专利名称：一个可提高黄原胶产量的基因的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域。具体涉及与黄原胶合成相关的基因，该基因编码的蛋白质为尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶(UDP-glucose4-epimerase，简称rmd)，该基因在野生型野油菜黄单胞菌中表达，可显著增加黄原胶的产量，可用于黄原胶生产菌株的遗传改良。
背景技术：
黄原胶是一种由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.campestris，简称Xcc)所产生的胞外多糖聚合物，由多个“五糖单元”聚合而成。两个D-葡萄糖分子通过β-(1→4)糖苷键连接成主链骨架，一条由甘露糖-(β→1，4)-葡萄糖醛酸-(β→1，2)-甘露糖组成的侧链通过α-(1→3)糖苷键连接到主链的一个D-葡萄糖残基，组成一个“五糖单元”。黄原胶具有良好的增粘性和触变性，极佳的热、酸、碱稳定性，较强的抗酶解能力，能与大多数的金属盐配伍，与常用的溶剂、试剂相容。它是目前国内外已经开发的几种微生物多糖中最具特色的一种，也是世界上生产规模最大，用途最广的微生物多糖。已作为助悬剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂，在石油开采、医药、食品、饮料、化妆品、洗涤剂、涂料等行业中广泛应用，另外在森林灭火、环境保护方面也有很好的应用前景(Sutherland1986；李信，1995)。美国曾对9种微生物多糖进行评价，黄原胶以其功能全面、用途广泛而居首位。目前全世界黄原胶的年产量超过5万吨，在发酵工业中占有十分重要的地位。黄原胶的广泛应用，为相关的行业创造了巨大的经济效益。
然而，目前国内黄原胶生产菌株的产量在4％碳源的发酵液中黄原胶产量为27g/L，而发达国家则超过34g/L，选育高产菌株仍有很大的发展空间，可以通过采用①提高黄原胶生物合成相关基因产物的活性(Harding etal 1987；Zha et al 1998)；②增加相关基因的拷贝数(Tseng et al 1992)；③修饰黄原胶生物合成调控基因(Tang et al 1991；Katzen et al 1998)；④修饰与糖代谢有关的基因，降低糖类的其他途径消耗；⑤改变多聚糖分解酶类基因，以减少胞外多糖的降解，提高产胶率(Schroter et al 2001)；⑥提高胞外多糖转运酶类活性等方法来改良菌株提高黄原胶产量。
发明内容
本发明提供与黄原胶合成相关的新基因，用于黄原胶生产菌株的遗传改良，提高黄原胶产量。
因此，本发明的一个目的是提供一种编码尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶的基因(rmd)，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
在一个实施方案中，所述的基因具有SEQ ID No.1所示的DNA序列，5’端的第1-939位核苷酸为开放阅读框。
本发明还涉及含有上述基因的表达载体。优选为pLAFR3-rmd。
本发明另一个目的是提供一种提高黄原胶产量的方法，其特征在于在微生物中高表达上述基因。优选所述微生物是野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。
具体地讲，一种源于野油菜黄单胞菌8004菌株的基因(基因组全序列已在GenBank公布，序列号为CP000050)所表达的尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶或功能类似物，其氨基酸序列与SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少80％的同源性，至少它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明还具体地涉及编码它们的基因。另外还提供了尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶在黄原胶生产中的应用和基因在黄原胶生产和其菌株的遗传改良中的应用。
SEQ ID No.1是野油菜黄单胞菌8004菌株的基因DNA序列片段，由939个碱基组成。含完整的尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶基因，自5’端的第1-939位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第1-3位核苷酸为该基因的起始密码子GTG，自5’端的第937-939位核苷酸为终止密码子TGA。SEQ ID No.2所示的氨基酸序列是尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶基因编码的尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶蛋白产物，由312个氨基酸组成。
本发明提供了一种与黄原胶合成相关的新基因，在黄原胶生产和其菌株的遗传改良中的应用有着重要的意义。
图1为rmd基因的PCR产物电泳图。
M100bp标准DNA(片段大小从大到小依次为3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；1rmd基因PCR产物电泳带，显示大小为约950bp。
图2为rmnd基因克隆入表达载体pLARF3后的酶切检验。
Mλ/Hind III标准DNA(片段大小从大到小依次为23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)；1克隆载体pLAFR3作为对照的BamHI/EcoRI酶切产物；2表达质粒pLAFR3-rmd的BamHI/EcoRI酶切产物。
图3为pLAFR3的质粒图谱。
图4为验证rmd基因在转化株中高表达的RNA实验。
图5为rmd基因导入野生型Xcc 8004后，构建高表达菌株。高表达菌株与野生型菌株在NYG+2％葡萄糖上的生长状况。
具体实施例方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例在本发明的实施例中所用到的材料包括黄单胞菌野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The National Collection of PlantPathogenic Bacteria，NCPPB)，保藏号为NCPPB No.1145；表达载体pLAFR3(Staskawicz et al，1987)为本研究室(广西大学生命科学与技术学院分子遗传研究所)保存。限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、TAKARA、QIAGEN等公司；抗生素(利福平、卡那霉素)和培养基原料(蛋白胨、酵母提取粉、甘油)购于上海生物工程公司。
SV Total RNA Isolation System总RNA提取试剂盒购自Promega公司，反转录试剂盒ReveAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。
培养基NYG(每升溶液含5g蛋白胨，3g酵母膏和20g甘油，根据三组分缩写为NYG，pH7.0)。
实施例1 rmd基因的PCR扩增根据rmd的基因序列，设计引物正向引物C3626F，5-CCCGAATTCGTGGCTTCTCATTC-3，反向引物C3 626R，5-CCCGGATCCTCACTGCTCAGTGC-3。
根据野油菜黄单胞菌菌株的rmd基因序列，设计带有BamHI、EcoRI酶切位点的上下游引物，上游引物命名为C3626F，加有BamHI切点；下游引物命名为C3626R，加有EcoRI切点。以野油菜黄单胞菌菌株NCPPBNo.1145总DNA为模板，PCR扩增该基因全长序列(PCR条件95℃3min；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃5min)。电泳图示PCR产物，大小约950bp(见图1)。用双脱氧核苷酸法在ABI 377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(SEQ ID No.1)。
实施例2 rmd基因高表达质粒的构建及验证用BamHI/EcoRI酶切PCR产物及pLAFR3(见图3)并连接，将其rmd基因片段克隆至pLAFR3中，构建表达质粒pLAFR3-rmd并酶切验证(见图2)。
实施例3 黄单胞菌转化子中rmd基因高表达的验证采用电穿孔法将表达质粒pLAFR3-rmd导入上述黄单胞菌野生菌株中。通过从黄单胞菌转化子提取质粒，酶切的方法筛选黄单胞菌转化株。
采用半定量PCR方法检测rmd基因在转化株中确实高表达状况(图4)。操作方法野生型菌株和测试菌株在NYG培养基中培养18小时，分别提取RNA(SV Total RNA Isolation System总RNA提取试剂盒)，用反转录ReveAidTM试剂盒获得总RNA的cDNA。在分别用16S rDNA上下游引物(GAGGATGATCAGCCACACTG和ACCACATACTCCACCGCTTG)和rmd基因上下游引物(C3626F、C3626R)，以总cDNA为模板，进行PCR(反应条件95℃3min；95℃30sec，61℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃5min)。检测16S rRNA的表达状况，在确定16S rRNA表达基本一致。电泳带明亮程度差异明显，结果表明，在构建的高表达菌种中rmd基因比在野生菌中表达量增高。
实施例4 rmd基因高表达菌株在固体培养基上的生长状况在NYG+2％葡萄糖固体培养基(NYG加1.5％琼脂，pH7.0)平板上，用牙签点接野生型黄单胞菌、rmd基因高表达菌株，28℃培养72小时。结果表明，rmd基因高表达菌株比野生型菌株的胞外多糖产量明显(见图5)。
实施例5 rmd基因高表达菌株的黄原胶产量检测黄原胶产量检测(Tang D，et al.2005)，可以通过摇瓶发酵，提取黄原胶，对产量进行比较。黄原胶产量作定性分析时，将Xcc的过夜培养物以1％(v/v)的接种量接种至加2％葡萄糖的NYG培养基，28℃摇床培养3天后，取1体积的培养物，缓慢注入到3～7倍体积的无水乙醇中，边注入边搅拌，然后将絮状沉淀物取出后干燥，称重，换算成每100ml培养物可形成多少克黄原胶进行菌株间的产量比较。对rmd基因高表达菌株与野生型菌株平行进行摇瓶发酵，重复三次，黄原胶产量统计对比结果如表1。结果显示，培养72小时和120小时rmd基因高表达菌株黄原胶产量分别比野生型菌株提高44.7％和43.9％。证实rmd基因高表达能增加黄原胶的产量。
表1 rmd基因高表达菌株与野生型8004菌株黄原胶产量比较
参考文献1.李信主编.1995.黄原胶生产与应用，北京中国农业科技出版社.
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序列表<110>广西大学<120>一个可提高黄原胶产量的基因<130>IB055870<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>939<212>DNA<213>Xanthomonas campestris<400>1gtggcttctc attctgagct gaaaggcaag cgggttctgg tcagtggcgc gtccgggttc60accggacgct acatgtccca gcagctcaag gagcagggct gcaccgtgat cggtgttggg120acccgttgcg acggtgccgg tacaagcgca accgacgagt tctggccgat ggatctgcgt180gacgctgccg acgtcgctcg cgtcgttgcg caggcccaag ccgactacgt tgtgcatctg240gctgcagtgg cctttgtcgg tcatggggat gccgacgatt tttatcgggt caatctgctc300ggcacgcgta acctgctgca ggcgctggcc gcaagccaac accgcccaga gagggtgctg360atcgcgagca gtgccaatgt ctacggcaat gcaaccgagg gcgtgatcga cgagtcggtc420acgccttcgc ccgcgaacga ctacgcggtg agcaagctcg ccatggaata tgtcgccagc480ttgtggcacg agcgcctgcc cctggtgatt gcccgcccat tcaactacac gggggtcggt540caggcgacca atttcctgat tcccaagatt gtttcgcatt tcgcatcgcg cgcctcttcc600atcgagttgg gcaacaccga agtgtggcgg gatttcggcg atgtcagatc ggtcgtgctg660gcttatcgca agcttctgca agcacccgct gcggaagggc agatcgtcaa cgtgtgttcg720ggtgtcgcca gttcgctgag cgacatcatc aggatctgct cgaaaatcac cggccacgac780atcgacgtcc aggtgaatcc cgcattcgtt cggcagaatg aagtcaggaa gttgcttggc840agcaatgcca gattgcagga gctgatcggc gattggcaga gtcttgcgct ggaggatacg900ttgcgctgga tgcttgaagc tgcaagcact gagcagtga 939<210>2<211>312
<212>PRT<213>Xanthomonas campestris<400>2Met Ala Ser His Ser Glu Leu Lys Gly Lys Arg Val Leu Val Ser Gly1 5 10 15Ala Ser Gly Phe Thr Gly Arg Tyr Met Ser Gln Gln Leu Lys Glu Gln20 25 30Gly Cys Thr Val Ile Gly Val Gly Thr Arg Cys Asp Gly Ala Gly Thr35 40 45Ser Ala Thr Asp Glu Phe Trp Pro Met Asp Leu Arg Asp Ala Ala Asp50 55 60Val Ala Arg Val Val Ala Gln Ala Gln Ala Asp Tyr Val Val His Leu65 70 75 80Ala Ala Val Ala Phe Val Gly His Gly Asp Ala Asp Asp Phe Tyr Arg85 90 95Val Asn Leu Leu Gly Thr Arg Asn Leu Leu Gln Ala Leu Ala Ala Ser100 105 110Gln His Arg Pro Glu Arg Val Leu Ile Ala Ser Ser Ala Asn Val Tyr115 120 125Gly Asn Ala Thr Glu Gly Val Ile Asp Glu Ser Val Thr Pro Ser Pro130 135 140Ala Asn Asp Tyr Ala Val Ser Lys Leu Ala Met Glu Tyr Val Ala Ser145 150 155 160Leu Trp His Glu Arg Leu Pro Leu Val Ile Ala Arg Pro Phe Asn Tyr165 170 175Thr Gly Val Gly Gln Ala Thr Asn Phe Leu Ile Pro Lys Ile Val Ser180 185 190His Phe Ala Ser Arg Ala Ser Ser Ile Glu Leu Gly Asn Thr Glu Val195 200 205Trp Arg Asp Phe Gly Asp Val Arg Ser Val Val Leu Ala Tyr Arg Lys
210 215 220Leu Leu Gln Ala Pro Ala Ala Glu Gly Gln Ile Val Asn Val Cys Ser225 230 235 240Gly Val Ala Ser Ser Leu Ser Asp Ile Ile Arg Ile Cys Ser Lys Ile245 250 255Thr Gly His Asp Ile Asp Val Gln Val Asn Pro Ala Phe Val Arg Gln260 265 270Asn Glu Val Arg Lys Leu Leu Gly Ser Asn Ala Arg Leu Gln Glu Leu275 280 285Ile Gly Asp Trp Gln Ser Leu Ala Leu Glu Asp Thr Leu Arg Trp Met290 295 300Leu Glu Ala Ala Ser Thr Glu Gln305 310
权利要求
1.一种编码尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶的基因(rmd)，其是下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No.1所示的DNA序列；2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于它具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于自5’端的第1-939位核苷酸为开放阅读框。
4.含有根据权利要求1或2所述的基因的表达载体。
5.根据权利要求4的表达载体，其为pLAFR3-rmd。
6.一种提高黄原胶产量的方法，其特征在于在微生物中高表达根据权利要求1或2所述的基因。
7.根据权利要求6的方法，其中所述微生物是野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。
全文摘要
本发明公开了来自野油菜黄单胞菌中的一个与黄原胶生产有关的基因——尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。本发明还涉及含有该基因的载体和通过高表达该基因来提高黄原胶产量的方法。
文档编号C12N15/63GK1952155SQ20051008665
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者何勇强, 唐纪良, 姜伯乐, 唐东阶, 陆光涛, 梁晓夏, 危广宁, 何飞燕, 冯家勋 申请人:广西大学