专利名称：水稻抗病相关基因OsDR2的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段的分离克隆、功能验证和应用。所述的DNA片段能够显著提高植物抵抗病害的能力。将该片段的完整翻译区(codingsequence)与玉米的泛素(ubiquitin)启动子结合后直接转入感病植物体，转基因植株的抗病能力显著提高。
背景技术：
植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、霉菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。
根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996，Science 2742060-2063；Baker等，1997，Science 276726-733；Jia等，2000，EMBO J.194004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833；Nimchuk等，2001，Curt.Opin.Plant Biol.4288-294)。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大约40个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。
植物的抗病反应可以分为两大类。长期以来研究者们对这两大类抗病反应给予了不同名称，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New Youk)、质量抗性和数量抗性(Ou等，1975，Phytopathology 651315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet，1979，Annu.Rev.Phytopathol.1203-222)。质量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介导的抗病反应。数量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)调控的抗病反应，它被认为无病原特异性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice Blast Disease，Zeigler等编著，CAB Intemational，Cambridge，UK，pp.245-265)。目前，人们对植物抗病QTL的基因本质还不清楚。因此，虽然水稻中已经鉴定出了大量抗病QTL，如抗白叶枯病QTL(Li等，1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)、抗纹枯病QTL(Li等，1995，Theor.Appl.Genet.91382-388)和抗病毒病QTL(Albar等，1998，Theor.Appl.Genet.971145-1154)等，但这些抗性QTL没有被很好地用于水稻品种抗病性的改良。
近年研究发现很多抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应，提示这些抗病相关基因可能就是相对应的QTL。抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应这一现象在多种植物中都被观察到，包括水稻(Xiong等，2002，45518-526；Ramalingam等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.1614-24；Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339；Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 271111-120)、小麦(Faris等，1999，Theor.Appl.Genet.98219-225)、豆类(Geffroy等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13287-296)和马铃薯(Trognitz等，2002，Mol.Plant-Microbe Interact.15587-597)。这些结果为采用候选基因策略分离、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依据。
分离克隆抗病相关基因是利用这类基因改良植物抗病性的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达抗病相关基因进行农作物品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱；这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个抗病相关基因完整编码区段的DNA片段，利用这个基因改良水稻或其它植物抵御病害的能力。这个基因被命名为OsDR2(Oryza sativa defenseresponsive 2)。
本发明涉及分离和应用一种包含OsDR2基因的DNA片段，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea)所引起的病害产生抗病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的OsDR2基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsDR2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsDR2基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。
本发明为增强植物对细菌性和真菌性病害的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将OsDR2基因和超量表达、组成型启动子(如玉米泛素启动子)连接后转入感病植物，通过超量表达OsDR2基因拓宽和增强植物对病原菌的抗性。
将克隆的抗病相关基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗传转化技术在植株中累加多个抗性基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。抗病相关基因的克隆是克服传统育种不能在植物种间转移抗病相关基因问题的前提。
本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其它的植株。
在本发明的实施例部分，我们阐述了OsDR2基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。
序列表SEQ ID No1.本发明分离克隆的OsDR2基因的编码区序列。
图1.OsDR2基因位于水稻7号染色体，其染色体位置与已知抗稻瘟病QTL(Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002544-2549)相对应。
图2.采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)技术分析OsDR2基因在不同水稻材料接种病原菌或接水(CK，对照)后的表达特征。(A)接种稻瘟病菌后OsDR2基因的表达；(B)接种白叶枯病菌后OsDR2基因的表达；1、2、3、4、5、6、7和8分别代表接种或接水后2小时、4小时、8小时、16小时、1天、3天、5天和7天。Actin为β-肌动蛋白。
图3.采用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)发现EI5P11克隆的cDNA序列(Query)与GenBank核苷酸数据库中的AP003846序列(Sbjct)同源性为96％。
图4.采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因结构预测软件、参照拟南芥作为分析模板分析AP003846序列中所包含的基因的部分结果。图中示与OsDR2基因同源基因的结构。Gn代表基因编号；Ex代表外显子；Init代表基因起始端外显子；Term代表基因终止端外显子；Prom代表基本启动子；PlyA代表PolyA；S代表DNA链，其中“+”表示分析过程中输入的DNA序列链；Begin代表外显子、启动子或PolyA在输入DNA序列中的起始位置；End代表外显子、启动子或PolyA在输入DNA序列中的终止位置；Len代表外显子、启动子或PolyA的序列长度(bp)；Fr代表翻译阅读框(每条DNA序列有3个翻译阅读框)；I/Ac代表3’剪切位点分值；Do/T代表5’剪切位点分值；CodRg代表翻译区分值；P代表外显子概率；Tscr代表外显子分值。
图5.水稻品系C101LAC中覆盖OsDR2基因区段的亚克隆的重叠图。图中长线条代表从水稻品系C101LAC中获得的PCR扩增片段的大小和限制性内切酶的酶切位点。箭头的位置及长度表示亚克隆序列在PCR扩增片段中的位置及长度，箭头方向表示亚克隆测序的方向，序列拼接得到一条长2212bp的序列。
图6.采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因结构预测软件、参照拟南芥作为分析模板分析从水稻品系C101LAC中获得的2212bp、包含OsDR2基因的序列。分析结果显示该序列包含OsDR2基因完整的编码序列。图中Gn代表基因编号；Ex代表外显子；Init代表基因起始端外显子；Term代表基因终止端外显子；Prom代表基本启动子；PlyA代表PolyA；S代表DNA链，其中“+”表示分析过程中输入的DNA序列链；Begin代表外显子、启动子或PolyA在输入DNA序列中的起始位置；End代表外显子、启动子或PolyA在输入DNA序列中的终止位置；Len代表外显子、启动子或PolyA的序列长度(bp)；Fr代表翻译阅读框(每条DNA序列有3个翻译阅读框)；I/Ac代表3’剪切位点分值；Do/T代表5’剪切位点分值；CodRg代表翻译区分值；P代表外显子概率；Tscr代表外显子分值。
图7.用RT-PCR方法分析OsDR2基因的内含子。图中M代表2kb ladder(由上至下的电泳带分别为2000、1000、750、500、250和100bp)，1为RT-PCR扩增产物(493bp)、2是以C101LAC总DNA为模板(对照)的扩增产物(587bp)。
图8.OsDR2基因的结构及用于超量表达遗传转化载体构建的DNA片段长度和结构。线条表示内含子；柱条表示外显子(编码序列)；数字表示各个结构的碱基数。长箭头代表遗传转化水稻DNA片段的长度(2212bp)和相对应基因结构的位置。“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。
图9.(A)遗传转化载体pU1301的结构；(B)遗传转化载体pCAMBIA1301的结构。
图10.用RNA杂交技术检测显示OsDR2基因的表达增强与转基因植株的抗性增强相关。RNA杂交用探针系采用5P11F2和5P11GSP2引物扩增获得的RT-PCR产物。
图11.转基因水稻植株接种稻瘟病菌IK81-3后表现出抗性增强。水稻品种牡丹江8号为遗传转化受体材料(对照)。
具体实施例方式
本发明的前期研究工作结果显示来源于水稻品种明恢63的cDNA克隆EI5P11是OsDR2基因的cDNA片段，OsDR2是一个抗病相关基因。主要依据有以下几个方面(1)采用cDNA芯片技术分析发现cDNA克隆EI5P11在水稻品种明恢63接种稻瘟病菌株V86013后表达量增加了3.2倍(Zhou等，The defense-responsive genes showing enhanced and repressed expressionafter pathogen infection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Science in China 45449-467)。对EI5P11克隆的插入片段进行测序，获得一条长1634bp的cDNA序列。序列分析显示其编码产物与生长素反应类蛋白质同源程度很高。鉴于EI5P11克隆在病原菌接种前后表达量有明显差异以及序列特征，我们认为cDNA克隆EI5P11所代表的基因参与植物的抗病反应调控，是一个抗病相关基因。(2)采用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)将这条cDNA序列与公共核苷酸数据库GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色体位置的水稻基因组序列比较分析，将OsDR2基因定位于水稻7号染色体，其染色体位置与已知的抗稻瘟病QTL(Chen等，Comparative analyses of genomic locations and race specificitiesof loci for quantitative resistance to Pyricularia grisea in rice and barley，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002544-2549)相对应(图1)，提示OsDR2可能就是相对应的抗病QTL的基因(Wen等，Three types of defense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungalblast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。(3)利用12种水稻材料一病原菌组合分析OsDR2基因的表达模式(表1)(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics269331-339)。被分析的水稻材料中，C101A51、C101LAC和CO39是抗稻瘟病近等基因系(Mackell和Bonman，1992，Phytopathology 82746-749)，IRBB4、IRBB13和IR24是抗白叶枯病近等基因系(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107)。在RT-PCR(reversetranscription-polymerase chain reaction)分析中，OsDR2基因特异性PCR引物5P11F(5’ATGTACGCGCAGATGGTGT3’)和5P11R(5’-GGTTTGAGCCCAATTTAGCA-3’)是根据该基因的cDNA片段克隆EI5P11的序列设计的；另外，用水稻β-肌动蛋白(actin)的PCR引物actinF(5’-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3’)和actinR(5’-CCATGCTCGATGGG-GTACTT-3’)的扩增产物作为样品RNA量的标准。RT-PCR分析结果(图2)显示接种稻瘟病菌或白叶枯病菌后OsDR2基因在所有抗病水稻材料中的表达量都增加了，即病原菌可诱导增强OsDR2基因表达。这一诱导最早发生在病原侵染后16小时(图2)。而OsDR2基因的表达在感病水稻材料接种病原菌后(珍汕97接种白叶枯病菌JL691除外)和所有水稻材料接水(对照)后无变化。感病水稻品种珍汕97在接种白叶枯病菌JL691后OsDR2基因也出现在抗病水稻品种中的表达模式，但该基因的表达量不如在抗病品种中高。这些结果进一步证实OsDR2是一个抗病相关基因，它不仅参于水稻抗白叶枯病反应的调控，也参于抗稻瘟病反应的调控(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。
表1.用于RT-PCR分析的水稻材料和病原菌组合
1水稻材料明恢63和珍汕97是我国常用杂交水稻的两个亲本；其它水稻材料是国际上常用白叶枯病和稻瘟病鉴定材料(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107；Mackell和Bonman，1992，Phytopathology82746-74)，由国际水稻研究所(IRRI)惠赠。
2白叶枯病菌菌株JL691是中国菌株(Yang等，2003，Theor.Appl.Genet.1061467-1472)，其它白叶枯病菌菌株和所有稻瘟病菌菌株是国际上常用白叶枯病和稻瘟病鉴定菌株(Wen等，Three types ofdefense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)，由国际水稻研究所惠赠。
以下实施例进一步定义本发明，并描叙了本发明在上述前期研究工作结果的基础上分离克隆OsDR2基因以及验证OsDR2基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1分离克隆OsDR2基因1.与OsDR2基因同源基因结构的预测本发明以上述cDNA克隆EI5P11的序列(1634bp)作模板，用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)检索公共核苷酸数据库GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)，发现数据库中来自水稻品种日本晴的一条位于水稻7号染色体、长136,107bp的序列(GenBank注册号AP003846)的一段(第31,101至29,570bp处)与EI5P11序列的27至1555处的同源性达到96％(E值＝0)，提示AP003846中包含与OsDR2同源的基因(图3)。
采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因结构预测软件分析AP003846序列中所包含的基因。分析结果显示与EI5P11 cDNA序列同源的基因的编码序列位于AP003846序列的31,751至29,840bp处(图4)。
2.从抗稻瘟病水稻品系C101LAC中分离克隆OsDR2基因本发明的上述前期研究结果已证明抗稻瘟病水稻品系C101LAC携带有功能的OsDR2基因(图2)。本发明根据AP003846序列中与EI5P11 cDNA序列同源基因的编码区两侧的序列设计PCR引物5P11F1(5’-TTTTCTTGTTCGGGGTTGAG-3’，位于AP003846序列的31,776至31,757bp处)和5P11R2(5’-CGGTTTTGGAGGACAGGTTA-3’，位于AP003846序列的29,565至29,584bp处)，从C101LAC中扩增OsDR2基因的全长编码区，获得一个大约2.2kb的PCR产物。将这一PCR扩增产物连接到质粒载体pGEM-T(购自美国Promega公司)上，命名这个重组质粒为T5P11。
本发明分别用NcoI和PvuII限制性内切酶消化T5P11质粒，构建上述PCR产物的亚克隆。通过1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，纯化后用T4-DNA聚合酶补平末端，与限制性内切酶SmaI消化处理的去磷酸化的pUC19(购自美国Amersham Biosciences公司)载体平端连接，电转化大肠杆菌DH10B(购自美国Invitrogen公司)，通过蓝白斑筛选获得阳性亚克隆。提取阳性亚克隆质粒，并与空pUC19质粒进行电泳比较，剔除假阳性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI双酶切处理，检测阳性克隆插入片段大小。
采用M13-R和M13-F通用引物(购自中国上海生工生物工程公司)、美国Perkin Elmer公司的测序试剂盒(Big Dye Kit)、分别从每个亚克隆的两端测序。共计对6个亚克隆进行了测序(图5)。对这6条亚克隆的序列进行拼接，得到一条长2212bp的序列。
采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因结构预测软件分析这条2212bp长的序列，证明它包含OsDR2基因的完整的编码序列(图6)。将来源于C101LAC的OsDR2基因的编码区序列与水稻品种日本晴基因组序列AP003846上的同源基因的序列进行比较，发现存在一个碱基的差异(序列表SEQ ID NO1所示序列的1880bp处)，OsDR2基因中的腺嘌呤(A)替换了其日本晴中同源基因的鸟嘌呤(G)，但此碱基的差异不引起编码的氨基酸序列的差异。
实施例2OsDR2基因结构分析1.总RNA的抽提总RNA的抽提采用TRIzol Reagent(购自美国Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。
2.基因内含子的确定采用基因预测软件GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)对包含OsDR2基因区段的基因组DNA序列(2212bp)进行分析，结果显示OsDR2基因的编码区段中存在一个内含子(图6)。本发明根据预测的内含子两侧的DNA序列设计一对PCR引物5P11F2(5’-GTTCATCGACGAGATGACCA-3’，位于序列表SEQ ID NO1所示序列的118至137bp处)和5P11GSP2(5’-GTCGTAC GGCCGGTTCTTGA-3’，位于序列表SEQ ID NO1所示序列的704至685bp处)。用这一对PCR引物扩增基因组DNA和RNA反转录产物，结果显示RT-PCR产物比从基因组中扩增出的产物小(图7)，说明该区段确实存在一个内含子。按照pGEM-T Vector System 1 kit试剂盒(购自美国Promega公司)的使用说明书，将RT-PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌DH10B(购自美国Invitrogen公司)，通过兰白斑筛选获得阳性克隆。对阳性克隆进行测序、并与基因组DNA序列比较，确定OsDR2基因内含子的实际大小是94bp(图8)，比预测的内含子长(图6)。根据这一结果OsDR2基因编码区被内含子分为两段，分别长443bp和1375bp(图8)。
实施例3OsDR2基因编码产物的分析根据BLAST分析结果，OsDR2基因编码的蛋白质与一类生长素反应蛋白有较高的同源性。如OsDR2基因的编码产物与大豆GH3基因的编码产物(Hagen等，Auxin-induced expressionof the soybean GH3 promoter in transgenic tobacco plants，1991，Plant Mol.Biol.17567-579)的氨基酸一致性为67％(E值＝0)，与烟草的cDNA Nt-gh3的编码产物(Roux和Perrot-Rechenmann，Isolation by differential display and characterization of a tobaccoauxin-responsive cDNA Nt-gh3 related to GH3，1997，FEBS Lett.419131-136)的氨基酸一致性为75％(E值＝0)，与拟南芥DFL1基因的编码产物(Nakazawa等，DFL1，an auxin-responsiveGH3 gene homologue，negatively regulates shoot cell elongation and lateral root formation，andpositively regulates the light response of hypocotyls length，2001，Plant J.25213-221)的氨基酸一致性为64％(E值＝0)，与拟南芥JAR1基因的编码产物(Staswick等，2002，Plant Cell 141405-1415)的氨基酸一致性为39％(E值＝e-109)，与苔藓Physcomitrella patens的GH3-likeprotein 1(Imaizumi等，2002，Plant Cell 14373-386)的氨基酸一致性为38％(E值＝1e-87)。进一步利用3D-PSSM方法(http//www.bmm.icnet.uk/～3dpssm/)(Kelley等，Enhancedgenome annotation using structural profiles in the program 3D-PSSM，2000，J.Mol.Biol.299499-520)对OsDR2基因编码的蛋白质进行二级和三级结构的分析，显示OsDR2蛋白在结构上与乙酰腺嘌呤化萤火虫荧光素酶(acyl adenylateforming firefly luciferase)相似(氨基酸一致性及E值分别是16％和0.075)。另据报道(Staswick等，2002，Plant Cell 141405-1415)，乙酰腺嘌呤化萤火虫荧光素酶超家族在不同生物体中的成员具有序列相似性不高的特征，但生化功能却极为类似，都能作用于含有羧基的化合物并将其乙酰腺嘌呤化。本发明采用BLAST分析方法，显示OsDR2基因的编码产物与拟南芥中能使生长素(IAA)乙酰腺嘌呤化的萤火虫荧光素酶类基因F6G17.40(GenBank注册号NM 119902)、T26I20.12(GenBank注册号NM 127059)、T20D16.20(GenBank注册号NM 127881)、F24B18.13(GenBank注册号NM 124831)、M4I22.70(GenBank注册号NM 118860)和F17A22.14(GenBank注册号NM 130342)的编码产物的氨基酸一致性分别为70％(E值＝0)、70％(E值＝0)、67％(E值＝0)、63％(E值＝0)、63％(E值＝0)和48％(E值＝e-162)(Staswick等，Jasmonateresponse locus JAR1 and several related Arabidopsis genes encode enzymes of the firefly luciferasesuperfamily that show activity on jasmonic，salicylic，and indole-3-acetic acids in an assay foradenylation，2002，Plant Cell 141405-1415)。以上证据说明，OsDR2基因的编码产物极有可能是属于对生长素反应的、乙酰腺嘌呤化萤火虫荧光素酶家族。
实施例4OsDR2基因的功能验证和应用1.遗传转化载体的构建所用载体是我们实验室构建的pU1301。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA 1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(图9)。pCAMBIA1301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of MolecularBiology to International Agriculture)惠赠。
采用限制性内切酶消化的方法，将已经克隆的OsDR2基因从重组质粒T5P11上酶切下来，回收外源片段；用T4 DNA Polymerase和Klenow Fragment两种酶抹平酶切片段末端。同时，用选择性内切酶SmaI酶切携带玉米泛素启动子的遗传转化载体pU1301；酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，纯化酶切产物。然后用去磷酸化酶Alk对纯化的酶切产物进行去磷酸化处理。用包含OsDR2基因的酶切片段和去磷酸化的载体做连接反应。通过酶切筛选阳性克隆，并通过限制性内切酶Kpn I酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆。获得的重组质粒载体被命名为D25U。
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transfbrmation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，PlantJournal 6271-282)将D25U导入感病水稻品种牡丹江8号(Oryza sativa ssp.japonica)。农杆菌介导的遗传转化主要步骤和试剂如下(1)试剂和溶液缩写6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]硝酸钾(KNO3) 28.3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4.0g硫酸铵((NH4)2SO4)4.63g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.85g
氯化钙(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6mix母液[100倍浓缩液(100X)]碘化钾(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.15g室温下溶解并定容至1000ml。
3)Fe2EDTA贮存液(100X)在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)烟酸(Nicotinic acid)0.1g维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g维生素B6(Pyridoxine HCl)0.1g甘氨酸(Glycine) 0.2g肌醇(Inositol) 10g加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MSmax母液(10X)硝酸铵(NH4NO3) 16.5g硝酸钾 19.0g磷酸二氢钾 1.7g硫酸镁 3.7g氯化钙 4.4g室温下溶解并定容至1000ml。
6)MSmix母液(100X)碘化钾 0.083g硼酸 0.62g硫酸锰 0.86g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.025g硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.0025g室温下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液(1mg/ml)2，4-D 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)6-BA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。
9)NAA贮存液(1mg/ml)NAA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
10)IAA贮存液(1mg/ml)
IAA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)葡萄糖 125g蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液AS 0.392gDMSO10ml分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液氢氧化钾5.6g蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。
(3)培养基配方1)诱导培养基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X) 10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4-D贮存液2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X) 10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4-D贮存液2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4-D贮存液0.75mlCH 0.15g蔗糖5g
琼脂粉(Agarose) 1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml2，4-D贮存液 0.75mlCH 0.2g蔗糖 5g琼脂粉 1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
5)悬浮培养基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA贮存液(100X) 0.5ml维生素贮存液(100X) 1ml2，4-D贮存液 0.2mlCH 0.08g蔗糖 2g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。
使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-D贮存液 0.625mlCH0.15g蔗糖 7.5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml维生素贮存液(100X) 2.5ml6-BA贮存液 0.5mlKT贮存液 0.5mlNAA贮存液 50μlIAA贮存液 50μlCH 0.15g
蔗糖 7.5g琼脂粉 1.75g加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA贮存液(100X) 10ml维生素贮存液(100X) 10ml6-BA贮存液 2mlKT贮存液2mlNAA贮存液 0.2mlIAA贮存液 0.2mlCH 1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基MSmax母液(10X) 50mlMSmix母液(100X) 5mlFe2+EDTA贮存液(100X) 5ml维生素贮存液(100X) 5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤3.1愈伤诱导(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)15分钟；(2)灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
3.2愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.3预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
3.4农杆菌培养(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105两天，温度28℃；(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
3.5农杆菌侵染(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
3.6愈伤洗涤和选择培养(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)3.7分化(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
3.8生根(1)剪掉分化时产生的根；(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
3.9移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
获得的转基因水稻植株被命名为D25UM8(其中D25U为遗传转化载体名称，M8代表水稻品种牡丹江8号)。本发明共获得独立转基因水稻植株48株。采用剪叶法(Kauffman等，An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae，1973，Plant Dis.Rep.57537-541)对其中30株转基因水稻植株在成株期阶段接种国际上常用的白叶枯病菌菌株PXO61(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor Kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)，发现13株转基因植株的抗性不同程度增强了；与转基因的受体水稻品种牡丹江8号相比，这些抗性增强的转基因植株的病斑长度减短了59-89％，病斑面积(病斑长/病叶长×％)减小29-68％(表2)。
表2.部分携带OsDR2基因的转基因水稻植株对白叶枯病菌菌株PXO61的反应
(1)每株转基因植株接种5片叶，两周后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于5片叶的平均值。本发明是采用组成型、超量表达(玉米泛素)启动子调控OsDR2基因的表达，因此在转基因水稻植株中OsDR2基因的表达不会受病原侵染的影响。为了验证转基因水稻植株的抗性增强是否与转入的OsDR2基因有关，本发明采用RNA杂交技术对部分转基因水稻植株中OsDR2基因的表达进行检测。结果显示OsDR2的表达量与植株的抗性密切相关。在没有病原侵染条件下转基因受体水稻品种(牡丹江8号)、基因供体(C101LAC)和感病转基因植株中都不能检测到OsDR2基因的表达，而抗性增强的转基因植株中都可以检测到OsDR2基因的表达(图10)。这些结果进一步证明OsDR2基因参于水稻抗病反应的调控，并且超量表达OsDR2基因可以增强水稻的抗病性。
转基因水稻植株对稻瘟病菌的抗性也增强。对抗白叶枯病能力增强的转基因水稻植株D25UM8-3、D25UM8-27和D25UM8-28离体接种稻瘟病菌IK81-3进行观察，这三株转基因水稻植株中的病斑面积都明显小于对照植株牡丹江8号，抗稻瘟病能力明显提高(图11)。
序列表SEQ ID NO1<110>华中农业大学<120>水稻抗病相关基因OsDR2<130>
<141>2004-08-12<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2212<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
<221>CDS<222>(26)..(468)<223>
<220>
<221>CDS<222>(563)..(1934)<223>
<220>
<221>Intron<222>(469)..(562)<223>
<400>1ttttcttgtt cggggttgag aggca atg gcg gtg atg act gat gtg tcg acc 52Met Ala Val Met Thr Asp Val Ser Thr1 5acc ggg acg gca ctc cgg acc ccg gcg gcg ggg gcg gtg aag gag ggc100Thr Gly Thr Ala Leu Arg Thr Pro Ala Ala Gly Ala Val Lys Glu Gly10 15 20 25gac gtc gag aag ctc cgg ttc atc gac gag atg acc acc aac gtc gac148Asp Val Glu Lys Leu Arg Phe Ile Asp Glu Met Thr Thr Asn Val Asp
30 35 40gcc gtg cag gag cgc gtc ctg ggg gag atc ctc ggc cgc aac gcc ggc196Ala Val Gln Glu Arg Val Leu Gly Glu Ile Leu Gly Arg Asn Ala Gly45 50 55acg gag tac ctg acc aag tgc ggc ctc gac ggc gcc acc gac cgc gcc244Thr Glu Tyr Leu Thr Lys Cys Gly Leu Asp Gly Ala Thr Asp Arg Ala60 65 70gcc ttc cgg gcc aag gtt ccg gtg gtg tcg tac gac gac ctg cag ccg292Ala Phe Arg Ala Lys Val Pro Val Val Ser Tyr Asp Asp Leu Gln Pro75 80 85tac atc cag cgc att gcg aac ggg gac cgc tcg ccg atc ctg tcc acc340Tyr Ile Gln Arg Ile Ala Asn Gly Asp Arg Ser Pro Ile Leu Ser Thr90 95 100 105cac ccc gtc tcc gag ttc ctc acc agc tcc ggc acg tcg gcc ggc gag388His Pro Val Ser Glu Phe Leu Thr Ser Ser Gly Thr Ser Ala Gly Glu110 115 120cgc aag ctg atg ccc acc atc atg gac gag ctc gac cgc cgt cag ctg436Arg Lys Leu Met Pro Thr Ile Met Asp Glu Leu Asp Arg Arg Gln Leu125 130 135ctc tac agc ctc ctc atg ccg gtc atg aac tt gtaagttgat actactccta 488Leu Tyr Ser Leu Leu Met Pro Val Met Asn Leu140 145tcattgtctc attctgatag cacacacacg tacaagaagc agatgatgat taatggccat 548gaatcattgc atag g tat gtg cct ggg ctt gac aag ggg aag ggg ctc tac 599Tyr Val Pro Gly Leu Asp Lys Gly Lys Gly Leu Tyr150 155 160ttc ctg ttc gtc aag tcg gag acg aag acg ccg gga ggc ctg acg gcg647Phe Leu Phe Val Lys Ser Glu Thr Lys Thr Pro Gly Gly Leu Thr Ala165 170 175agg ccc gtg ctg acg agc tac tac aag agc gac cac ttc aag aac cgg695Arg Pro Val Leu Thr Ser Tyr Tyr Lys Ser Asp His Phe Lys Asn Arg180 185 190ccg tac gac ccg tac cac aac tac acg agc ccg acg gcg gcc atc ctc743Pro Tyr Asp Pro Tyr His Asn Tyr Thr Ser Pro Thr Ala Ala Ile Leu195 200 205tgc gcc gac gcg ttc cag agc atg tac gcg cag atg gtg tgc ggc ctg791Cys Ala Asp Ala Phe Gln Ser Met Tyr Ala Gln Met Val Cys Gly Leu
210 215 220tgc cag cgc aac gac gtg ctg cgc ctc ggc gcc gtg ttc gcc tcc ggc839Cys Gln Arg Asn Asp Val Leu Arg Leu Gly Ala Val Phe Ala Ser Gly225 230 235 240ctc ctc cgg gcc atc cgc ttc ctc cag ctc aac tgg gag cag ctc gcc887Leu Leu Arg Ala Ile Arg Phe Leu Gln Leu Asn Trp Glu Gln Leu Ala245 250 255gac gac atc gag tcc ggc gag ctc acc cct egc gtc acc gac ccg tcg935Asp Asp Ile Glu Ser Gly Glu Leu Thr Pro Arg Val Thr Asp Pro Ser260 265 270gtg cgc gag gct gtc gcc gcc atc ctc ctc ccg gac ccc gag ctc gcc983Val Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile Leu Leu Pro Asp Pro Glu Leu Ala275 280 285aag ctc atc cgc gcc gag tgc tcc aag ggc gac tgg gcc ggc atc atc1031Lys Leu Ile Arg Ala Glu Cys Ser Lys Gly Asp Trp Ala Gly Ile Ile290 295 300acc cgc gtg tgg ccg aac acc aag tac ctc gac gtc atc gtc acc ggc1079Thr Arg Val Trp Pro Asn Thr Lys Tyr Leu Asp Val Ile Val Thr Gly305 310 315 320gcg atg gcg cag tac atc ccg acc ctg gag ttc tac agc ggc ggg ctt1127Ala Met Ala Gln Tyr Ile Pro Thr Leu Glu Phe Tyr Ser Gly Gly Leu325 330 335ccc atg gcg tgc acc atg tac gcg tca tcc gag tgc tac ttc ggc ctc1175Pro Met Ala Cys Thr Met Tyr Ala Ser Ser Glu Cys Tyr Phe Gly Leu340 345 350aac ctc cgc ccc atg tgc gac ccc tcc gag gtg tcc tac acc atc atg1223Asn Leu Arg Pro Met Cys Asp Pro Ser Glu Val Ser Tyr Thr Ile Met355 360 365cct aac atg ggc tac ttc gag ttc ctc ccc gtg gac gag acc ggc gcg1271Pro Asn Met Gly Tyr Phe Glu Phe Leu Pro Val Asp Glu Thr Gly Ala370 375 380gct tcg ggc gac gcc acc cag ctc gtg gac ctc gcc cgc gtg gag gtg1319Ala Ser Gly Asp Ala Thr Gln Leu Val Asp Leu Ala Arg Val Glu Val385 390 395 400ggg cgc gag tac gag ctg gtg atc acc acc tac gcc ggg ctg aac cgg1367Gly Arg Glu Tyr Glu Leu Val Ile Thr Thr Tyr Ala Gly Leu Asn Arg405 410 415
tac cgc gtc ggc gac gtc ctc cgc gtg acg ggg ttc cac aac gcg gcg1415Tyr Arg Val Gly Asp Val Leu Arg Val Thr Gly Phe His Asn Ala Ala420 425 430ccg cag ttc agg ttc gtg cgc cgc aag aac gtg ctc ctc tcc atc gag1463Pro Gln Phe Arg Phe Val Arg Arg Lys Asn Val Leu Leu Ser Ile Glu435 440 445tcc gac aag acc gac gag gcc gag ctg cag cgc gcc gtg gag cgc gcg1511Ser Asp Lys Thr Asp Glu Ala Glu Leu Gln Arg Ala Val Glu Arg Ala450 455 460tcg gcg ctg ctc cgc ccg cac ggc gcg tcc gtg gtg gag tac acc agc1559Ser Ala Leu Leu Arg Pro His Gly Ala Ser Val Val Glu Tyr Thr Ser465 470 475 480caa gcg tgc acc aag cgc atc ccg ggc cac tac gtc atc tac tgg gag1607Gln Ala Cys Thr Lys Arg Ile Pro Gly His Tyr Val Ile Tyr Trp Glu485 490 495ctc ctg acc aag ggc gcc ggc gcc acg gtg gtg gac gcg gac acg ctg1655Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gly Ala Thr Val Val Asp Ala Asp Thr Leu500 505 510ggc agg tgc tgc ctc gag atg gag gag gcg ctg aac acg gtg tac agg1703Gly Arg Cys Cys Leu Glu Met Glu Glu Ala Leu Asn Thr Val Tyr Arg515 520 525cag agc cgc gtc gcg gac ggc tcg att ggg ccg ctc gag atc cgg gtc1751Gln Ser Arg Val Ala Asp Gly Ser Ile Gly Pro Leu Glu Ile Arg Val530 535 540gtc cgc ccg ggc aca ttc gag gag ctc atg gac tac gcc atc tcc cgc1799Val Arg Pro Gly Thr Phe Glu Glu Leu Met Asp Tyr Ala Ile Ser Arg545 550 555 560ggc gcg tcc atc aac cag tac aag gtg cca cgc tgc gtc acg ttc ccg1847Gly Ala Ser Ile Asn Gln Tyr Lys Val Pro Arg Cys Val Thr Phe Pro565 570 575ccc atc gtc gag ctg ctc gac tcg cgc gtc gta tcc agc cac ttc agc1895Pro Ile Val Glu Leu Leu Asp Ser Arg Val Val Ser Ser His Phe Ser580 585 590ccg gcg ctc cca cac tgg act ccg gcg cga cgg tcc gaa tagtcggtca 1944Pro Ala Leu Pro His Trp Thr Pro Ala Arg Arg Ser Glu595 600 605
aatccccacc tcgtcgttgg accgtgtcca agaatctgaa gtagtagaag ccggatgcct2004ccacctaaaa acacttatct gttatttttg gaattaattt tgatggttgc tgtcaactct2064gtcagttagt ggcaagaggg tacctctgat gtgagggaga gaactgcaga acgaacggaa2124gaaagtgttg atgtaagagg ttaccactag tagtactgtt tgtctgtatc aggaatgtga2184ttataattta acctgtcctc caaaaccg 2212<210>2<211>605<212>PRT<213>Oryza sativa<400>2Met Ala Val Met Thr Asp Val Ser Thr Thr Gly Thr Ala Leu Arg Thr1 5 10 15Pro Ala Ala Gly Ala Val Lys Glu Gly Asp Val Glu Lys Leu Arg Phe20 25 30Ile Asp Glu Met Thr Thr Asn Val Asp Ala Val Gln Glu Arg Val Leu35 40 45Gly Glu Ile Leu Gly Arg Asn Ala Gly Thr Glu Tyr Leu Thr Lys Cys50 55 60Gly Leu Asp Gly Ala Thr Asp Arg Ala Ala Phe Arg Ala Lys Val Pro65 70 75 80Val Val Ser Tyr Asp Asp Leu Gln Pro Tyr Ile Gln Arg Ile Ala Asn85 90 95Gly Asp Arg Ser Pro Ile Leu Ser Thr His Pro Val Ser Glu Phe Leu100 105 110Thr Ser Ser Gly Thr Ser Ala Gly Glu Arg Lys Leu Met Pro Thr Ile115 120 125Met Asp Glu Leu Asp Arg Arg Gln Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Met Pro130 135 140Val Met Asn Leu Tyr Val Pro Gly Leu Asp Lys Gly Lys Gly Leu Tyr145 150 155 160Phe Leu Phe Val Lys Ser Glu Thr Lys Thr Pro Gly Gly Leu Thr Ala165 170 175Arg Pro Val Leu Thr Ser Tyr Tyr Lys Ser Asp His Phe Lys Asn Arg180 185 190Pro Tyr Asp Pro Tyr His Asn Tyr Thr Ser Pro Thr Ala Ala Ile Leu195 200 205
Cys Ala Asp Ala Phe Gln Ser Met Tyr Ala Gln Met Val Cys Gly Leu210 215 220Cys Gln Arg Asn Asp Val Leu Arg Leu Gly Ala Val Phe Ala Ser Gly225 230 235 240Leu Leu Arg Ala Ile Arg Phe Leu Gln Leu Asn Trp Glu Gln Leu Ala245 250 255Asp Asp Ile Glu Ser Gly Glu Leu Thr Pro Arg Val Thr Asp Pro Ser260 265 270Val Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile Leu Leu Pro Asp Pro Glu Leu Ala275 280 285Lys Leu Ile Arg Ala Glu Cys Ser Lys Gly Asp Trp Ala Gly Ile Ile290 295 300Thr Arg Val Trp Pro Asn Thr Lys Tyr Leu Asp Val Ile Val Thr Gly305 310 315 320Ala Met Ala Gln Tyr Ile Pro Thr Leu Glu Phe Tyr Ser Gly Gly Leu325 330 335Pro Met Ala Cys Thr Met Tyr Ala Ser Ser Glu Cys Tyr Phe Gly Leu340 345 350Asn Leu Arg Pro Met Cys Asp Pro Ser Glu Val Ser Tyr Thr Ile Met355 360 365Pro Asn Met Gly Tyr Phe Glu Phe Leu Pro Val Asp Glu Thr Gly Ala370 375 380Ala Ser Gly Asp Ala Thr Gln Leu Val Asp Leu Ala Arg Val Glu Val385 390 395 400Gly Arg Glu Tyr Glu Leu Val Ile Thr Thr Tyr Ala Gly Leu Asn Arg405 410 415Tyr Arg Val Gly Asp Val Leu Arg Val Thr Gly Phe His Asn Ala Ala420 425 430Pro Gln Phe Arg Phe Val Arg Arg Lys Asn Val Leu Leu Ser Ile Glu435 440 445Ser Asp Lys Thr Asp Glu Ala Glu Leu Gln Arg Ala Val Glu Arg Ala450 455 460Ser Ala Leu Leu Arg Pro His Gly Ala Ser Val Val Glu Tyr Thr Ser465 470 475 480
Gln Ala Cys Thr Lys Arg Ile Pro Gly His Tyr Val Ile Tyr Trp Glu485 490 495Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gly Ala Thr Val Val Asp Ala Asp Thr Leu500 505 510Gly Arg Cys Cys Leu Glu Met Glu Glu Ala Leu Asn Thr Val Tyr Arg515 520 525Gln Ser Arg Val Ala Asp Gly Ser Ile Gly Pro Leu Glu Ile Arg Val530 535 540Val Arg Pro Gly Thr Phe Glu Glu Leu Met Asp Tyr Ala Ile Ser Arg545 550 555 560Gly Ala Ser Ile Asn Gln Tyr Lys Val Pro Arg Cys Val Thr Phe Pro565 570 575Pro Ile Val Glu Leu Leu Asp Ser Arg Val Val Ser Ser His Phe Ser580 585 590Pro Ala Leu Pro His Trp Thr Pro Ala Arg Arg Ser Glu595 600 60权利要求
1.赋予植物对病害产生抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO1所示序列，或者与SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亚片段。
2.权利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全长的OsDR2基因编码序列，该基因编码的蛋白质具有生长素反应类(乙酰腺嘌呤化萤火虫荧光素酶)蛋白的结构。
3.权利要求1中的DNA片段，其中的基因编码区与其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因经过修饰改造。
4.一种增加植物对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyriculariagrisea Sacc.)抗性的方法，该方法包括将权利要求1的DNA片段连接上合适的启动子转入植物体或将权利要求1的DNA片段和其它的DNA片段组成嵌合基因转入植物或将权利要求1的DNA片段经过修饰改造后转入植物体，增加植物对病原菌的抗性。
5.基因组中包含权利要求1、2、3中的DNA片段的转基因植物和转基因植物种子的应用。
全文摘要
本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片断的分离克隆、功能验证和应用。所述的DNA片断包含水稻抗病相关基因OsDR2，它能够赋予植物抵抗由病原菌引起的病害。将该片段与其外源调节序列直接转入植物体，转基因植物对病原菌的抵抗能力显著增强。
文档编号A01H5/00GK1737143SQ20041000945
公开日2006年2月22日 申请日期2004年8月19日 优先权日2004年8月19日
发明者王石平, 丁新华, 黄丽玲 申请人:华中农业大学