薯(cassava))、山药(yam)和甜薯(sweetpotate，batate)中的贮藏器官。根还是众多蔬菜(胡萝卜(carrot)、萝卜(radish))、草药(姜(ginger)、番红花(kukuma))和药用植物(人参(ginseng))中用于消费的相关器官。此外，存在于根内的某些植物次级产物对化学工业和制药工业有重要经济意义，例如用于合成类固醇激素的基础分子存在于山药内，并且紫草(丄/幼05/7e/7MW附的根产生因其具有抗炎特性、抗肿瘤特性和伤口愈合特性而得以广泛应用的紫草素。根构型是经典育种学中基本上仍未研究的领域，原因是在田间难以评估这种性状。因此，生物技术可以明显影响对这种性状的改良。根系统的结构因先天遗传和物理环境综合作用而产生。数个根突变体已经从模式植物鼠耳芥(」m^/o/w/5幼"/,Vwi")和对根生长及发育已积累了某些认识的数个作物物种中得以分离。在筛选具有对重力的变异应答的植物中鉴定了拟南芥(^n^iVto/w/力的flgW突变体。该突变体对植物生长激素乙烯和内源性生长素不敏感，表明AtAGRl参与生长素转运(Bell和Maher，1990，Mol.Gen.Genet.220:289-293)。五ZW、w<iv6和/;Z"2是对agr/等位的突变。在通过定位性克隆分离AtAGRl后，确定AtAGRl仅表达于根内并且是与细菌膜转运蛋白相似的植物基因家族的一个成员(Luschnig，1998，Genes&Deveplopment12:2175-2187)。还确定AtAGRl编码生长素向基性外流载体(Chen等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:15112-15117)。此外，原位(Z"-W")杂交证实AtAGRl表达于根尖的远端伸长区和中央伸长区内(Muller等，1998，TheEMBOJournal17:6903-6911)。虽然已经表征了参与植物内胁迫应答的一些基因，但是对赋予胁迫耐受性的植物基因的表征和克隆大多仍是不完整和零散的。例如，某些研究已经表明干旱胁迫和盐胁迫在一些植物内可以归咎于基因叠加效应，相反，其它研究表明特定基因在渗透胁迫条件下在植物营养组织内转录性地受到激活。虽然通常假定胁迫诱导性蛋白质在耐受性中有作用，然而直接证据依然缺乏，并且众多胁迫应答性基因的功能是未知的。因此，需要鉴定在胁迫耐受性植物内表达的额外基因，其中所述的基因具有赋予其宿主植物及其它植物物种增加的根生长和/或增加的产量和/或胁迫耐受性的能力。新产生的胁迫耐受性植物将具有众多优势，例如通过降低植物物种的水需要而增加可以栽培作物植物的范围。发明简述本发明涉及编码多肽的分离的核酸，其中与植物的野生型品种相比，所述的多肽能够调节在正常条件或胁迫条件下的#>生长和/或植物生长和/或产量和/或胁迫耐受性。尤其，本发明涉及分离的核酸的用途，其中所述的核酸编码对调节植物的根生长、产量和/或环境胁迫应答重要的膜转运蛋白样多肽(MTP)。更具体地，这些编码MTP的核酸在作物植物内的过量表达引起增加的根生长和/或正常条件或胁迫条件下增加的产量，和/或增加的环境胁迫耐受性。因此，在第一实施方案内，本发明涉及用分离的核酸所转化的转基因作物植物，其中核酸包含选自如下的多核苷酸a)多核苷酸，其具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述的序列；b)多核苷酸，其编码具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多肽；c)多核苷酸，其与具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性；d)编码多肽的多核苷酸，其中所述的多肽与具有如在表l第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多肽具有至少70%序列同一性；和e)与以上a)至d)的任意多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸。优选地，转基因作物植物表达此类分离的核酸，以至于相对于非转化的野生型植物，优选改变植物的表型。尤其与植物的野生型品种相比，转基因作物植物将表现在正常条件或胁迫条件下受到调节的根生长(优选增加的根生长)和/或植物生长和/或产量和/或胁迫耐受性。优选地，MTP来自鼠耳芥、卡i若4立油菜(canola)、大豆(soybean)、稻(rice)、向曰葵(sunflower)、大麦(barley)、小麦(wheat)、亚麻(linseed)或玉米(maize)。也就是说，本文中所述的是鼠耳芥AtAGRl基因(AtAGRl、AtAGRl-2、AtAGRl-3、AtAGRl-4和AtAGRl-5)及其在卡诺拉油菜、大豆、稻、向日葵、大麦、小麦、亚麻和玉米内的同系物。在另一个实施方案中，本发明涉及这样的转基因作物植物，其过量表达编码MTP的核酸并与植物的野生型品种相比，在正常条件或胁迫条件下表现根生长的增加并更优选地表现根长度的增加。在又一个实施方案中，与植物的野生型品种相比，编码MTP的核酸在作物植物内的过量表M现增加的环境胁迫耐受性。在又一个实施方案中，与植物的野生型品种相比，编码MTP的核酸在作物植物内的过量表达表现增加的产量。还提供环境胁迫可以是盐度胁迫、干旱胁迫、温度胁迫、金属胁迫、化学品胁迫、病原体和氧化胁迫或其组合。优选地，环境胁迫是干旱胁迫。在又一个实施方案中，本发明涉及由编码MTP的核酸所转化的转基因作物植物产生的种子，其中与植物的野生型品种相比，植物对增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性是不分离的。在又一个实施方案中，本发明涉及在农业地点内培育作物植物的方法，其中该方法包括得到前述转基因作物植物并在农业地点内培育该植物。仍在又一个方面，本发明涉及通过或从转基因作物植物、其植物部分或其种子中产生的产物，如食物、祠料、食物补充物、伺料补充物、化妆品或药物。在另一个实施方案中，本发明涉及在正常条件或胁迫条件下，与植物的野生型品种相比，增加作物植物的根生长和/或产量和/或增加对环境胁迫的胁迫耐受性的方法，其中该方法包括得到前述转基因作物植物并且在表达分离的核酸的条件下培育该植物。在又一个实施方案中，本发明涉及产生前述转基因作物植物的方法，其中该方法包括(a)用包含编码MTP的核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)从植物细胞生成表达所编码多肽的转基因作物植物。优选地，多核苷酸与一种或多种调节序列有效连接，并且与植物的野生型品种相比，该多核苷酸在植物内的表达引起在正常条件或胁迫条件下增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性。优选地，一种或多种调节序列包括启动子。更优选地，该启动子是组织特异性或发育调节性启动子。在又一个实施方案中，本发明涉及鉴定新MTP的方法，包括(a)产生如下文所述的应答于MTP的特异性抗体或其片段；(b)用抗体筛选推定的MTP物质，其中抗体对物质的特异性结合表明存在潜在的新MTP;和(c)与已知的MTP比较，从已结合的物质内鉴定新MTP。或者，与如下文所述核酸探针的杂交可以用来鉴定新MTP核酸。在又一个实施方案中，本发明还涉及调节根生长和/或产量和/或胁迫耐受性的方法，包括调节编码MTP的核酸在植物内的表达。优选地，与植物的野生型品种相比，此类修饰引起增加或减少的才艮生长和/或产量和/或胁迫耐受性。优选地，根生长和/或产量和/或胁迫耐受性因增加编码MTP的核酸在植物内的表达而得到增加。附图简述图1显示长度是1941bp的用于拟南芥转化的AtAGRl基因(SEQIDNO:l;At4g37580)的核苷酸序列。图2显示用于拟南芥转化的AtAGRl基因的647个氨基紗列(SEQIDNO:2)。图3显示用来转化AtAGRl(SEQIDNO:l)基因的双元载体T-DNA的示意图。LB，左边界；pAHAS，拟南芥AHAS启动子；3，AHAS，AHAS终止信号；SP，超级启动子；AtAGRl，AtAGRl的cDNA;3，NOS，终止信号；RB，右边界。图4A和4B显示拟南芥AtAGRl(SEQIDNO:l)转基因植物的平板分析。4A表明全部株系均显示增加的根长度表型。与野生型对照相比，林系5、7、9、10和11显示更明显的根长度增加。4B显示AtAGRl转基因植物的基因水平分析，证实AtAGRl植物表现增加的根长度表型。基于该分析，AGR1转基因植物显示根长度增加29%。在4A和4B内，附表显示用来生成柱状图的实际平均值。图5显示AtAGRl(SEQIDNO:l)植物在土壤内的根分析，其中测量了AtAGRl拟南芥林系的根长度。图6显示AtAGRl(SEQIDNO:l)转基因植物的基因水平ANOVA分析。汇总全部转基因林系的分析数据以确定全部基因的整体表现。图7显示AtAGRl(SEQIDNO:l)转基因植物内的叶丛干重的基因水平ANOVA分析。发明详述本发明可以通过参考如下对本发明的优选实施方案及本文中所包括实施例的详细描述而更容易地得到理解。然而，在公开并描述本发明化合物、组合物和方法之前，应当理解本发明不限于具体的核酸、具体的多肽、具体的细胞类型、具体的宿主细胞、具体的条件或具体的方法等，并且本文中众多的修改和变例对于本领域技术人员将是显而易见的。还应当理解本文中所用术语的目的仅在于描述具体的实施方案并且不意图是限制性的。尤其，将氨基^列命名为多肽"膜转运蛋白样多肽"(MTP)无论如何不限制这些序列的功能性。本发明涉及在增加植物的根生长和/或产量中和/或对调节植物对环境胁迫应答是重要的MTP和编码MTP的核酸。更具体地，这些编码MTP的核酸在植物内的过量表达引起调节(增加或减少，优选增加)根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性。MTP类的代表成员是从鼠耳芥中分离的AtAGRl、AtAGRl陽2、AtAGRl-3、AtAGRl-4、AtAGRl-5以及从卡诺拉油菜、大豆、向日葵、玉米、稻、亚麻和大麦中分离的全长同系物。在优选的实施方案中，该类属的全部成员是生物活性膜转运蛋白。因此，本发明包含MTP多核苷酸和多肽序列的转基因作物植物及产生此类转基因作物植物的方法，其中MTP多肽在植物内的表达引起增加的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性。在一个实施方案中，MTP序列来自植物、优选是拟南芥植物、卡诺拉油菜植物、大豆植物、稻植物、向曰葵植物、大麦才直物、亚麻植物或玉米植物。在另一个实施方案中。MTP序列是如表1内汇总的基因。优选地，已公开的MTP序列与已知的膜转运蛋白具有显著的同一性百分数。表1.MTP基因、其来源、核苷酸序列和对应氨基酸序列，以及与AtAGRl(SEQIDNO:2)在氨基酸水平上共有的同一性百分数(用于全体序列比对的Needleman-Wunsch算法，J.Mol.Biol.48(3):443-53;矩阵:Blosum62;空位开口罚分10.0;空位延伸罚分2.0)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本发明提供由编码MTP的核酸所转化的转基因作物植物，其中与植物的野生型品种相比，核^列在作物植物内的表达引起增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性。尤其，增加的根生长是增加根长度。如本文中所用的术语"植物"可以根据上下文理解为意指完整的植物、植物细胞和植物部分(包括种子)。词语"植物"还指任何植物，特别指种子植物，并且可以包括，但不限于作物植物。植物部分包括，但不限于茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等。在一个实施方案中，转基因植物是雄性不育的。还提供由编码MTP的核酸所转化的转基因植物产生的植物种子，其中种子含有编码MTP的核酸，并且其中与植物的野生型品种相比，所述植物对增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性是不分离的。本发明还提供由表达MTP的转基因植物产生的种子，其中种子含有MTP，并且其中与植物的野生型品种相比，所述植物对增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性是不分离的。本发明还提供通过或从表达编码MTP的核酸的转基因植物、其植物部分或其种子中产生的产品。产品可以使用本领域内众所周知的多种方法得到。如本文中所用的，词语"产品"包括，但不限于食物、饲料、食物补充物、饲料补充物、化妆品或药物。将食物视为用于营养目的的组合物。这些组合物还包括用于补充营养的组合物。尤其将动物饲料和动物饲料补充物视作食物。本发明还提供由转基因植物、植物部分和植物种子中任意一种所产生的农业产品。农业产品包括，但不限于植物提取物、蛋白质、氣基酸、糖类、脂肪、油、聚合物、维生素等。如本文中所用，术语"品种"指物种内的一组植物，其中所述的植物共有使它们与该物种内的典型形式及与其它可能品种相区别的稳定特征。在拥有至少一种明显性状的同时，一个品种的特征还在于品种内个体之间的某些变异，这主要基于性状在后续世代的子代之间的孟德尔分离作用所致。如果一个品种对特定性状达到遗传上如此程度的纯合以至于当不分离的品种自我授粉时，，见察不到子代之间明显量的性状独立分离，则认为此品种对该性状是"不分离的"。在本发明中，性状因导入植物品种的一种或多种DNA序列的转基因性表达而产生。将本发明的作物植物理解为包括双子叶作物植物，例如来自豆科(Leguminosae)如物种豌豆(pea)、苜蓿和大豆；伞形科(Umbelliferae)，特别是胡萝卜属(Daucus)(更特别是物种胡萝卜(carota)(胡萝卜))和芽属(Apium)(更特别是物种旱芽(graveolensvar.dulce(celery)))及其它众多物种；茄科(Solanaceae)，特别是番茄属(Lycopersicon)，更特别是物种番茄(Lycopersiconesculentum)(番荡)和痴属(Solan腿)，更特别是物种马铃薯(Solanumtuberosum)(马铃薯)和痴子(Solanummelongena)(aubergine)、烟草(tobacco)及其它众多物种；和辣椒属(Capsicum)、更特别是物种辣椒(Capsicumannum(pepper))物种及其它众多物种；豆科(Leguminosae)，特别是大豆属(Glycine)，更特别是物种大豆(Glycinemax)(大豆)及其它众多物种；和十字花科(Cruciferae),特别是芸苔属(Brassica)，更特别是物种欧洲油菜(Brassicanapus)(欧洲油菜)、芸苔(Brassicacampestris(beet))、甘蓝(BrassicaoleraceacvTastie(巻心菜))、花椰菜(BrassicaoleraceacvSnowballY(花椰菜))和花茎甘蓝(oleraceacvEmperor(broccoli));和拟南芥属，更特别是物种鼠耳芥及其它众多物种；菊科(Compositae)，特别是莴苣属(Lactuca)，更特别是物种莴苣(Lactucasativa(lettuce))及其它众多物种；和锦葵科(Malvaceae),特别是棉属(Gossypium),更特别是称作为棉花的物种；和豆科(Fabaceae)，特别是落花生属(Arachis)、更特别是物种花生(Arachishypogaea(peanut))。本发明的作物植物还包括单子叶作物植物，如例如谷物如小麦、大麦、高粱(sorghum)和黍(millet)、黑麦(rye)、黑小麦(triticale)、玉米、稻或燕麦(oat)和甘蔗(sugarcane).还优选树，如苹果树、桃树、柑桔树(quince)、李树(plum)、樱桃树(cherry)、梨树(peach)、油桃树(nectarine)、杏树(apricot)、木瓜(papaya)、芒果(mango)和其它木本物种，包括针叶树和落叶树，如杨树(poplar)、松(pine)、红杉(sequoia)、雪松(cedar)、栎树(oak)等。尤其优选鼠耳芥、烟草(Mcotianatabacum)、欧洲油菜、大豆、玉米、小麦、亚麻、马铃薯和万寿菊(tagetes)。本发明首次描述MTP用于增加作物植物的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性。如本文中所用，术语"多肽"指由肽键连接的至少4个氨基酸的链。该链可以是直链的、支链的、环状的或其组合。因此，本发明提供从如表1第2列内提供的任意生物中选择的已分离MTP及其同系物在作物植物内的用途。在优选的实施方案中，MTP选自l)如在表l第4列中提供的任意MTP多肽；和2)其同系物及直向同系物。M酸序列的同系物和直向同系物如下定义。本发明的MTP优选地通过重组DNA^支术产生。例如，将编码该多肽的核酸分子克隆至表达载体(如下文所述)，将表达载体导入宿主细胞(如下文所述)并在宿主细胞内表达MTP。MTP随后可以使用标准的多肽纯化技术，通过适宜的纯化方案从细胞中分离。为本发明的目的，术语"重组多核苷酸，，指已经通过遗传设计加以改变、重排或修饰的多核苷酸。实例包括任何已克隆的多核苷酸,和与异源序列连接或接合的多核苷酸。术语"重组的"不涉及因天然存在事件(如自发突变)所致的多核苷酸改变。作为对重组表达的替代，MTP或其肽可以使用标准的肽合成技术化学地合成。此外，天然的MTP可以从细月包(例如鼠耳芥细胞)分离，例如4吏用抗MTP抗体，其中该抗体可以利用MTP或其片段通过标准技术产生。如本文中所用，术语"环境胁迫"指与盐度胁迫、干旱胁迫、温度胁迫、金属胁迫、化学品胁迫、病原体胁迫和氧化胁迫或其组合有关的次优条件。在优选的实施方案中，环境胁迫可以选自盐度、干旱或温度中的一个或多个，或其组合，并且尤其可以选自高盐度、低水含量(干旱)或低温中的一个或多个。在更优选的实施方案，环境胁迫是干旱胁迫。还如本文中所用，术语"水利用效率"指植物所产生的有机物质的量除以植物在产生该量有机物质时所用水的量，即相对于植物的水利用量的植物干重。如本文中所用，术语"干重"指植物内除水之外的任意物质，并包括例如糖类、蛋白质、油和矿质营养素。还应当理解如在说明书和权利要求书中所用，"一，，可以意指一个或多个，取决于所使用的上下文。因此，例如，对"一种细胞"的称谓可以意指至少一种可能加以利用的细胞。还如本文中所用，术语"核酸"和"多核苷酸"指呈直链或支链的、单链或双链的RNA或DNA,或其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。这些术语还包括位于基因的编码区3'端和5'端的非翻译序列基因编码区5，端上游的至少约1000个核苷酸的序列和基因编码区3'端下游的至少约200个核苷酸的序列。较不常见的碱基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其它碱基也可以用于反义配对、dsRNA配对和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已经证实以高亲和力结合RNA并且AJ^因表达的有效反义抑制物。还可以作出其它修饰，如对磷酸二酯主链或RNA的核糖基团内2，-羟基的修饰。反义多核苷酸和核酶可以完全由核糖核苷酸组成，或可以混合含有核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸，本发明的多核苷酸可以通过任意方法产生，包括基因组制备、cDNA制备、体外(/wv^o)合成、RT-PCR和体外或体内(iwWiv)转录。"分离的"核酸分子是基本上与其它核酸分子(即编码其它多肽的序列)分开的核酸分子，其中所述的其它核酸分子存在于该核酸的天然来源内。优选地，"分离的，，核酸不含在该核酸的天然存在的复制子内天然分布于此核酸两侧的某些序列(即位于该核酸的5'端和3'端处的序列)。例如，将克隆的核酸^f见为分离的核酸。在多种实施方案种，分离的MTP核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列天然分布于细胞(例如鼠耳芥细胞)的基因组DNA内的MTP核酸分子侧翼，其中从所述的细胞内衍生分离的MTP核酸分子。如果核酸已经因人工干预受到改变，或位于不是该核酸天然位点的基因座或位置内，或当它通过农杆菌感染得以导入细胞时，则也将该核酸视为分离的核酸。此外，"分离的"核酸分子如cDNA分子，在通过重组技术产生时，可以不含与其天然地结合的某些其它细胞物质或培养基，或当化学合成时，不含化学前体或其它化学品。具体从"分离的"核酸的定义中排除作为体外核酸制备物或作为转染/转化的宿主细胞制备物而存在的天然存在的染色体(如染色体扩展物(chromosomespreads))、人工染色体文库、基因组文库和cDNA文库，其中宿主细胞是体外异质性制备物或铺板为单菌落的异质群体。还具体排除其中所述的核酸占载体分子内核酸插入物的数目小于5%的以上所述文库。进一步具体排除的是完整细胞基因组DNA制备物或完整细胞RNA制备物(包括经机械剪切或酶消化的完整细胞制备物)。更进一步具体排除的是通过电泳分离的作为体外制备物或作为异质混合物存在的完整细胞制备物，其中本发明的核酸没有在电泳介质内进一步从异源核酸中得以分离(例如通过从琼脂糖凝胶或尼龙膜印迹物中的异质性条带群体内裁下单个条带而进一步得以分离)。本发明的核酸分子(例如具有如在表l第3列中提供的任意SEQIDNO和本文中提供的序列信息加以分离。例如，MTPcDNA可以使用如表l第3列中提供的任意SEQIDNO的全部或部分从任何作物文库中分离。此外，包含如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的全部或部分的核酸分子可以使用基于这种序列所设计的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应加以分离。例如，mRNA可以从才直物细胞中分离(例如通过Chirgwin等，1979，Biochemistry18:5294-5299的异硫氰酸胍提取法)，并且cDNA可以使用逆转录酶(例如MoloneyMLV逆转录酶，可从Gibco/BRL,Bethesda，MD获得；或AMV逆转录酶,可从SeikagakuAmerica,Inc.,St.Petersburg,FL获得)制备。用于聚合酶链式反应扩增的合成性寡核苷酸引物可以基于如在表l第3列中显示的任意序列内所述的核苷酸序列进行设计。本发明的核酸分子可以根据标准PCR扩增技术，使用cDNA或备选地使用基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物进行扩增。如此扩增的核酸分子可以克隆至适宜的载体并通过DNA测序分析进行表征。此外，与编码MTP的核苷酸序列对应的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如使用自动化DNA合成仪。在一个实施方案中，本发明分离的核酸分子包含如在表l第3列中显示的任意序列内所述的核苷酸序列。这些cDNA可以包含编码MTP的序列(即"编码区")，以及5，非翻译序列和3，非翻译序列。备选地，本发明的核酸分子可以仅包含如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的编码区，或可以含有从基因组DNA中分离的完整基因组片段。本发明还包括编码如本文中所述MTP的MTP编码性核酸。优选编码如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所示MTP的MTP编码性核酸。此外，本发明的核酸分子可以包含如在表1第3列内提供的任意序列的编码区的部分，例如可以用作探针或引物的片段，或编码MTP的有生物活性部分的片段。从对如表l内所提供任意生物的MTP基因的克隆中测定的核苷酸序列允许产生这样的探针和引物，其中设计所述探针和引物旨在鉴定和/或克隆其它细胞类型及生物内的MTP同系物以及来自其它作物植物或相关物种内的MTP同系物。编码区的部分也可以编码MTP的有生物活性的片段。如本文中所用，术语MTP的"生物活性部分"意图包括MTP的如此部分(例如结构域/基序)，其中该部分参与调节植物内根生长和/或产量和/或胁迫耐受性，并且更有选地是干旱耐受性。为本发明的目的，调节根生长和/或产量和/或胁迫耐受性指与非转基因对照植物的根生长和/或产量和/或胁迫耐受性相比，包含MTP表达盒(或表达载体)的转基因植物的根生长和/或产量和/或胁迫耐受性增加或减少至少10%。用于定量根生长和/或产量和/或胁迫耐受性的方法至少在下文实施例5、6和17-19中提供。在优选的实施方案中，MTP的生物活性部分增加、优选地通过增加根长度而增加植物的根生长。MTP的生物活性部分包括包含如此M酸序列的肽，其中所述的M餅列衍生自MTP的M餅列(例如如在表1第4歹'J中提供的任意SEQIDNO的M酸序列)或与MTP完全相同的如此多肽的M酸序列，其中并显示MTP的至少一种活性。通常，生物活性部分(例如，具有例如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多个氨基酸长度的肽)包含具有MTP的至少一种活性的结构域或基序。此外，其中多肽的其它区域被缺失的有生物活性的其它部分可以通过重组技术进行制备并评估在本文中所述的一种或多种活性。优选地，MTP的生物活性部分包括一个或多个选择的结构域/基序或其具有膜转运蛋白活性的部分。在一个实施方案中，MTP的生物活性部分包含如下保守基序的至少一种。第一基序是PLYVAMILAY(SEQIDNO:123)。第二基序是INRFVAXFAVPLLSFHFI(SEQIDNO:124)，其中X选自氨基酸残基缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。第三基序是FSLSTLPNTLVMGIPLL(SEQIDNO:125)。在另一个实施方案中，第一基序存在于多肽的M酸位置16与25之间的位置内，第二基序存在于多肽的氨基酸位置42与59之间的位置内并且第三基序存在于多肽的氩基酸位置105与121之间的位置内。本发明还提供MTP嵌合多肽或融合多肽。如本文中所用，MTP"嵌合多肽"或"融合多肽"包含有效地与非MTP连接的MTP。MTP指具有与MTP对应的氨基酸序列的多肽，而非MTP指具有与如此氨基酸序列对应的多肽，其中所述的^J^,列基本上与MTP不相同，例如与MTP不同并衍生自相同生物或不同生物的多肽。就融合多肽而言，术语"有效连接的"意图说曰/预期功能。非MTP可以融合至MTP的絲末端或g末端。例如，在一个实施方案中，融合多肽是其中MTP序列融合至GST序列羧基末端的GST-MTP融合多肽。此类融合多肽可以促进重组MTP的纯化。在另一个实施方案中，融合多肽是在其氨基末端含有异源信号序列的MTP。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，MTP的表达和/或分泌可以通过使用异源信号序列得以增加。优选地，本发明的MTP嵌合多肽或融合多肽通过标准重组DNA技术产生。例如，编码不同多肽序列的DNA片段按照常规技术以符合可读框方式得到连接，例如通过使用平末端或交错末端以便连接、限制性酶消化以便提供适宜末端、根据需要补平粘末端、碱性磷酸酶处理以避免不想要的接合以及酶连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪。备选地，基因片段的PCR扩增可以使用锚式引物实施，锚式引物在两个连续基因片段间产生互补性突出端，突出端随后可以复性并再扩增以生成嵌合基因序列(见例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,编者Ausubel等JohnWiley&Sons:1992)。此外，可商业地获得已经编码融合部分(例如，GST多肽)的众多表达载体。编码MTP的核酸可以克隆到此种表达载体内以至于融合部分以符合可读框方式与MTP连接。除本文中所述的MTP的片段和融合多肽之外，本发明包括植物中天然存在的MTP及MTP编码性核酸的同系物和类似物。"同系物，，在本文中定义为分别具有相似或"相同，，的核苷酸序列或M酸序列的两种核酸或多肽。同系物包括如本文以下定义的MTP的等位基因变体、直向同系物、旁向同系物、激动剂和拮抗物。术语"同系物"还包含这样的核酸分子(及其部分)，其因遗传密码子的简并性而不同于如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述的核苷*列并且因此编码与由如在表1第3歹'J内提供的SEQIDNO内描述的对应核苷酸序列所编码的MTP相同的MTP。如本文中所用，"天然存在的"MTP指在自然界中存在的MTP氨基酸序列。优选地，天然存在的MTP包含如在表1第4列内提供的任意SEQIDNO的氨基酸序列。MTP的激动剂可以保留基本上相同或部分的MTP生物活性。MTP的拮抗物可以抑制天然存在形式的MTP的一种或多种活性。与MTPcDNA的天然等位基因变体和类似物、直向同系物和旁向同系物相对应的核酸分子可以基于它们与本文中所述的MTP核酸的同一性，使用MTPcDNA或其部分作为杂交探针,根据标准杂交技术在严格杂交条件下分离。在替代性的实施方案中，MTP的同系物可以通过对MTP的突变体(例如截短突变体)组合文库篩选MTP激动剂活性或拮抗物活性得以鉴定。在一个实施方案中，MTP变体的混杂文库通过在核酸水平上的组合性诱变作用而产生并且由混杂的基因文库编码。可以如此产生MTP变体的混杂文库，例如，将合成性寡核苦酸的混合物用酶连接成基因序列，以至于一组简并的有效MTP序列可表达为单个多肽或备选地，表达为含有本文中MTP序列组的一组较大融合多肽(例如用于噬菌体展示)。存在可以用来从简并性寡核苷酸序列中产生有效MTP同系物文库的多种方法。简并性基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪上开展，并且随后将合成性基因连接到适宜的表达载体内。使用一套简并性基因允许在一种混合物内提供编码所需的有效MTP序列组的全部序列。用于合成简并性寡核苷酸的方法是本领域内已知的。此外，MTP编码区的片段文库可以用来产生MTP片段的混杂群体以篩选并随后选择MTP的同系物。在一个实施方案中，编码性序列片段的文库可以如此产生，即通过用核酸酶在每分子仅发生一次切割的条件下处理编码MTP的序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使此DNA复性以形成可以包括来自不同已切割产物中的有义/反义配对的双链DNA，通过用SI核酸酶处理而除去来自再形成的双螺旋内的单链部分，并且将得到的片段文库连接到表达载体内。通过该方法，可以衍生编码MTP多种大小的氨基末端片段、羧基末端片段和内部片段的表达文库。性文库内的基因产物和用于对cDNA文库筛选具有所选择特性的基因产物。此类技术适应于快速篩选通过MTP同系物的组合性诱变所产生的基因文库。最广泛用来筛选大型基因文库的对高通量分析可操作的技术通常包括将基因文库克隆至复制型表达载体内、用得到的载体文库转化适宜的细胞并在如此条件下表达组合性基因，其中在该条件下所需活性的检测有助于分离编码了基因(基因产物被检观，J)的载体。递归总体诱变(REM)(—种提高文库内功能性突变体的频率的技术)可以与篩选鉴定法组合使用以鉴定MTP同系物(Arkin和Yourvan，1992，PNAS89:7811-7815;Delgrave等，1993,PolypeptideEngineering6(3):327-331)。在另一个实施方案中，可以利用基于细胞的鉴定法来使用本领域内众所周知的方法分析混杂的MTP文库。本发明还提供鉴定新MTP的方法，包括(a)产生如下文所述的应答于MTP的特异性抗体或其片段；(b)用抗体筛选推定的MTP物质，其中抗体对物质的特异性结合表明存在潜在的新MTP;和(c)与已知MTP比较，分析已结合的物质以确定其新颖性。如上所述，本发明涉及MTP及其同系物。为确定两种M酸序列(例如如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列及其突变形式)的序列同一性百分数，将序列为优化比较目的进行比对(例如，可以为与另一种多肽或核酸优化比对的目的而向一种多肽的序列内导入空位)。随后比较在对应氨基酸位置上的氨基酸残基。当在一个序列(如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列)内的位置作为另一个序列(例如，如在表l第4列中提供的对应SEQIDNO的突变形式的序列)内的相应位置由相同的氛基酸残基占据时，则两个分子在该位置上是相同的。相同类型的比较可以在两种核酸序列之间进行。两种序列间的序列同一性百分数是序列所共有的相同位置数的函数(即序列同一性百分数=相同位置数/总位置数xl00)。优选地，本发明内所包含的分离的M酸同系物与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所示的整个M酸序列具有至少约50-60%、优选至少约60-70%并且更优选至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%以及最优选至少约96%、97%、98%、99%或更高同一性。在另一个实施方案中，本发明内所包含的分离的氨基酸同系物与通过如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内显示的核酸序列所编码的整个氨基酸序列具有至少约50-60%、优选至少约60-70%并且更优选至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%以及最优选至少约96%、97%、98%、99%或更高同一性。在一个实施方案中，分离的M酸同系物包含如下三种保守基序中的至少一种基序。第一基序是PLYVAMILAY(SEQIDNO:123)。第二基序是INRFVAXFAVPLLSFHFI(SEQIDNO:124),其中X选自氨基酸残基缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。第三基序是FSLSTLPNTLVMGIPLL(SEQIDNO:125)。在另一个实施方案中，第一基序存在于多肽的M酸位置16与25之间的位置内，第二基序存在于多肽的氨基酸位置42与59之间的位置内并且第三基序存在于多肽的氨基酸位置105与121之间的位置内。在另一个优选的实施方案中，本发明分离的核酸同系物包含这样的核苷酸序列，其中该核苷酸序列与如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所示的核苷酸序列或与其包含至少60个连续核香酸的部分具有至少约40-60%、优选至少约60-70%、更优选至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-卯％或卯-95%并且甚至更优选至少约95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性。对核酸而言，序列比较的优选长度是至少75个核苷酸，更优选至少100个核苷酸并且最优选是全长的编码区。更优选核酸同系物编码与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO具有同源性的蛋白质。还优选本发明分离的核酸同系物编码这样的MTP或其部分，其与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的M酸序列具有至少约80%同一性，并且作为植物内根生长和/或产量和/或环境胁迫应答的调节物发挥作用。在更优选的实施方案中，核酸同系物在植物内的过量表达增加根生长和/或产量和/或植物对环境胁迫的耐受性。在又一个优选的实施方案中，核酸同系物编码作为膜转运蛋白发挥作用的MTP。为本发明的目的，两种核酸序列或两种多肽序列之间的序列同一性百分数使用在欧洲分子生物学开放软件包(EuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(EMBOSS))内执行的Needleman-Wunsch全体比对算法(J.Mol.Biol.48(3):443-53)确定。为了多重比对目的(ClustalW算法)，空位开口罚分是10并且空位延伸罚分是0.05，具有blosum62矩阵。将理解的是为确定序列同一性的目的，当DNA序列与RNA序列比较时，胸腺嘧啶核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。在另一个方面，本发明提供分离的核酸，该核酸包含与如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。更具体地，本发明分离的核酸分子是至少15个核苷酸长度并与包含如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的核苷酸序列的核酸分子在严格条件下杂交。在其它实施方案中，核酸是至少30、50、100、250个或更多个核苷酸长度。优选地，本发明分离的核酸同系物包含这样的核苷,列，该核苷酸序列与如在表l第3列中提供的任意SEQIDNO内所示的核苷^列在高严格性条件下杂交并且作为植物内根生长和/或产量和/或胁迫耐受性的调节物发挥作用。在又一个优选实施方案中，分离的核酸同系物在植物内的过量表达增加植物的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性。在甚至更优选的实施方案中，分离的核酸同系物编码作为膜转运蛋白发挥作用的MTP。如本文中就DNA与DNA印迹的杂交方面所用，术语"严格条件"指在60。C在10XDenhart's溶液、6xSSC、0.5。/。SDS和100fig/ml变性鲑精DNA内杂交过夜。印迹物在62。C每次30分钟依次在3xSSC/0.1。/。SDS、随后在lxSSC/0.10/。SDS并且最后在0.1xSSC/0.1%SDS内洗涤。在优选的实施方案中，短语"严格条件"指在65°C在6xSSC溶液内杂交。还如本文中所用，"高严格性条件，，指在65。C在10xDenhart，s溶液、6xSSC、0.5%SDS和100fig/ml变性鲑精DNA内杂交过夜。印迹物在65°C每次30分钟依次在3xSSC/0.1%SDS、随后在lxSSC/0.1%SDS,并且最后在O.lxSSC/0.1%SDS内洗涤。用于核酸杂交的方法在Mdnkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284;CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章,编者Ausubel等，GreenePublishingandWiley-lnterscience,NewYork,1995;和Tijssen,1993，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology:HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第2章,Elsevier,NewYork,1993内描述。优选地，与如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列在严格性条件或高严格性条件下杂交的本发明分离的核酸分子与天然存在的核酸分子对应。如本文中所用，"天然存在的"核酸分子指具有在自然界中存在的核苷酸序列(例如编码天然多肽)的RNA分子或DNA分子。在一个实施方案中，核酸编码天然存在的MTP。使用以上所述的方法和本领域技术人员已知的其它方法，本领域内普通技术人员可以分离包含如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所示的氨基^列的MTP同系物。这些同系物的一个亚类是等位基因变体。如本文中所用，术语"等位基因变体"指含有在MTP氨基酸序列内造成改变并于天然群体(例如植物物种或品种)内存在的多态性的核苷酸序列。此类天然的等位基因变异一般可以在MTP核酸内引起1-5%差异。等位基因变体可以通过对多种不同植物内的目的核#列测序进行鉴定，其中所述的测序可以通过使用在这些植物内鉴定相同MTP遗传基因座的杂交探针而容易地实施。MTP内作为天然等位基因变异结果并且不改变MTP的功能性活性的任何及全部的这类核酸变异以及所产生的氨基酸多态性或变异将意图处于本发明的范围。此外，编码来自相同物种或其它物种的MTP的核酸分子，如MTP类似物、直向同系物和旁向同系物将意图处于本发明的范围内。如本文中所用，术语"类似物"指具有相同或相似的功能而在不相关的生物内独立进化的两种核酸。如本文中所用，术语"直向同系物"指来自不同物种，但通过物种形成从共同先祖基因中进化的两种核酸。通常，直向同系物编码具有相同功能或相似功能的蛋白质。还如本文中所用，术语"旁向同系物，，指因在基因组因内重复作用而相关的两种核酸。旁向同系物通常具有不同的功能，不过这些功能可以是相关的(Tatusov，R丄.等，1997，Science278(5338):631-637)。天然存在的MTP的类似物、直向同系物和旁向同系物可以因翻译后修饰、因氨基i^f列差异或因这两种情况而不同于天然存在的MTP。翻译后修饰包括多肽在体内和体外的化学衍生作用，如乙酰化作用、羧化作用、磷酸化作用和糖基化作用，并且此类修饰可以在多肽合成及加工期间或在使用分离的修饰酶处理后发生。尤其，本发明的直向同系物通常对天然存在的MTP氨基酸序列的全部或部分表现至少80-85%、更优选85-90%或90-95%并且最优选95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性，或100%序列同一性，并且表现与MTP相似的功能。优选地，本发明的MTP直向同系物作为植物内根生长和/或环境胁迫应答的调节物发挥作用和/或作为膜转运蛋白发挥作用。更优选地，本发明的MTP直向同系物增加植物内的根生长和/或胁迫耐受性。在一个实施方案种，MTP直向同系物作为膜转运蛋白发挥作用。此外，除可能存在于群体内的MTP序列的天然存在变体之外，技术人员还认识到可以通过在如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的核苷^列内突变而导入变化，因而在所编码的MTP的氨基酸序列内引起变化，而不改变MTP的功能性活性。例如，可以在如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列内开展在"非必需"氨基酸残基处引起氨基酸置换的核苷酸置换。"非必需"氨基酸残基是可以从一种MTP的野生型序列中加以变更而不改变所述MTP的活性的残基，而"必需"氨基酸残基对MTP的活性是必需的。然而，其它M酸残基(例如在具有MTP活性的结构域内是非保守的或仅是半保守的那些氨基酸残基)可能对活性不是是必需的，并且因此有可能可进行操作改变，而不改变MTP活性。因此，本发明的另一个方面涉及编码在对MTP活性不是必需的氨基酸残基内含有变化的MTP的核酸分子。此类MTP在M酸序列上与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所含有的序列不同，然而仍保留本文中所述MTP活性中的至少一种活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码多肽的核苷^列，其中该多肽包含与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少约50-60%、更优选地与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少约60-70%、甚至更优选地与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少约70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或卯-95%并且最优选地与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的序列至少约96%、97%、98%或99。/。的^J^酸序列。本发明的优选MTP同系物优选地参与植物内植物的根生长和/或产量和/或胁迫耐受性应答，或更具体地作为膜转运蛋白发挥作用。可以如此产生编码与如在表1第4列中所提供任意SEQIDNO的多肽序列具有序列同一性的MTP的分离核酸分子，即通过分别将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失导入如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的核苷酸序列，以至于将一个或多个氩基酸置换、添加或缺失导入所编码的表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列。优选地，在一个或多个预测为非必需的氨基酸残基处开展保守性氨基酸置换。"保守性氨基酸置换"是其中将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有卩分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此将MTP中预测的非必需氨基酸残基优选地替换为来自相同侧链家族的另一种基酸残基。备选地，在另一个实施方案中，突变可以沿着全部或部分的MTP编码序列随机导入，例如通过饱和诱变，并且可以对得到的突变体筛选如本文中所述的MTP活性以鉴定保留MTP活性的突变体。对如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的序列诱变后，编码的多肽可以进行重组性表达，并且多肽的活性可以如至少在实施例5、6和17-19内所述通过分析表达多肽的植物的根生长和/或产量和/或胁迫耐受性得以测定。此外，可以产生优化的MTP核酸。优选地，优化的MTP核酸编码当在植物内过量表达时调节植物的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性，并且更优选增加植物的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性的MTP。如本文中所用，"优化的，，指经基因工程化以增加在给定植物或给定动物内的表达的核酸。为向植物提供优化的MTP核酸，该基因的DNA序列可以被修饰以l)包含由高度表达的植物基因所偏好的密码子；2)在核苷酸碱基组成上包含与植物内大量存在A+T含量相等的A+T含量；3)形成植物起始序列；或以4)消除这样的序列，其中所述序列导致RNA不稳定化、不适宜地聚腺苷酸化、降解和终止，或形成次级发夹结构或RNA剪接点。MTP核酸在植物内增加的表达可以通过利用在常见植物或在特定植物内的密码子使用分布频率而实现。用于优化植物内核酸表达的方法可以在EPA0359472;EPA0385962;PCT申请号WO91/16432;美国专利号5,380,831;美国专利号5,436,391;Perlack等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328和Murray等，1989，NucleicAcidsRes.17:477-498内找到。如本文中所用，"优选的密码子使用频率"指由特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以指示给定氨基酸方面所表现出的偏好性。为测定特定密码子在基因内的使用频率，将该密码子在基因内的出现次数除以基因内指示相同氨基酸的全部密码子的总出现次数。类似地，由该宿主细胞所表现的优选的密码子使用频率可以通过将在宿主细胞所表达的多种基因内的优选密码子使用频率平均化而计算。优选该分析应当限于宿主细胞高度表达的基因。用于合成性基因的优选密码子使用频率距离宿主细胞所用的优选密码子使用频率的偏离百分数首先通过确定单个密码子使用频率距离宿主细胞的单个密码子使用频率的偏离百分数进行计算，随后得到在全部密码子范围内的平均偏离。如本文中定义，该计算包括独特密码子(即ATG和TGG)。通常而言，使用等式lA=n=lZxn-Ynxn乘以100Z而计算优化基因的密码子使用频率距离宿主细胞的密码子使用频率的整体平均偏离，其中Xn=对于宿主细胞内密码子n的使用频率；Yn^成性基因内对密码子n的使用频率；n代表指示氨基酸的单个密码子；并且密码子的总次数是Z。对全部氨基酸而言，密码子使用频率的整体偏离A优选地应当小于约25%并且更优选小于约10%。因此，MTP核酸可以受到优化以至它的密码子分布频率偏离于高度表达的植物基因的密码子分布频率优选地不超过25%，并且更优选地不超过约10%。此外，考虑了简并性第三减基的G+C百分含量(单子叶植物基因似乎在该位置上偏好G+C,而双子叶植物基因则不是这样)。还认识到XCG(其中X是A、T、C或G)核苷酸是双子叶植物中偏好性最低的密码子，而XTA密码子在单子叶植物和双子叶植物中均应当避免。本发明优化的MTP核酸还优选地具有这样的CG及TA双联体避开指数(avoidanceindex),其中所述的CG及TA双联体避开指数与所选择宿主植物(例如鼠耳芥、稻等)的CG及TA双联体避开指数非常接近。更优选地，这些指数偏离于宿主指数不超过约10-15%。此外，除以上所述的编码MTP的核酸分子之外，本发明的另一方面涉及对所述核酸分子为反义的分离的核酸分子。据信反义多核苷酸通过特异性地结合多核苷酸靶并且干扰该多核苷酸靼的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性而抑制此多核苷酸靼的基因表达。在现有
技术领域：
内描述了用于佳Jl义多核苷酸靶向至染色体DNA、至初级RNA转录物或至已加工的mRNA的方法。优选地，靼区域包括剪接位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子和可读框内的其它序列。为本发明的目的，术语"反义"指这样的核酸，其中该核酸包含充分地与基因、初级转录物或已加工mRNA的全部或部分互补以至干扰内源性基因表达的多核苷酸。"互补性"多核苷酸是能够根据Watson-Crick互补原则发生碱基配对的那些多核苷酸。具体而言，噤呤将与嘧咬碱基配对，以形啶配对(A:T)的组合，或在RNA的例子内腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。应当理解两种多核苷酸可以相互杂交，即便它们彼此不是完全互补，只要每种多核苷酸具有基本上与另一种多核苷酸互补的至少一个区域即可。术语"反义核酸"包括可以被转录以产生反义RNA的单链RNA表达盒和双链DNA表达盒。"活性"反义核酸是能够选择性地与编码如此多肽的初级转录物或mRNA杂交的反义RNA分子，其中所述多肽与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽具有至少80%序列同一性。反义核酸可以与完整的MTP编码链互补或仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子对编码MTP的核苷酸序列的编码链的"编码区"M义的。术语"编码区"指核苷酸序列中包含翻译成氨基酸残基的密码子的区域。在另一个实施方案中，反义核酸分子对编码MTP的核苷酸序列的编码链的"非编码区"是反义的。术语"非编码区"指分布在编码区侧翼的未翻译成氨基酸的5'序列和3'序列(即也称作5'非翻译区和3'非翻译区)。反义核酸分子可以与MTPmRNA的整个编码区互补，不过更优选地是仅对MTPmRNA内编码区或非编码区的部分为反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与MTPmRNA的翻译起点周围的区域互补。反义寡核苷酸可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长度。通常，本发明的反义分子包含这样的RNA，其中所述的RNA与如表l第3列中提供的任意SEQIDNO的至少14个连续核苷酸或编码如表1第4列内所提供任意SEQIDNO的多肽的多核苷酸具有60-100%序列同一性。优选地，序列同一性是至少70%,更优选是至少75%、80%、85%、90%、95%、98%并且最优选是99%。本发明的反义核酸可以使用本领域已知的方法，利用化学合成和酶连接反应加以构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸进行化学地合成，其中设计修饰的核苷酸旨在增加分子的生物学稳定性或旨在增加反义核酸与有义核酸间所形成双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖咬取代的核苷酸。可用来产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧-定、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧咬、5-羧曱基氨曱基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨曱基尿嘧啶、二氬尿嗜咬、卩-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺噤呤、1-甲基鸟噪呤、1-甲基次黄嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-曱基腺嘌呤、2-甲基鸟噤呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-曱基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、p-D-mannosylqueosine、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧咬、2-甲硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嗜啶、2-硫代尿嘧咬、4-硫代尿嗜咬、5-甲基尿嘧啶、尿嗜咬-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-]\-2-羧丙基)尿嘧咬、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。备选地，反义核酸可以使用表达载体以生物方式产生，其中核酸已经以反义方向亚克隆至所述的载体内(即从所插入核酸中转录的RNA与目的靶核酸处在反义方向上，在如下部分中进一步描述)。在又一个实施方案。本发明的反义核酸分子是a-异头核酸分子。a-异头核酸分子与互补性RNA形成特异的双链杂交体，在所述的互补性RNA中与常见的p亚基相反，链彼此呈反平行分布(Gaultier等，1987，NeuleicAcids.Res.15:6625-6641)。反义核酸分子也可以包含2，-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，NucleicacidsRes.15:6131画6148)或嵌合性RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBSLett.215:327-330)。本发明的反义核酸分子通常施用至细胞或在原位(/"'似)产生，以至它们与编码MTP的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合以便因而抑制MTP多肽的表达(例如通过抑制转录和/或翻译)。杂交可以因形成稳定双链体的核苷酸常规互补性，或例如在与DNA双链体结合的反义核酸分子例子中通过在双螺旋大沟内的特异性相互作用而发生。反义分子可以受到修饰以至它特异性地与已表达于所选细胞表面上的受体或抗原结合，例如通过将反义核酸分子连接到与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体上。反义核酸分子也可以使用本文中所述的载体被送递至细胞内。为实现反义分子的足够细胞内浓度，优选其中反义核酸分子受原核生物强启动子、病毒强启动子或真核生物(包括植物)强启动子控制的载体。作为反义多核苷酸的替代，核酶、有义多核苷酸或双链RNA(dsRNA)可以用来减少MTP多肽的表达。如本文中所用，术语"核酶"意指基于催化性RNA的具有核糖核酸酶活性的能够切割单链核酸(如mRNA)的酶，其中所述的单链核酸与核酶具有互补性区域。核酶(例如在Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334:585-591内所述的锤头核酶)可以用来催化性地切割MTPmRNA转录物以便因此抑制MTPmRNA的翻译。对编码MTP的核酸具有专一性的核酶可以基于如本文中所公开的MTPcDNA的核苷酸序歹'J(即如表1第3列中提供的任意SEQIDNO)或基于根据本发明中所教授的方法而待分离的异源序列加以设计。例如，可以构建四膜虫(7Wm^v附ewfl)L-19IVSRNA的衍生物，其中活性部位的核苷酸序列与编码MTP的mRNA内待切割的核苷酸序列是互补的。例如见授予Cech等的美国专利号4,987,071和5,116,742。备选地，MTPmRNA可以用来从RNA分子库内选择具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。见例如Bartel，D.和Szostak,J.W.,1993，Science261:1411-1418。在优选的实施方案中，核酶将含有具有至少7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸并且更优选是7或8个核苷酸的如此部分，其中该部分对靶RNA的部分具有100%互补性。用于产生核酶的方法是本领域技术人员已知的。例如见美国专利号6,025,167;5,773,260和5,496,698。如本文中所用的术语"dsRNA"指包含两条RNA链的RNA杂交体。dsRNA可以在结构上是直链的或环状的。在优选的实施方案中，dsRNA对这样的多核苷酸是特异性的，其中此多核苷酸编码如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽或编码与如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽具有至少80%序列同一性的多肽。杂交性RNA可以是基本上互补或完全互补的。"基本上互补，，意指当两种杂交性RNA使用如上所述的BLAST程序进行优化比对时，杂交部分至少95%互补。优选地，dsRNA是至少100个碱基对长度。通常，杂交性RNA具有相同长度，没有突出的5'端或3'端和空位。然而，在本发明方法中可以使用具有多达100个核苷酸的5'突出端或3'突出端的dsRNA。dsRNA可以包含核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物如2'-0-甲基核糖基残基或其组合。例如，见美国专利号4,130,641和4,024,222。在美国专利4,283,393中描述了dsRNA聚核糖次黄苷酸:聚核糖胞苷酸。用于产生并使用dsRNA的方法是本领域内已知的。一种方法包括在体内或在单个体外反应混合物内同时转录两条互补性DNA链。例如，见美国专利号5,795,715。在一个实施方案中，dsRNA可以通过标准转化技术直接导入植物或植物细胞内。或者，dsRNA可以通过转录两种互补性RNA在植物细胞内表达。用于抑制内源性基因表达的其它方法，如三重螺旋形成法(Moser等，1987，Science238:645-650和Cooney等，1988，Science241:456-459)和共抑制法(Napoli等，19卯，ThePlantCell2:279-289)是本领域内已知的。部分长度和全长度cDNA已经用于内源性植物基因的共抑制。例如，见美国专利号4,801,340、5,034,323、5,231,020和5,283,184;VanderKroll等，1990,ThePlantCell2:291-299;Smith等，1990,Mol.Gen.Genetics224:477-481和Napoli等，19卯，ThePlantCell2:279-289。对于有义抑制，据信有义多核苷酸的导入阻断相应单巴基因的转录。有义多核苷酸具有与植物靼基因或靶RNA至少65%的序列同一性。优选地，同一性百分数是至少80%、卯％、95%或更高。导入的有义多核苷酸不需要相对靼基因或转录物而言是全长的。优选地，有义多核苷酸与如表l第3列中提供的任意SEQIDNO的至少100个连续核苷酸具有至少65%序列同一性。同一性区域可以包含内含子和/或外显子和非翻译区，导入的有义多核苷酸可以短暂地存在于植物细胞内，或可以稳定地整合至植物染色体或染色体外复制子内。备选地，MTP基因表达可以通过耙向与MTP核苷酸序列的调节区(例如MTP启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，以形成阻止靶细胞内MTP基因转录的三重螺旋结构而受到抑制。通常，见Helene,C，1991，AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene，C.等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36和Maher，LJ"1992，Bioassays14(12):807-15。此夕卜，除以上所述的MTP核酸和多肽之夕卜，本发明包含与部分(moiety)连接的那些核酸和多肽。这些部分包括，但不限于检测部分、杂交部分、纯化部分、送递部分、反应部分、结合部分等。具有连接的部分的常见核酸类型是探针和引物。探针和引物通常包含基本上分离的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列区域，其中所述的核苷酸序列区域与如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的有义链的至少约12个、优选约25个、更优选约40、50或75个连续核苷酸；与如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的反义序列；或其天然存在的突变体在严格条件下杂交。以如表1第3列中提供的任意SEQIDNO的核苷酸序列为基础的引物可以用在克隆MTP同系物的PCR反应内。基于MTP或基因组序列。在优选的实施方案中，探针还包含与该探针连接的标记基团，例如标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。此类探针可以作为基因组标记检测试剂盒的部分，用于细胞样品内鉴定表达MTP的细胞，如通过测量编码MTP的核酸的水平，例如检测MTPmRNA水平或确定基因组MTP基因是否已经被突变或缺失。尤其，旨在确定基因转录水平(可用于翻译成基因产物的mRNA量的指示)的有用方法是开展RNA印迹(参考文献见例如，Ausubel等，1988,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)。来自RNA印迹的信息至少部分地展示已转化基因转录的程度。细胞总RNA可以通过本领域内均众所周知的数种方法，如在Bormann,E.R.等，1992Mol.Microbiol.6:317-326中描述的方法，从细胞、组织或器官中制备。为评估从这种mRNA中所翻译蛋白质的存在或相对量，可以使用标准技术，如蛋白质印迹。这些技术是本领域内普通技术人员众所周知的(例如见Ausubel等,1988CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley:NewYork)。本发明还提供包含MTP核酸的分离的重组表达载体，其中与宿主细胞的野生型品种相比，该载体在宿主细胞内的表达导致增加的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性。如本文中所用，术语"载体"指这样的核酸分子，其中该核酸分子能够转运已经与其连接的另一种核酸分子。一种类型的载体是"质粒"，指额外的DNA节段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒栽体，其中额外的DNA节段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在导入载体的宿主细胞内自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体性哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体性哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组内，并且因此随宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导与载体有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为"表达载体"。通常，在DNA重组技术中使用的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，"质粒"和"栽体"可互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。然而，本发明意图包含具有等效功能的其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。本发明的重组表达载体包含处在适合于核酸在宿主细胞内表达的形式下的本发明核酸，这意指重组表达载体包括基于待用来表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节序列，其中所述的调节序列与待表达的核酸序列有效连接。如本文中就重组表达载体而言所用，"有效地连接"意图表明目的核苷酸序列以(例如在体外转录/翻译系统内或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞内)允许核苷酸序列表达的方式与调节序列连接。术语"调节序列"意图包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。此类调节序歹'J例如在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)以及Gruber和Crosby在MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,编者Glick和Thompson,第7章，89-108,CRCPress:BocaRaton,Florida(包括其中参考文献)内描述。调节序列包括指导核苷酸序列在众多类型宿主细胞内的组成型表达的那些调节序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞内或在某些条件下表达的那些调节序列。本领域技术人员将理解表达载体的设计取决于此类因素，如选择待转化的细胞、所需要多肽的表达水平等。本发明的表达载体可以导入宿主细胞，以便因而产生通过如本文中所述核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或融合肽(例如MTP、MTP的突变形式、融合多肽等)。本发明的重组表达载体可以设计用于在原核细胞或真核细胞内表达MTP。例如，MTP基因可以在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或其它真菌细胞(Romanos,M.A.等,1992,Foreigngeneexpressioninyeast:areview,Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M.J.J.等，1991，Heterologousgeneexpressioninfilamentousfungi在MoreGeneManipulationsinFungi,编者J.W.Bennet和L丄.Lasure，第396-428页AcademicPress:SanDiego以及vandenHondel，C.A,M.J.J.和Punt,P.J.，1991，GeneTransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi在AppliedMolecularGeneticsofFungi,编者Peberdy，J.F.等，第1-28，CambridgeUniversityPress:Cambridge)、藻类(Falciatore等，1999，MarineBiotechnology1(3):239-251)、如下类型的纤毛虫全毛亚纲(Holotrichia)、缘毛亚纲(Peritrichia)、旋毛亚纲(Spirotrichia)、吸管亚纲(Suctoria)、四膜虫、草履虫属(Paramecium)、豆形虫属(Colpidium)、瞬目虫属(Glaucoma)、匙口虫属(Platyophrya)、Potomacus、伪康纤虫属(Pseudocohnilembus)、游仆虫属(Euplotes)、Engelmaniella、尾棘虫属(Stylonychia)，其中尤其用载体按照如PCT申请号WO98/01572中所述的转化方法在浮萍棘尾虫(Stylonychialemnae)内，以及在多细胞植物的细胞(见Schmidt,R.和Willmitzer，L.,1988，Highefficiency々/Y^a"m.w附mediatedtransformationofJ/Yi嵐o/wis幼a/Z"waleafandcotyledonexplants，PlantCellRep.583-586;PlantMolecularBiologyandBiotechnology,CPress,BocaRaton,Florida，第6/7章，S.71-119(1993);F.F.White,B,Jenes等，TechniquesforGeneTransfer，在TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,编者Kung和R.Wu，128-43，AcademicPress:1993;Potrykus,1991，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42:205-225及其中引用的参考文献)或哺乳动物细胞内表达。合适的宿主细胞在Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(19卯)内进一步讨论。备选地，重組表达载体可以在体外被转录并翻译，例如使用T7-启动子调节序列和T7聚合酶。在原核生物中多肽的表达最经常用含有指导融合多肽或非融合多肽表达的组成型启动子或诱导型启动子的载体实施。融合载体将多个氨基酸添加至编码于该载体内的多肽中，通常添加至重组多肽的氨基末端，也可添加至其M末端，或融合于多肽中的合适区域内。此类融合载体通常达到三种目的l)旨在增加重组多肽的表达；2)旨在增加重组多肽的可溶性并且3)旨在通过起到亲和纯化中的配体作用而辅助重组多肽的纯化。经常在融合表达载体中将蛋白酶剪切位点导入至融合部分与重组多肽的接合处，以便在融合多肽的纯化后，能够使重组多肽与融合部分分开。此类酶以及它们的天然识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。常见的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.，1988，Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A与靶重组多肽融合。在一个实施方案中，将MTP的编码序列克隆至pGEX表达载体以产生编码融合多肽的载体，其中所述的融合多肽从氨基末端至羧基末端包含GST-凝血酶切割位点-X多肽。融合多肽可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析法纯化。不与GST融合的重组MTP可以通过用凝血酶切割融合多肽而加以回收。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例是pTrc[Amann等，(1988)Gene69:301-315]和pETlld(Studier等，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(1990)60-89)。来自pTrc载体的靼基因表达依赖于从杂合trp-lac融合启动子内的宿主RNA聚合酶转录。来自pETlld载体的耙基因表达依赖于通过共表达的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导，从T7gnl0-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶由宿主菌林BL21(DE3)或HMS174(DE3)从定居原噬菌体中提供，其中所述的定居原噬菌体携带在lacUV5启动子的转录性控制下的T7gnl基因。一种旨在使重组多肽表达最大化的策略是4吏多肽在如此的宿主细菌内表达，其中该宿主细菌的蛋白水解性切割重组多肽的能力受损(Gottesman，S.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(19卯)119-128)。另一种策略是改变待插入表达栽体内的核酸序列以至用于每个氩基酸的单个密码子均是在选择用来表达的细菌如谷氨酸棒状杆菌内得以偏好性利用的那些密码子(Wada等，1992,NucleicacidsRes.20:2111-2118)。本发明核酸序列的这种改变可以通过标准DNA合成技术实施。在另一个实施方案中，MTP表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.ce"v/wV^)内表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EmboJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(SchuItz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego，CA)。用于构建适用于其它真菌(如丝状真菌)内的载体和方法包括在vandenHondel，C.A.M.J.J.和Punt,P.J.(1991)"GeneTransfersystemandvectordevelopmentforfilamentousfungi，，在AppliedMolecularGeneticsofFungi,编者J.F.Peberdy等，第1-28页，CambridgeUniversityPress:Cambridge内详述的那些载体和方法。在本发明优选的实施方案中，MTP在植物和植物细胞如单细胞植物的细胞(例如藻类)(见Fakiatore等,1999,MarineBiotechnology1(3):239-251及其中参考文献)和来自高等植物的植物细胞(例如种子植物，如作物植物)内表达。MTP可以通过任何方法"导入，，植物细胞内，其中所述的方法包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染法等。本领域技术人员所知的一种转化方法是将正在开花的植物浸入农杆菌溶液，其中农杆菌含有MTP核酸，随后对转化的配子育种。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的其它合适方法可以在Sambrook,等，MolecularCloning:ALaboratoryManual.第二版,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989和其它实验手册如MethodsinMolecularBiology,1995，Gartland和Davey编辑的第44巻，々尸o6a"m.M附Protocols,HumanaPress,Totowa，NewJersey中找到。由于增力口的生长和/或生物性胁迫耐受性及非生物性胁迫耐受性是希望被遗传到多种植物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉花、欧洲油菜和卡诺拉油菜、木薯(manihot)、辣椒(pepper)、向日葵和万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子(eggplant)和番茄(tomato)、野豌豆属(Vicia)物种、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡(coffee)、可可(cacao)、茶(tea))、柳属(Salix)物种、树(油棕榈(oilpalm)、椰子(coconut))、多年生禾草和伺料作物内的常见性状，因此这些作物植物也是作为本发明又一个实施方案的优选用于遗传工程的靶植物。饲料作物包括但不限于小麦草(Wheat-grass)、篛草(Canarygrass)、雀麦草(Bromegrass)、披碱草(WildryeGrass)、早熟禾(Bluegrass)、鸭茅(Orchardgrass)、苜蓿、Salfoin、百脉根(BirdsfootTrefoil)、杂三叶(Alsikeclover)、红三叶(redclover)和草木樨(Sweetclover)。在本发明的一个实施方案中，MTP至植物内的转染通过农杆菌介导性基因转移得以实现。农杆菌介导性植物转化可以使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204:383画396)或LBA4404(Clontech)才艮瘤农杆菌(^4gn^flf"n7iiw似附e/"de朋)菌林。转化可以通过标准的转化及再生技术开展(Deblaere等，1994，Nucl.Acids.Res.13:4777-4788;Gelvin,StantonB.和Schilperoort，RobertA,PlantMolecularBiologyManual,第二版-Dordrecht:KluwerAcademicPubl"1995.—在部分RingbucZentraleSignatur:BT11-PISBN0-7923-2731-4;Glick,BernardR.;Thompson,JohnE.，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,BocaRaton:CRCPress,1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)。例如，欧洲油菜可以通过子叶或下胚轴转化法进行转化(Moloney等，1989，PlantcellReport8:238-242;DeBlock等，1989，PlantPhysiol.91:694-701)。用于农杆菌和植物选择的抗生素取决于用于转化的二元载体和农杆菌。欧洲油菜的选择通常使用卡那霉素作为可选择的植物标志而开展。农杆菌介导至亚麻(flax)内的基因转移可以使用例如由Mlynarova等，1994，PlantCellReport13:282-285描述的技术开展。此外，大豆的转化可以使用如欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中所述的技术实施。玉米的转化可以通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或通过碳化珪纤维法技术(见，例如Freeling和Walbot"Themaizehandbook"SpringerVerlag:NewYork(1993)ISBN3-540-97826-7)完成。玉米转化的具体实例存在于美国专利号5,990,387内，并且小麦转化的具体实例可以在PCT申请号WO93/07256内找到。根据本发明，导入的MTP如果并入非染色体性自主复制子内或整合至植物染色体内，则可以在植物细胞内得以稳定维持。或者，导入的MTP可以存在于染色体外的非复制型载体内并且可以得到瞬时表达或具有瞬时活性。在一个实施方案中，可以产生其中MTP整合至染色体内的同源重组微生物，制备了含有MTP基因的至少部分的载体，其中向所述的部分中已经导入缺失、添加或置换以便因而改变(例如功能性地破坏)MTP基因。优选地，MTP基因是如表1内所提供的任意MTP基因，但是它可以是来自相关植物或酵母的同系物，或甚至是来自哺乳动物或昆虫来源的同系物。在一个实施方案中，设计了载体以至在同源重组时，内源性MTP基因被功能性地破坏(即不再编码功能性多肽；也称作敲除载体)。或者，可以设计载体以至于在同源重组时，内源性MTP基因受到突变或改变，但仍编码功能性多肽(如上游调节区可以受到改变，因而改变内源性MTP的表达)。为了通过同源重组产生点突变，可以在称作嵌合修复法的技术中使用DNA誦RNA杂交体(Cole-Strauss等,1999，NucleicacidsResearch27(5):1323-1330和Kmiec，1999GenetherapyAmericanScientist.87(3):240-247)。例如，在鼠耳芥内的同源重组方法是本领域内众所周知的并且考虑用于本文中。当位于同源重组载体内时，MTP基因中改变的部分在其5'端和3'端侧翼分布有MTP基因的额外核酸分子，以允许同源重组在孩支生物或植物内在载体所携带的外源性MTP基因与内源性MTP基因之间发生。这种侧翼分布的额外MTP核酸分子具有足够用于与内源性基因发生同源重组的长度。一般，栽体内包括(在5'端和3'端的)数百碱基对至多到数千碱基的侧翼DNA(见例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.，1987，Cell51:503对同源重组载体的描述)。载体导入微生物细胞或植物细胞(例如通过聚乙二醇介导的DNA)，并且使用本领域已知技术选择其中导入的MTP基因已经与内源性MTP基因发生同源重组的细胞。在另一个实施方案中，可以产生这样的重组微生物，其中该重组微生物含有允许受调节地表达导入基因的系统。例如，在将MTP基因置于lac达。此类调节系统是本领域内众所周知的。无论是在染色体外的非复制型载体内或在整合至染色体内的载体中存在，MTP多核苷酸优选地位于植物表达盒内。植物表达盒优选地含有能够驱动植物细胞内的基因表达的调节序列，其中所述的调节序列是有效连接的，以至于每一序列可以实现它的功能，如通过聚腺苷酸化信号终止转录。优选的聚腺苷酸化信号是源自根瘤农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5中作为章鱼碱合酶的基因3(Gielen等，1984，EMBOJ.3:835)中那些聚腺苷酸化信号或其功能等效物，在植物内有功能性活性的全部其它终止子也是适合的。由于植物基因表达很少受限于转录水平，因而植物表达盒优选地包含其它有效连接的序列，如翻译增强子，如含有来自烟草花叶病毒5，非翻译前导序列的增强RNA与多肽比率的过量驱动序列(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。植物表达载体的实例包括那些在Becker,D.，Kemper，E。,Schell,J.和Masterson,R.1992，Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder,PlantMol.Biol.20:1195-1197和Bevan，M.W.，1984，BinaryXgro6acteW"附vectorsforplanttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721;VectorsforGeneTransferinHigherPlants在TransgenicPlants,第一巻,EngineeringandUtilization,编者Kung和R.Wu，AcademicPress,1993,S.15-38中详述的植物表达载体。植物基因表达应当有效地与以时间、细胞或组织特异性方式引^因表达的适宜启动子连接。用于本发明表达盒内的启动子包括能够在植物细胞内启动转录的任意启动子。此类启动子包括，但不限于可以从植物、植物病毒或含有在植物内表达的基因的细菌(如农杆菌和根瘤菌(及/^M/"m))中获得的那些启动子。启动子可以是组成型、诱导型、发育期优选性、细胞类型优选性、组织优选性、或器官优选性启动子。组成型启动子在大部分条件下是活跃的。组成型启动子的实例包括CaMV19S和35S启动子(Oddl等，1985，Nature313:810-812)、sXCaMV35S启动子(Kay等，1987，Science236:1299-1302)、Sepl启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等，1990，PlantCell2:163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、遍在蛋白启动子(Christensen等，1989，PlantMolec.Biol.18:675-689)、pEmu(Last等，1991，Theor.Appl.Genet.81:581-588)、玄参(figwort)花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等，1984，EMBOJ3:2723-2730)、超级启动子(美国专利号5,955,646)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)、来自农杆菌T-DNA内如甘露氨酸合酶、胭脂碱合酶和章鱼碱合酶的启动子、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子等。诱导型启动子在某些环境条件下(如营养素或代谢物的存在或缺乏、热或寒冷、光、病原体侵袭、厌氧条件等)偏好性地具有活性。例如，来自芸苔属hsp80启动子受热休克诱导；PPDK启动子受光诱导；来自烟草、拟南芥和玉米的PR-1启动子受病原体感染诱导；并且Adhl启动子受低氧胁迫和寒冷胁迫诱导。植物基因表达也可以通过诱导型启动子促进(综述，见Gatz，1997,Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。当需要基因表达以时间特异性方式出现时，化学诱导型启动子尤其适合。此类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(PCT申请号WO95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等，1992，PlantJ.2:397-404)和乙醇诱导型启动子(PCT申请号WO93/21334)。在本发明的一个优选实施方案中，诱导型启动子A^迫诱导型启动子。为本发明的目的，胁迫诱导型启动子在如下的一种或多种胁迫下偏好性地有活性与盐度胁迫、干旱胁迫、温度胁迫、金属胁迫、化学品胁迫、病原体胁迫和氧化胁迫有关的次优条件。胁迫诱导型启动子包括，但不限Cor78(Chak等，2000，Planta210:875-883;Hovath等，1993，PlantPhysiol.103:1047-1053)、Corl5a(Artus等，1996，PNAS93(23):13404-09)、Rci2A(Medina等，2001，PlantPhysiol.125:1655-66;Nylander等，2001，PlantMol.Biol.45:341-52;Navarre和Goffeau，2000,EMBOJ.19:2515-24;Capel等，1997，PlantPhysiol.115:569-76)、Rd22(Xiong等，2001，PlantCell13:2063-83;Abe等，1997，PlantCell9:1859-68;Iwasaki等，1995，Mol.Gen.Genet.247:391-8)、cDet6(Lang和Palve,1992，PlantMol.Biol.20:951-62)、ADH1(Hoeren等，1998，Genetics149:479-90)、KATl(Nakamura等，1995，PlantPhysiol.109:371-4)、KSTl(Mtiller誦R6ber等，1995，EMBO14:2409-16)、Rhal(Terryn等，1993，PlantCell5:1761-9;Terryn等，1992，FEBSLett.299(3):287-卯)、ARSK1(Atkinson等，1997，GenBank登录号L22302和PCT申请号WO97/20057)、PtxA(Plesch等，GenBank登录号X67427)、SbHRGP3(Ahn等，1996，PlantCell8:1477-卯)、GH3(Liu等，1994，PlantCell6:645-57)、病原体诱导型PRP1基因启动子(Ward等，1993，Plant.Mol.Biol.22:361-366)、来自番痴的热诱导型hsp80启动子(美国专利号5187267)、来自马铃薯的寒冷诱导型a-淀粉酶启动子(PCT申请号WO96/12814)或伤口诱导型pinll启动子(欧洲专利号375091)。对于干旱诱导型启动子、寒冷诱导型启动子和盐诱导型启动子的其它实例如RD29A启动子，见Yamaguchi-Shinozalei等，1993，Mol.Gen.Genet.236:331-340。发育期优选启动子偏好性地在某些发育期内表达。组织优选启动子和器官优选启动子包括偏好性在某些组织或器官如叶、根、种子或木质部内表达的那些启动子。组织优选性启动子和器官优选性启动子的实例包括，但不限于果实优选性启动子、胚珠优选性启动子、雄性组织优选性启动子、种子优选性启动子、珠被优选性启动子、块茎优选性启动子、柄优选性启动子、果皮优选性和叶优选性启动子、柱头优选性启动子、花粉优选性启动子、花药优选性启动子、花瓣优选性启动子、萼片优选性启动子、花梗优选性启动子、长角果优选性启动子、茎优选性启动子、根优选性启动子等。种子优选性启动子偏好性地在种子发育或萌发期间表达。例如，种子优选性启动子可以是胚优选性启动子、胚乳优选性启动子和种皮优选性启动子。见Thompson等，1989,BioEssays10:108。种子优选性启动子的实例包括，但不限于纤维素合酶(ceIA)、Ciml、，玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米19kD玉米醇溶蛋白(cZ19Bl)等。其它合适的组织优选启动子或器官优选启动子包括来自欧洲油菜的油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆(Viciafaba)的USP启动子(Baeumlein等，1991，Mol.Gen.Genet.225(3):459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(PCT申请号WO98/45461)、菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白启动子(美国专利号5，504，200)、来自芸苔属的Bce4启动子(PCT申请号WO91/13980)或豆科植物B4启动子(LeB4;Baeumlein等，1992，PlantJournal，2(2):233-9)以及在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等内赋予种子特异性表达的启动子。待提到的合适启动子是来自大麦的lpt2或lptl基因启动子(PCT申请号WO95/15389和PCT申请号WO95/23230)或在PCT申请号WO99/16890内描述的那些启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麦的棵麦醇溶蛋白基因内的启动子)。用于本发明表达盒内的其它启动子包括，但不限于主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、p-伴大豆球蛋白启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、^玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、Shrunkenl、Shrunken2和bronze启动子、Zml3启动子(美国专利号5,086,169)、玉米多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5，545，546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)以及合成性启动子或其它的天然启动子。植物内控制异源性基因表达的额外灵活性可以通过使用来自异质来源的DNA结合结构域和应答元件(即来自非植物来源的DNA结合结构域)而得到。此种异源性DNA结合结构域的实例是LexADNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell43:729-736)。本发明还提供包含本发明的MTPDNA分子的重组表达载体，其中所述的MTPDNA分子以反义方向克隆至该表达载体内。也就是说，该DNA分子以如此方式与调节序列有效连接，其中所述的方式允许(通过DNA分子的转录)对MTPmRNA为反义的RNA分子表达。可以选择与在反义方向上克隆的核酸分子有效连接的指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达的调节序列。例如，可以选择指导反义RNA组成型表达、组织特异性表达或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子或调节序列。反义表达载体可以是其中在高效调节区域控制下产生反义核酸的重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式。调节区域的活性可以通过向其中导入载体的细胞类型加以测定。对于使用反义基因调节基因表达的讨论，见Weintraub，H.等，1986，AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,Reviews画TrendsinGenetics,第一巻(l)和Mol等，19卯,FEBSLetters268:427-430。本发明的另一方面涉及向其中已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语"宿主细胞"和"重组的宿主细胞"在本文中可交换使用。应当理解此类术语不仅指特定的主题细胞，它们还适用于此类细胞的子代或有活力的子代。因为某些修饰可以在后续世代内因突变或环境影响而出现，故此类子代实际上可能与亲代细胞不完全相同，但是仍包含在如本文中所用的术语的范围内。宿主细胞可以是任何的原核细胞或真核细胞。例如，MTP可以在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌、酵母、大肠杆菌、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其它微生物如谷氨酸棒状杆菌内表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。本发明的宿主细胞如培养的原核宿主细胞或真核宿主细胞可以用来产生(即表达)MTP。因此，本发明还提供用于使用本发明的宿主细胞产生MTP的方法。在一个实施方案中，此方法包括在合适培养基内培养本发明的宿主细胞(已经向其中导入编码MTP的重组表达载体或其中基因组内已经导入编码野生型MTP或变异MTP的基因)直至产生MTP。在另一个实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离MTP。本发明的另一方面涉及分离的MTP及其生物活性部分。"分离的"或"纯化的"多肽或其生物活性部分在通过重组DNA技术产生时，基本不含某些细胞性材料，或通过化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学品。语词"基本上不含细胞性材料"包括这样的MTP制品，在该MTP制品中多肽与从其中天然或重组地产生该多肽的细胞的某些细胞成分是分开的。在一个实施方案中，语词"基本不含细胞材料"包括这样的MTP制品，该MTP制品具有小于约30%(千重)的非MTP材料(本文中也称作"杂质多肽，，)、更优选地小于约20%的非MTP材料、仍更优选地小于约10%的非MTP材料并且最优选地小于约5%的非MTP材料。本文中所述的核酸分子、多肽、多肽同系物、融合多肽、引物、载体和宿主细胞可以用在一种或多种如下方法中鉴定如表1第2列内所提供的任意生物及相关生物；与如表1第2列内所提供任意生物相关的生物的基因组作图；鉴定和定位如表1第2列内所提供的任意生物的目的序列；演化研究；确定功能所需要的MTP区域；调节MTP活性；调节一种或多种细胞功能的代谢；调节一种或多种化合物的跨膜转运；调节胁迫抗性以及调节MTP核酸的表达。在这些方法的一个实施方案中，MTP作为膜转运蛋白发挥作用。本发明的MTP核酸分子具有多种用途。最重要的是本发明的核酸和M酸序列可以用来转化植物，特别是作物植物，因而导入对胁迫如干旱、高盐度和寒冷的耐受性。本发明因此提供由MTP核酸转化的转基因植物，其中与植物的野生类型品种相比，核酸序列在植物内的表达引起增加的根生长和/或环境胁迫耐受性。转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物。本发明还提供转基因植物可以例如选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、高粱、黍、甘蔗、大豆、花生、棉花、欧洲油菜、卡诺拉油菜、木薯、辣椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属植物、油棕榈、椰子、多年生禾草和饲料作物。尤其，本发明描述使用编码MTP的核酸的表达以改造具有增加的根生长和/或增加的产量或耐干旱、耐盐和/或耐寒冷的植物。这种策略已经使用AtAGRl(SEQIDNO:l)在鼠耳芥和玉米内得到证实，但是该策略的应用不限于该种基因或这些植物。因此，本发明提供含有如在表1第4列内提供的任意SEQIDNO内定义的MTP的转基因作物植物，其中植物具有增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性，其中所述的环境胁迫选自干旱、增加的盐、减少或增加的温度中的一种或多种。在优选的实施方案中，环境胁迫是干旱，在其它的优选实施方案中，增加的根生长是根长度的增加，优选地是在水限制性条件下根长度的增加。本发明还提供产生含有编码MTP的核酸的转基因植物的方法，其中与植物的野生类型品种相比，核酸在植物内的表达导致增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性，所述方法包括(a)将包含MTP核酸的表达载体导入植物细胞，并(b)从该植物细胞中产生这样的转基因植物，其与植物的野生类型品种相比，具有增加的才艮生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性。植物细胞包括，但不限于原生质体、产生配子的细胞以及再生成完整植物的细胞。如本文中所用，术语"转基因的，，指含有至少一种重组多核苷酸的全部或部分的任意植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在很多情况下，重组多核苷酸的全部或部分稳定地整合到染色体内或整合到稳定的染色体外元件内，以至于将它传递到后续世代内。在优选的实施方案中，MTP核酸编码包含如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO的多肽的蛋白质。本发明还提供调节植物的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性的方法，包括调节编码MTP的核酸在植物内的表达。植物的根生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性可以如所实现的那样，分别通过增加或减少MTP的表达而增加或减少。优选地，；f艮生长和/或产量和/或环境胁迫耐受性因增加MTP的表达而增加。MTP的表达可以通过本领域^支术人员已知的任何方法进行调节。可以使用增加MTP表达的方法，其中植物是转基因植物或非转基因植物。在当植物是转基因植物时的情况下，植物例如可以用载体进行转化，其中所述的载体含有任意如上所述的编码MTP的核酸，或植物可以用启动子进行转化，其中所述的启动子指导天然MTP在植物内的表达。本发明提供此种启动子可以是组织优选性启动子、发育调节性启动子、胁迫诱导性启动子或其组合。或者，非转基因植物可以具有通过诱导天然启动子进行调节的天然MTP表达。如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所定义的MTP在靶植物内的表达可以通过，但不限于如下实例之一得以实现(a)组成型启动子、(b)胁迫诱导型启动子、(c)化学诱导型启动子和(d)工程化启动子过量表达，例如用例如锌指衍生性转录因子(Greisman和Pabo，1997，Science275:657)。在优选的实施方案中，MTP的转录使用如Greisman和Pabo，1997，Science275:657内所述并由SangamoBiosciences,Inc.制造的锌指矛汙生't生转录因子(ZFP)进行调节。这些ZFP包含DNA识别结构域和引起单巴核酸如MTP核酸激活或阻遏的功能性结构域。因此，可以产生这样的激活性ZFP及阻遏性ZFP,其中所述的ZFP特异性地识别以上所述的MTP启动子并且用来增加或减少植物内的MTP表达，因而调节植物的产量和/或胁迫耐受性。本发明还包括鉴定靼植物内如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所定义的编码MTP的核酸的同系物，以及此同系物的启动子。本发明还提供与宿主细胞的野生型品种相比，增加目的基因在宿主细胞内表达的方法，其中目的基因应答于MTP而被转录，所述方法包括(a)以包含编码MTP的核酸的表达载体转化宿主细胞，(b)在宿主细胞内表达MTP，因而与宿主细胞的野生型品种相比，增加应答于MTP而转录的基因的表达。除导入MTP核^列至转基因植物内之外，这些序列还可以用来鉴定生物，如表l第2列内提供的任意生物，或其近亲。此外，这些序列可以用来鉴定如表l第2列内提供的任意生物或其亲属在生物混合群体内的存在。本发明涉及来自如表1第2列内提供的任意生物中的众多基因的核酸序列；通过以如此探针在严格条件下探测单一生物群体或混合生物群体的培养物的提取的基因组DNA，可以确定该种生物是否存在，其中所述的探针覆盖对表l的相应生物而言为独特的特定基因的区域。此外，本发明的核酸分子和多肽分子可以充当对基因组特定区域的标记。这不仅用于基因组作图，而且也用于此基因组所编码的多肽的功能性研究中。例如为鉴定基因组内与特定生物的DNA结合性多肽结合的区域，生物的基因組被消化，并且将片段与这种DNA结合性多肽温育。结合该外地检测。这种核酸分子对基因组片段的结合能够使该片段定位于此种生物的基因组图内，并且当用不同酶多次实施时，有助于迅速确定结合该多肽的核酸序列。此外，本发明的核酸分子可以与相关物种的序列充分相同，以至于这些核酸分子可以充当标记用于在相关植物内构建基因组图。本发明的MTP核酸分子还用于进化研究和多肽结构研究。其中涉及本发明分子的膜转运过程可以由类型广泛的原核细胞和真核细胞利用；通序列，可以评估生物的进化相关性。类似地，此种比较允许评估序列的哪些区域保守和哪些区域不保守，这可能有助于确定多肽内对酶功能是必需的那些区域。这种类型的确定对于多肽工程研究是极有价值的，并且可以提供多肽可以耐受何种诱变而不丧失功能的线索。操作本发明的MTP核酸分子可以导致产生具有不同于野生型MTP的功能性差异的MTP。这些多肽可以在效率或活性方面得到改良，可以在细胞中以高于细胞内通常具有的量存在，或可以在效率或活性方面降低。存在借此对本发明MTP的改变可以直接影响根生长和/或产量和/或胁迫应答和/或胁迫耐受性的众多机制。在表达MTP如AGR1的植物的例子中，AGR1除了在根伸长区的皮层细胞和表皮细胞中作为生长素外流载体蛋白发挥作用之外，还在其它细胞内作为生长素外流载体蛋白发挥作用，因而尤其改善根内的生长素运输效率，引起根长度的增加和植物改善的水利用效率。植物、谷氨酸棒状杆菌、真菌、藻类或纤毛虫内的遗传修饰对根生长和/或胁迫耐受性的影响可以通过在劣于适宜的环境下培育改良的微生物或植物并随后分析植物的生长特征和/或代谢而进行评估。此类分析技术是本领域技术人员众所周知的，并包括干重、湿重、多肽合成、糖类合成、脂类合成、蒸发蒸腾速率、总体植物和/或作物产量、开花、繁殖、结种、根生长、呼吸速率、光合作用速率等(ApplicationsofHPLCinBiochemistryin:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,第17巻；Rehm等，1993Biotechnology,第3巻，第三章Productrecoveryandpurification,第469-714页，VCH:Weinheim;Belter,P.A.等，1988，Bioseparations:downstreamprocessingforbiotechnology,JohnWileyandSons;Kennedy,J.F.和Cabral，J.M.S.，1992，Recoveryprocessesforbiologicalmaterials,JohnWileyandSons;Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.,1988,Biochemsicalseparations,在Ulmann'sEncyclopediaofIndustrialChemistry中，第B3巻，第11章，第1-27页，VCH:Weinheim;和Dechow，F.J.,1989，Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology,NoyesPublications)。例如，包含本文中公开的核酸或其片段的酵母表达载体可以加以构建并使用标准方案转化至酿酒酵母内。得到的转基因细胞随后可以就丧失或改变其增加的生长及对干旱胁迫、盐胁迫和温度胁迫增加的耐受性进行分析。类似地，包含本文中公开的核酸或其片段的植物表达载体可以加以构建并使用标准方案转化至适宜的植物细胞，如拟南芥、大豆、油菜、玉米、小麦、蒺藜苜蓿等。得到的转基因细胞和/或衍生自其中的植物随后可以就丧失或改变其增加的生长及对干旱胁迫、盐胁迫和温度胁迫增加的耐受性进行分析。此外，本文中公开的序列或其片段可以用来在多种生物如细菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞的基因组内产生敲除突变(Girke，T.，1998，ThePlantJournal15:39-48)。得到的敲除细胞随后可以就其耐受多种胁迫条件的能力或潜能、它们对多种胁迫条件的应答以及突变对表型和/或基因型的影响进行评估。用于基因失活的其它方法，见美国专利号6,004,804"Non國ChimericMutationalVectors"和Puttaraju等，1999，Spliceosome-mediatedRNAtrans-splicingasatoolforgenetherapy,NatureBiotechnology17:246-252。前述对于MTP所提及增加的根生长和/或产量和/或胁迫耐受性的诱变策略不意图是限制性的；本领域技术人员将容易地明白这些策略的变例。利用此类策略并包括本文中所公开的机制，本发明的核酸和多肽分子可以用来产生表达突变的MTP核酸和多肽分子的藻类、纤毛虫、植物、真菌或其它微生物如谷氨酸棒状杆菌，以至于根生长和/或胁迫耐受性得到改善。本发明还提供与如本文中描述的核酸所编码的MTP或其部分特异性结合的抗体。抗体可以通过众多众所周知的方法(见例如Harlow和Lane,"Antibodies;ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork，(1988))产生。简而言之，纯化的抗原可以以足够激发免疫应答的量及间隔期注射至动物。可以直接纯化抗体，或可以从动物中获得脾脏细胞。该细胞随后可以与永生细胞系融合并对抗体分泌进行筛选。抗体可用来筛选核酸克隆文库以获得分泌抗原的细胞。那些阳性克隆随后可以进行测序(见例如，Kelly等，1992，Bio/Technology10:163-167;Bebbington等，1992，Bio/Technology10:169-175)。短语与多肽的"选择性结合"和"特异性结合"指在多肽的异质群体和其它生物内决定该多肽存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，与特定多肽结合的指定抗体不以明显的量与存在于样品内的其它多肽结合。抗体在如此条件下的选择性结合可能需要因其对特定多肽的特异性而被选择的抗体。多种免疫测定模式可以用来选择与特定多肽选择性结合的抗体。例如固相ELISA免疫测定常规地用来选择与多肽发生选择性免疫反应的抗体。见Harlow和Lane,"Antibodies,ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborPublications,NewYork，(1988)对可以用来确定选择性结合的免疫测定模式和条件的描述。在某些情况下，需要制备来自多种宿主的单克隆抗体。对制备此类单克隆抗体的技术的描述可以在Stites等编辑，"Basic和ClinicalImmunology，"(LangeMedicalPublications,LosAltos,Calif"第五版和及其中引用的参考文献)及在Harlow和Lane,"Antibodies,ALaboratoryManual,，，ColdSpringHarborPublications,NewYork，(1988)中找到。在本申请通篇范围内，参考了多种公开文献。所有这些公开文献和这些公开文献内所引用的参考文献的公开内容完整地在本文中通过参考引用至本申请内，旨在充分描述本发明所涉及的当前技术水平。还应当理解前述内容涉及本发明的优选实施方案并且可以在其中作出多种改变和变化而不脱离本发明的范围。本发明通过如下实施例得以进一步说明，这些实施例无论如何不得解释为限制本发明的范围。相反，应当清楚地理解在阅读本文中的描述后，其它多种实施方案、修改及其等效物对本领域技术人员可以是显而易见的，而不脱离本发明精神和/或后续权利要求书的范围。实施例实施例1从植物材料中分离总DNA用于总DNA分离的细节涉及lg鲜重的植物材料。所用的材料包括如下緩沖液CTAB緩冲液2%(w/v)N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化铵(CTAB);lOOmMTrisHClpH8.0;1.4MNaCl;20mMEDTA;N-月桂基肌氨酸緩冲液10%(w/v)N-月桂基肌氨酸；lOOmMTrisHClpH8.0和20mMEDTA。将植物材料在液氮下在研钵内研碎以产生精细粉末并转移到2mlEppendorf容器内。冻结的植物材料随后用一层lml分解緩冲液(lmlCTAB緩沖液、100^1的N-月桂基肌氨酸緩冲液、20jil卩-巯基乙醇和lOjil的10mg/ml蛋白酶K溶液)覆盖并在60。C温育1小时，连续振摇。将获得的匀浆分配至2只Eppendorf容器(2ml)内并通过与等体积氯仿/异戊醇(M:l)一起振摇而提取两次。对于相分离，在每一情况下在8000xg并在室温实施离心15分钟。DNA随后使用冰冷的异丙醇在-70'C淀析30分钟。淀析的DNA在4。C和10，000xg沉淀30分钟并重悬于180jil的TE緩冲液内(Sambrook等，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ISBN0-87969-309-6)。为进一步纯化，DNA用NaCl(1.2M终浓度)处理并使用2倍体积无水乙醇在-70。C再次淀析30分钟。在用70%乙醇的洗涤步骤后，将DNA干燥并随后溶解于50nl的H20+RNA酶(50mg/ml终浓度)内。DNA在4。C溶解过夜并且随后在37°C实施RNA酶消化1小时。DNA在4°C贮藏。实施例2从拟南芥植物材料中分离总RNA和cDNAAtAGRl使用RNA微量分离试剂盒(Qiagenkit),按照制造商推荐，通过从拟南芥叶中制备RNA而得以分离。如下文所述实施cDNA的逆转录反应和扩增。1.在10jilDNA酶反应物内使用2nl的RNA(0,5-2.0ng)制备物，将管转移到37°C持续15分钟，添加lpl25mMEDTA并随后将反应物加热至65。C持续15分钟。a.緩冲液(10X:200mMTris，500mMKCl，20mMMgCl2)—ljilb.RNA-2plc.DNA酶(10U/nl)-lnld.H20-6pl2.在室温反应中使用1^1上述的反应物，并加热至65°C持续5分钟。a.DNA酶消化的RNA(0.025-0.1fig，取决于初始量)-lnlb.lOmMdNTP-lplc.引物(10jiM)-lnld.H20-直至lOjil3.在单独的管内用这些试剂制备反应混合物a.SuperscriptIIRT緩冲液(10X)-2jdb.25mMMgCl2—4jilc.DTT(0.1M)-2fild.无RNA酶的RNA酶抑制剂(40U/fil)-lnl4.添加9jil反应混合物至变性的RNA溶液，并在42°C维持2分钟。5.添加1nlSuperScriptIIRT(50U/jil)，并在42。C温育50分钟。6.在70°C终止反应15分钟。7.任选添加ljilRNA酶H至反应物内以除去RNA。8.根据需要使用1-2fil新鲜cDNA开展PCR。收获组织、分离RNA和构建cDNA文库在多种条件和处理下培育作物植物，并且在多种发育期中收获不同的组织。植物生长和收获以策略性方式进行，以至使在至少一个或多个产生的文库内收获全部的可表达基因的可能性最大化。如上所述从收集的每种样品中分离mRNA并构建cDNA文库。在文库产生过程中不使用扩增步骤，旨在使样品内基因的冗余度最小化并保留表达信息。全部文库从在寡聚dT柱上纯化的mRNA中以3，方式生成。随机从转化至大肠杆菌的cDNA文库内杏lL取菌落并将菌落置于孩i量滴定平板内。cDNA插入物的PCR扩增和点样PCR扩增来自微量滴定平板内每个克隆的cDNA插入物。质粒DNA分离自大肠杆菌菌落并随后点样于尼龙膜上。在样品点样至尼龙膜之前，无需纯化步骤。实施例3AtAGRl的克隆使用如实施例2中描述的分离的cDNA以通过RT-PCR克隆AtAGRl基因。使用如下引物正向引物是5，國GGGGTCGACCAAAATGATCACCGGCAAAGAC-3，(SEQIDNO:126)。反向引物是5，-GGGTTAATTAACTTAAAGCCCCAAAAGAACGTA画3'(SEQIDNO:127)。用于扩增的PCR反应包括1xPCR緩沖液、0.2mMdNTP、100ng鼠耳芥DNA、25pmo1反向引物、2.5单位Pfu或HerculaseDNAPCR根据标准条件并根据制造商手册(Sambrook等，1989，Molecularcloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，BiometraT3Thermocycler)开展。用于反应的参数是在94。C上3分钟，l个循环；随后是在94°C上30秒、在55°C上30秒和在72°C上1.5分钟，25个循环。将扩增的片段随后用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中提取出来并按照制造商说明，连接至TOPOpCR2.1载体(Invitrogen)。重组载体使用标准条件((Sambrook等1989.Molecularcloning,ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY))转化至Topl0细胞(Invitrogen)。转化的细胞在含有100ftg/ml羧千西林、0.8mgX-gal(5-溴-4-氯-3-P引咮基-P-D-半乳糖苷)和0.8mgIPTG(异丙基琉代-p-D-半乳糖苷)的LB琼脂上在37。C过夜培育加以选择。选择白色菌落并用来接种含有100jig/ml氨千青霉素的3ml液体LB并在37。C过夜培育。使用QIApr印Spin微量制备试剂盒(Qiagen)按照制造商说明书提取质粒DNA。根据标准分子生物学技术开展对后续克隆的分析以及限制性酶作图(Sambrook等，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。对克隆测序，证实已克隆基因的身份与提交至鼠耳芥数据库内的序列(SEQIDNO:l)相同。推导的AtAGRl氨基酸序列示于SEQIDNO:2。AtAGRl基因随后克隆至双元载体并在超级启动子(Supperpromoter)控制下表达(图3)。超级启动子是组成型的，然而是根偏好性的(美国专利号5,428,147和5，217，卯3)。实施例4拟南芥植物转化转基因鼠耳芥(Col)植物通过浸入浸润法(Bechtold等，1993，"InplantaAgrobacterium-mediatedgenetransferbyinfiltrationofadultArabidopsisthalianaplants,"C.R.Acad.Sci.ParisLifeSci.316:1194-1199)产生。双元载体使用电穿孔法转化至农杆菌菌林C58C1或pMP卯内。培育转化的农杆菌培养物，并将细菌重悬于浸入浸润法培养基(1/2MS、5%蔗糖、0.5mg/mlMES，pH5.7并含有添加的200ppmSilwetL-77(LehleSeeds))。使用每种培养物以通过将花盆浸入重悬的农杆菌培养物内各5分钟而转化3钵大约5周龄的ColO拟南芥植物。植物随后在标准拟南芥条件(23。C白昼/20。C夜晚，18小时白昼和65%湿度)下培育至结种子。在平板上使用100nMPursuit(BASF)篩选T1种子。筛选转化的植物Tl种子根据标准方法(Xiong等，1999，PlantMolecularBiologyReporter17:159-170)消毒。种子在含有0.6%琼脂并以1%蔗糖和2fig/ml苯菌灵(Sigma画Aldrich)补充的1/4Murashige和Skoog培养基(MS)(Sigma-Aldrich)上选择。种子在平板上在4°C观察4日。使种子在人工气候室内在空气温度22。C和光密度40micromols-1"12(白色光；PhilipsTL65W/25荧光灯管)以及16小时光照和8小时黑暗的日长度周期下萌发。转化的幼苗在14日后进行选择并转移至补充0.6%琼脂、1%蔗糖的%MS培养基上并且允许恢复5日至7曰。T2世代的种子用于在土壤内和在体外的植物根分析。实施例5转化的拟南芥植物的体外根分析对于转化植物的体外根分析，使用尺度12cmxl2cm的正方形平板。对于每个平板，使用无选择剂的52mlMS培养基(0.5xMS盐、0.5%蔗糖、0.5g/LMES緩冲液、1%植物琼脂)。允许平板在无菌台内干燥l小时以减少将来的固缩。种子等分试样在玻璃瓶内用乙醇消毒5分钟，随后除去乙醇并允许种子在无菌台内干燥l小时。种子使用VacuseedDevice(Lehle)点播在平板上。在实IH殳计中，每个平板含有野生型植物和AtAGRl转基因植物。因此，每一林系总是与生长在同一平板中的对照比较以计算微环境变量。在种子点播于平板上后，平板用Ventwrap包裹并垂直地放置在搁架内，在4°C黑暗中持续4日以层积处理种子。将平板转移至C5Percival生长室并垂直放置14日。生长室条件是23。C白昼/21。C夜晚，以及16小时白天/8小时黑夜。为数据收集，使用高分辨率平板扫描仪。使用WinRhizo软件包完成根分析。为体外分析，将根测量为萌发14日后主根的长度。这对应于拟南芥生态型CW"附&Vi的4至6叶期。观察到的任何差异可能指示根长度的生长速率差异，但还可以反映最终的根生长。这些实验的结果还在基因水平上加以分析。为此，将全部植物根长度对全部转基因林系进行平均化并与野生型植物的平均值比较。靶向NOS终止子的转基因的存在和事件的拷贝数在实时PCR中确定。用于该分析的NOS引物是正向引物5，-TCCCCGATCGTTCAAACATT画3，(SEQIDNO:128)，反向引物5'國CCATCTCATAAATAACGTCATGCAT國3，(SEQIDNO:129)。反应在96孔光学平板(AppliedBiosystems，4314320)内运行，并且内源性对照反应和目的基因反应在同一块平板内同时运行。制备用于两种引物组的主混合物。用于鉴定法的主混合物和96孔平板应当保持在水上。计算用于52个的反应，这适用于利用多通道加样器的半个平板。使用Eurogentec试剂盒(目录号RTSNRT032X-1)，并且j吏用制造商推荐方法准备反应物。使用GeneAmp5700运行反应并收集数据。结果我们的结果显示在平板内评估的AtAGRl转基因植物具有较长的根表型。图4A显示基于每抹系的在垂直平板内所培育植物的结果。与野生型对照植物的才M目比，大部分筛选的AtAGRl转基因抹系表现出较长的根表型。在抹系5、7、9、10和11内更清楚地观察到该表型。如图4B内所见，AtAGRl转基因植物的基因水平分析证实AtAGRl植物表现增加的根长度表型，基于此分析，AGRl转基因拟南芥植物表现29.3%的根长度增加。实施例6转化的拟南芥植物的土壤根分析为土壤根分析，种子在4。C于水中吸涨2日并不加选择而直接种植在土壤里。使用在底部具有饱和的泥炭球(Jiffy727)的Deepots(HummertD40)并填满水饱和的Metromix。在种植后，花盆用塑料外罩覆盖以防止变干。植物使用仅存在于培养基制备物内的水进行培育，因为在这些大花盆内土壤中的水足够用于3周生长并且促进快速的根生长。在12日后移走花盆的塑料外罩并记录形态学数据。在第17日。收获植物的地上部分，在65°C干燥2日并测量干重。为检查根，将泥炭球推向花盆的顶部以移出作为一个整体的土壤和根。随后在浅盘内分开土壤与根并测量最大根长度。为确定根表型对转基因植物地上部分的影响，测量叶丛的干重并与野生型植物进行比较。结果如上所述也在土壤内评估AtAGRl林系的根。结果表明当植物在土壤内培育时，转基因植物表现较长的根表型(图5和6)。通常，所分析的全部AtAGRl林系在基于土壤的鉴定法中表现增加的生长。抹系4、7、8、9、10和11显示根长度的最大增加(图5)。图6显示AtAGRl基因整体表现的ANOVA，表明AtAGRl转基因植物比野生型对照明显表现更好。测量叶丛干重，并且结果的ANOVA分析示于图7。在转基因植物与野生型对照之间未观察到显著差异。因此，叶丛生物量似乎不受AtAGRl基因过量表达的影响。实施例7鉴定AtAGRl的同系物本发明中所用的算法包括FASTA(具有统计显著性估计的极其敏感的序列数据库搜索工具；PearsonW.R.，1990，RapidandsensitivesequencecomparisonwithFASTPandFASTA.MethodsEnzymol.183:63-98);BLAST(具有统计显著性估计的极其敏感的序列数据库搜索工具。AltschulS.F.等,Basiclocalalignmentsearchtool,JournalofMolecularBiology215:403-10);PREDATOR(从单个序列和多重序列中高度精确地预测二级结构。Frishman，D.和Argos，P.，1997，75%sccuracyinproteinsecondarystructureprediction.Proteins,27:329-335);CLUSTALW(多重序列比对法；Thompson,J.D.等，1994,CLUSTALW(improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice,NucleicAcidsResearch,22:4673-4680);TMAP(从多重比对的序列中预测跨膜区；Persson,B.和Argos，P.，1994，Predictionoftransmembranesegmentsinproteinsutilizingmultiplesequencealignments.J.Mol.Biol.237:182-192);ALOM2(从单个序列中预测跨膜区。Klein,P.等，Predictionofproteinfunctionfromsequenceproperties:Adiscriminateanalysisofadatabase.Biochim.Biophys.Acta787:221-226(1984)。由Dr.K.Nakai提供版本2);PROSEARCH(PROSITE蛋白质序列模式检测。Kolakowski等，1992，ProSearch:fastsearchingofproteinsequenceswithregularexpressionpatternsrelatedtoproteinstructureandfunction.Biotedmiques13，919-921);BLIMPS(对非空位性区段的数据库的相似性搜索。Wallace和Henikoff，1992);PATMAT(用于序列、模式和区段询问和数据库的搜索和提取程序，CABIOS8:249-254。由BillAlford编制)。在公共数据库和专利数据库内找到了AtAGRl基因的同系物。评估这些同系物以确定与AtAGRl的关联水平。使用来自算法BLAST家族的tblastn程序以〗更将AtAGRl蛋白质序列与在全部六种可读框下所翻译的专利作物数据库比较。在每种作物文库内均找到了具有显著同源性的序列。与AtAGRl相比，在每种序列氨基酸水平上的序列同一性百分数示于表1的第5列中。实施例8通过过量表达JG/W基因而改造大豆植物大豆的种子用70%乙醇在室温(连续振摇)表面消毒4分钟，随后由补加0.05%(v/v)Tween的20%(v/v)CLOROX(连续振摇)表面消毒20分钟。随后种子用蒸馏水淋洗4次并在室温放置在培养脏内的润湿无菌滤纸上6至39小时。剥掉种皮，并将子叶与胚轴分离。检查胚轴以确保未损伤分生组织。将切碎的胚轴收集到半开口的无菌培养皿内并且在密封的培养皿内空气干燥至含湿量小于20%(鲜重)直至进一步利用。如此制备根瘤农杆菌培养物，即从含有适宜选择剂的LB固体培养基中挑取单菌落，随后在液体LB培养基内培育该单菌落至600nm光密度0.8。随后，将细菌培养物在7000转/分钟在室温沉淀7分钟并重悬于补充100nM乙酰丁香酮的MS培养基内。使用前，细菌培养物在这种预先诱导的培养基内室温温育2小时。含湿量大约15%的大豆合子性种子的胚轴在室温以预先诱导的农杆菌悬浮培养物浸渗2小时。将胚从浸渗作用培养物内取出并转移至含有补充2%蔗糖的固体MS培养基的培养皿内并在黑暗下室温温育2日。或者，将胚放置于培养皿内润湿(液体MS培养基)的无菌滤纸表面并在如上所述的相同条件下温育。在此段时间后，将胚转移至补充500mg/L羧千西林或300mg/L头孢噻肟的固体MS培养基或液体MS培养基以杀死农杆菌。液体培养基用来湿润无菌滤纸。胚在4周期间在25。C于150ftmo1m、ec"和12小时的光周期下温育。一旦幼苗产生根，将它们转移到无菌Metro-Mix土壤内。在转移植物至土:t裒前，洗掉体外植物的培养基。植物在塑料罩下保持l周以促进适应过程。随后，将植物转移至生长室，在那里植物在25°C于150jimo1m、ec"和12小时的光周期下温育约80日。对转基因植物篩选其改良的根生长和/或胁迫耐受性，证实转基因表达赋予增加的根生长、胁迫耐受性和/或增加的水利用效率。实施例9通过过量表达」GiW基因而改造欧洲油菜/卡诺拉油菜植物本文中所述的植物转化方法适用于芸莒属作物和其它作物。卡诺拉油菜的种子用70。/。乙醇在室温(连续振摇)表面消毒4分钟，随后由补加0.05%(v/v)Tween的20%(v/v)CLOROX(连续振摇)表面消毒20分钟。随后种子用蒸馏水淋洗4次并在室温放置在培养皿内的润湿无菌滤纸上18小时。随后去除种皮，并且种子在半开口的无菌培养i内空气干燥过夜。在此期间，种子丧失其大约85%的水含量。随后种子在室温贮存于密封的培养亚内直至进一步利用。DNA构建体和胚浸渗如实施例10内所描述。原代转基因植物(To)的样品通过PCR进行分析以证实T-DNA的存在。这些结果由Southern杂交证实，其中DNA在l%琼脂糖凝胶上电泳并转移到带阳性电荷的尼龙膜(RocheDiagnostics)上。使用PCRDIG探针合成试剂盒(RocheDiagnostics)来通过PCR制备地高辛标记的探针并如制造商推荐加以使用。对转基因植物筛选其改良的根生长和/或胁迫耐受性，证实转基因表达赋予增加的根生长、胁迫耐受性和/或增加的水利用效率。实施例10通过过量表达v4GJW基因而改造玉米植物用Ishida等1996.NatureBiotch14745-50所述的方法开展以目的基因转化玉米(ZeamaysL.)。将不成熟的胚与携带"超级双元"载体的根瘤农杆菌共培养，并且通过器官发生法恢复转基因植物。该方法提供2.5%至20。/。之间的转化效率。对转基因植物筛选其改良的根生长和/或胁迫耐受性，证实转基因表达赋予增加的根生长、胁迫耐受性和/或增加的水利用效率。实施例11通过过量表达乂G7W基因而改造稻植物以目的基因对稻的转化可以通过利用原生质体或粒子轰击的直接基因转移技术实施。原生质体介导性转化已经描述用于日本型和印度型稻(Zhang等，PlantCellRep7:379-384(1988);Shimamoto等Nature338:274-277(1989);Datta等Biotechnology8:736-740(1990))。4吏用粒子轰击法，两种类型的稻也是可常规转化的(Christou等Biotechnology9:957-962(1991))。对转基因植物篩选其改良的生长和/或胁迫耐受性，证实转基因表达赋予增加的^^生长、胁迫耐受性和/或增加的水利用效率。实施例12同源基因和异源基因的鉴定基因序列可以用来鉴定来自cDNA文库或基因组文库的同源基因或异源基因。同源基因(例如全长cDNA克隆)可以使用例如cDNA文库通过核酸杂交得以分离。根据目的基因的丰度，将100,000直至l，OOO，OOO个重组噬菌体铺板并转移至尼龙膜。用碱变性后，将DNA固定在尼龙膜上，例如通过紫外线交联进行固定。杂交在高严格性条件下实施。在水溶液内，杂交和洗涤在1MNaCl离子强度和68°C温度上开展。杂交探针例如通过放射性(32p)切口转录标记法(HighPrime,Roche,Mannheim,德国)产生。信号通过放射自显影法检测。条件和洗涤条件，以与如上所述方法类似的方式加以鉴定。对于水溶液杂交，离子强度通常保持在lMNaCl上，而同时温度渐进性地从68。C降低至420C。分离仅在明显的结构域(例如10-20个氨基酸)内具有同源性(或序列同一性/相似性)的基因序列可以通过使用合成性放射标记的寡核苷酸探针实施。放射标记的寡核苷酸探针通过用T4多核苷酸激酶使两个互补的寡核苷酸的5'末端磷酸化而制备。将互补的寡核苷酸复性并连接以形成连环体。双链的连环体随后通过例如切口转录进行放射标记。通常在低严格性条件，使用高寡核苷酸浓度实施杂交.寡核苷酸杂交溶液6xSSC0.01M辨酸钠lmMEDTA(pH8)0.5%SDS100jig/ml变性鲑精DNA0.1%脱脂乳杂交期间，温度逐步降低到比估计的寡核苷酸Tm低5-10。C或降低至室温，随后实施洗涤步骤和放射自显影。以低严格性开展洗涤，如使用4xSSC的3个洗涤步骤。更详细的内容由Sambrook，J.等，1989，"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress或Ausubel，F.M.等，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"JohnWiley&Sons描述。实施例13通过用抗体篩选表达文库而鉴定同源基因cDNA克隆可以用来产生重组蛋白，例如在大肠杆菌(例如QiagenQIA表达pQE系统)内。重组蛋白随后通常经M-NTA亲和层析(Qiagen)得以亲和纯化。重组蛋白随后用来(例如通过^f吏用用于兔免疫的标准技术)产生特异性抗体。如Gu等，1994，BioTechniques17:257-262所述，抗体使用以重组抗原饱和的M-NTA柱得到亲和纯化。这种抗体可以用来篩选表达cDNA文库以便通过免疫筛选法鉴定同源基因或异源基因(Sambrook，J.等，1989,"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress或Ausubd，F.M.等，1994，"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"JohnWiley&Sons)。实施例14体内诱变微生物的体内诱变可以通过在遗传信息完整性的维持能力受到破坏的大肠杆菌或其它生物(例如芽孢杆菌或酵母如酿酒酵母)内传代质粒而实施。常见增变菌林在用于DNA修复系统的基因(例如mutHLS、mutD、mutT等，见Rupp，W.D，，1996，DNArepairmechanisms,在EscherichiacoliandSalmonella的第2277-2294页，ASM:Washington.)内具有突变。此类菌林是本领域技术人员众所周知的。此类菌抹的用途例如在Greener,A.和Callahan,M.，1994，Strategies7:32-34内得到说朋。突变的DNA分子至植物的转移优选地在选择并在微生物内检验后完成。转基因植物根据本文件的实施例部分内的多种实施例产生。实施例15体外分析转基因生物内拟南芥基因的功能酶的活性及动力学参数的测定在本领域内已充分建立。测定任意给定变异酶的活性的实验必须适合于野生型酶的特定活性，这完全在本领域4支术人员的能力范围内。关于酶的一般综述以及有关结构、动力学、原理、方法、应用的具体细节及测定众多酶活性的实例可以在如下参考文献内找到Dixon,M.和Webb,E.C.，1979，Enzymes.Longmans:London;Fersht，1985，EnzymeStructureandMechanism.Freeman:NewYork;Walsh,1979，EnzymaticReactionMechanisms.Freeman:SanFrancisco;Price,N.C.，Stevens,L，1982,FundamentalsofEnzymology.OxfordUniv.Press:Oxford;Boyer，P.D.编辑,1983，TheEnzymes,第3版AcademicPress:NewYork;Bisswanger,H.，1994，Enzymkinetik,第2版VCH:Weinheim(ISBN3527300325);编者Bergmeyer,H.U.，Bergmeyer，J.,Grafil，M.，1983-1986，MethodsofEnzymaticAnalysis,第3版,第I画XII巻，VerlagChemie:Weinheim和Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,1987，第A9巻，Enzymes.VCH:Weinheim,第352-363页。与DNA结合的蛋白质的活性可以通过数种充分建立的方法测量，如DNA带迁移鉴定法(也称凝胶阻滞鉴定法)。此类蛋白质对其它分子表达的影响可以使用报道基因鉴定法(如在Kolmar，H.等，1995，EMBOJ.14:3895-3卯4及其引用的参考文献内所述的报道基因鉴定法)测量。报道基因检测系统是众所周知的并且建立了用于使用酶如p-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或数种其它物质在原核细胞和真核细胞内的应用。测定膜转运蛋白的活性可以才艮据如Gennis，R.B.，1989，Pores,ChannelsandTransporters,inBiomembranes,MolecularStructureandFunction,第85-137页，199-234和第270-322页，Springer:Heidelberg内所述的技术开展。实施例16纯化来自转化生物的所需产物可以通过本领域内众所周知的多种方法开展回收来自以本文中描述的核酸序列所转化的植物材料、真菌、藻类、纤毛虫、谷氨酸棒状杆菌细胞或其它细菌细胞中或来自以上所述培养物的上清液中的所需产物。如果所需产物不从细胞中分泌，则细胞可以从培养物中通过低速离心收获，并且细胞可以通过标准技术如机械力或超声破碎法被裂解。植物的器官可以机械地与其它的组织或器官分开。匀浆后，细胞残片通过离心除去，并且保留含有可溶性蛋白的上清液部分用于进一步纯化所需的化合物。若产物从所需要的细胞内分泌，则细胞从培养物内通过低速离心去除，并且保留上清液部分用于进一步纯化。将来自两种纯化方法之一的上清液部分用合适的树脂进行色语处理，在所述层析中所需要的分子滞留在色谱树脂上而样品内的众多杂质未滞留在色i普树脂上，或者杂质被树脂滞留，而样品未被树脂滞留。此类色谱步骤可以根据需要使用相同色镨树脂或不同层析树脂重复进行。本领域技术人员将善于选择适宜的色谱树脂以及选择它们对特定待纯化分子的最有效应用。纯化的产物可以经过滤或超滤进行浓缩，并贮存在使产物最稳定的温度下。存在本领域内已知的多种纯化方法并且前面的纯化方法并不意味是限制性的。此类纯化技术在例如Bailey,J.E.和Ollis，1986，D.F.BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hill:NewYork中描述。此夕卜,分离的化合物的鉴定和纯度可以通过本领域内的标准技术进行评定。这些标准技术包括高效液相色语(HPLC)、光谱法、染色方法、薄层层析法、NIRS、酶测定法或微生物学法。此类分析方法在Patek等，1994，Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等,1996，Biotekhnologiya11:27-32;和Schmidt等,1998,BioprocessEngineer.19:67-70;Ulmann'sEncyclopediaofIndustrailChemistry,1996，第A27巻，VCH:Wdnheim，第89-卯页，第521-540页，第540-547页，第559-566页，575-581和第581-587页；Michal,G.，1999，BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWileyandSons;Fallon,A.等,1987,ApplicationsofHPLCinBiochemistryin:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,第17巻内综述实施例17盐耐受性筛选在MS平板上的盐试验将幼苗转移至浸泡在1/2MS内滤纸上并于耐受性筛选前夜放置在补加2ng/ml苯菌灵的1/2MS0.6。/。琼脂表面。对于耐受性筛选，将滤纸连同幼苗移动到培养亚中成叠浸泡在50mMNaCl内的无菌滤纸上。2小时后，将滤纸连同幼苗移动到培养亚中成叠浸泡在200mMNaCl内的无菌滤纸上。2小时后，将滤纸连同幼苗移动到培养皿中成叠浸泡在600mMNaCl内的无菌滤纸上。10小时后，将幼苗移动到含有补加2ng/ml苯菌灵的1/2MS0.6。/。琼脂的培养i内。在5日后对幼苗评分，表明转基因赋予盐耐受性。对盐耐受性的土壤试验待测试的植物种子进行消毒(100。/。漂白剂，0.1%TritonX5分钟2次并用ddH20淋洗5次)。种子铺在无选择剂的培养基(1/2MS、0.6%植物琼脂、0.5g/LMES、1%蔗糖、2fig/ml苯菌灵)上。允许种子萌发大约10日。在4-5叶期，转基因植物栽种到5.5cm直径的花盆内，其中所述的花盆以土壤(Metromix360,Scotts)疏松填满并用1g/L20-20-20肥料(PetersProfessional,Scotts)润湿。允许植物生长(22。C,持续光照)大约7日，根据需要浇水。当植物即将抽薹时，从浅盘中移走水并开始试验。为了开始试验，将3升100mMNaCl和1/8MS添加到花盆下的浅盘内。向含有对照植物的浅盘添加3升1/8MS。10日后，对NaCl处理的植物和对照植物浇水。再过10日，对植物照相。实施例18干早耐受性篩选将T1和T2幼苗转移至培养亚中干燥无菌的滤纸上并允许在80%RH(相对湿度)下，在Sanyo生长箱MLR-350H，micromols^2(白色光；PhilipsTL65W/25荧光灯管)内干燥2小时。RH随后降低至60。/。，并JU吏幼苗再干燥8小时。幼苗随后移动并置于补充2jig/ml苯菌灵的1/2MS0.6%琼脂平板上并在5日后评分。对转基因植物筛选改良的干旱耐受性，证实转基因表达赋予干旱耐受性。实施例19水冻耐受性篩选将幼苗移至含有补充2%蔗糖和2jig/ml苯菌灵的1/2MS0.6%琼脂的培养亚内。4日后，将幼苗在+4。C温育1小时并随后用碎水覆盖。随后将幼苗放置在EnviromentalSpecialistES2000人工环境室内并以-1.0。C为起点温育3.5小时，每小时降低-l。C。幼苗随后在-5.0。C温育24小时并随后允许在+5。C融化12小时。倾去水并且在5日后对幼苗评分。对转基因植物篩选改良的寒冷耐受性，证实转基因表达赋予寒冷耐受性。权利要求1.以分离的核酸转化的转基因作物植物，其中核酸包含选自以下的多核苷酸a)多核苷酸，其具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述的序列；b)多核苷酸，其编码具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多肽；c)多核苷酸，其与具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多核苷酸具有至少70％序列同一性；d)编码多肽的多核苷酸，其中所述的多肽与具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多肽具有至少70％序列同一性；和e)在严格条件下与以上a)至d)的任意多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸。2.权利要求l所述的转基因作物植物，其中多核苷酸在植物内的表达导致与植物的野生型品种相比，在正常条件或胁迫条件下产量增加。3.权利要求l所述的转基因作物植物，其中多核苷酸在植物内的表达导致与植物的野生型品种相比，环境胁迫耐受性增加。4.权利要求1所述的转基因作物植物，其中多核苷酸在植物内的表达导致与植物的野生型品种相比，在正常条件或胁迫条件下根生长增加。5.权利要求1所述的转基因作物植物，其中植物是单子叶植物。6.权利要求l所述的转基因作物植物，其中植物是双子叶植物。7.权利要求1所述的转基因作物植物，其中植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、高粱、黍、甘蔗、大豆、花生、棉花、欧洲油菜、卡诺拉油菜、木薯、辣椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属植物、油棕榈、椰子、多年生禾草和饲料作物。8.权利要求l所述的转基因作物植物，其中植物是完整植物、植物2细胞、植物部分或植物种子。9.由权利要求1所述的转基因作物植物产生的作物植物种子，其中种子包含分离的核酸。10.权利要求9所述的种子，其中与野生型品种的种子相比，所述种子对正常条件或胁迫条件下增加的产量是不分离的。11.权利要求9所述的种子，其中与野生型品种的种子相比，所述种子对增加的环境胁迫耐受性是不分离的。12.权利要求9所述的种子，其中与野生型品种的种子相比，所述种子对正常条件或胁迫条件下增加的根生长是不分离的。13.产生含有所分离的编码多肽的核酸的转基因植物的方法，其中所述方法包括步骤用包含核酸的表达载体转化植物细胞，并且从植物细胞产生表达多肽的转基因植物，其中所述核酸包含选自如下的多核苷酸a)多核苷酸，其具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述的序列；b)多核苷酸，其编码具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多肽；c)多核苷酸，其与具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性；d)编码多肽的多核苷酸，其中所述的多肽与具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多肽具有至少70%序列同一性；和e)在严格条件下与以上a)至d)的任意多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸。14.权利要求13所述的方法，其中多核苷酸在植物内的表达导致与植物的野生型品种相比，在正常条件或胁迫条件下产量增加。15.权利要求13所述的方法，其中多核苷酸在植物内的表达导致与植物的野生型品种相比，环境胁迫耐受性增加。16.权利要求13所述的方法，其中多核苷酸在植物内的表达导致与植物的野生型品种相比，在正常条件或胁迫条件下根生长增加。17.权利要求13所述的方法，其中作物植物是单子叶植物。18.权利要求13所述的方法，其中作物植物是双子叶植物。19.权利要求13所述的方法，其中作物植物选自玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、高粱、黍、甘蔗、大豆、花生、棉花、欧洲油茱、卡诺拉油菜、木薯、辣椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属植物、油棕榈、椰子、多年生禾草和饲料作物。20.权利要求13所述的方法，其中核酸包含具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多核苷酸。21.权利要求13所述的方法，其中核酸包含如下多核苷酸，其中所述的多核苷酸与具有如在表l第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。22.权利要求13所述的方法，其中核酸包含编码如下多肽的多核苷酸，其中所述多肽具有如在表1第3列中提供的任意SEQIDNO内所述的序列。23.权利要求13所述的方法，其中核酸包含编码如下多肽的多核苷酸，其中所述多肽与具有如在表1第4列中提供的任意SEQIDNO内所述序列的多肽具有至少70%序列同一性。24.权利要求13所述的方法，其中核酸与一种或多种调节序列有效连接。25.权利要求24所述的方法，其中调节序列是启动子。26.权利要求25所述的方法，其中启动子是组织特异性的。27.权利要求25所述的方法，其中启动子是受发育调节的。全文摘要转基因作物植物由编码膜转运蛋白样多肽(MTP)的核酸转化，其中与植物的野生型品种相比，核酸序列在作物植物内的表达引起植物增加的根生长和/或增加的产量和/或增加的环境胁迫耐受性。本发明还提供农业产物，包括转基因作物植物所产生的种子。文档编号C12N15/82GK101228279SQ200680026665公开日2008年7月23日申请日期2006年7月13日优先权日2005年7月19日发明者B·麦克尔西,D·艾伦,E·R·加尔,J·黑特尔,R·萨里亚-米兰申请人:巴斯福植物科学有限公司