专利名称：水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及农作物分子遗传育种学领域，具体地说，涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子标记方法。
背景技术：
稻痕病是一种世界性的水稻病害，其危害面积与危害程度日趋严重，被称为水稻的癌症。利用分子育种技术选育含有抗稻瘟病基因的品种被认为是控制稻瘟病危害最经济有效的方法。在已公布的抗稻瘟病基因中，水稻品种‘谷梅4号’的Pigm基因是抗谱广且抗性持久的基因之一，对不同地区和国家的30多个强致病菌株中的29个表现出高抗或免疫，效果显著优于目前应用的广谱抗瘟基因Pil、Pi2、Ρ 9等，经湖南稻瘟病病圃多年鉴定，‘谷梅4号’ 一直为高抗品种。目前含Pigm基因的水稻资源非常少，加大对Pigm基因的利 用将促进水稻品种的抗稻瘟病能力。常规的抗稻瘟病育种方法费时费力，且结果不太可靠，而利用分子标记辅助选择育种简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率，带来巨大的社会经济效益。在分子辅助育种中，如果分子标记能满足以下三点则可高效准确应用于分子育种(1)该分子标记为共显性分子标记，如SSR，STS等标记。因为共显性分子标记可以区分杂合体和纯合体，这在下一步的材料杂交选育中可以提供便利，节省选育时间；(2)该分子标记为共分离标记，与目的基因紧密连锁共分离，因为非紧密连锁分子标记与目的基因有一定距离，在育种中可能因为分离而导致检测结果不准确；(3)特异性标记，一些非特异性标记只能区分部分亲本，如果扩大选育亲本的范围，则不能将其用于分子辅助选育，而特异性分子则能用于该基因供体亲本与其他不含该基因亲本的杂交选育，更适用于产业化分子育种。Pigm基因被定位于水稻品种‘谷梅4号’第6号染色体C5483和C0428之间70Kb的片段内，其基因序列尚无相关报道，而有关该基因的分子标记或为显性标记或为非紧密连锁标记，如果能建立与抗稻瘟病基因Pigm共分离的特异性分子标记，则对促进Pigm基因在育种中的应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子标记方法。通过检测与抗稻瘟病基因Pigm紧密连锁的分子标记，可以确定水稻亲本或杂交后代是否含有高抗稻瘟病基因Pigm，预测水稻植株的稻瘟病抗性，加快抗稻瘟病水稻新品种的选育进度。为了实现本发明目的，本发明的一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子标记方法，包括以下步骤I)提取待测水稻的基因组DNA ；2)用选自下表中的一对或多对引物，对水稻基因组DNA进行PCR扩增；
权利要求
1.水稻抗稻瘟病基因Pigrn的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤 1)提取待测水稻的基因组DNA； 2)用选自下表中的一对或多对引物，对水稻基因组DNA进行PCR扩增； 分子标记I引物名· I引物細则 G1408F ATAGGCAAGTGCAGGTTG IZG1408 -—-----392G1408R GATGGCTAATACTGAACAAGAA G2997F ATCTC ATCC ACGAAACAT ~ZG2997 ———--679 _ G2997R CAGCGACAACTTGAACTA__ G2723F CCACGCTCATCCATTCCT^ ' G2723R ^^GCcACCTCwrCATCCACTA __mm G530IF CAGTG Λ Λ ACGAACGCTAT. G5301 -^--485 j G5301R ATCTCCACAAGGGACACC 3)检测PCR扩增产物，如果扩增出对应大小的特异性分子标记片段，则表明抗稻瘟病基因Pigm的存在。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以25μ I计为=IOXPCR反应缓冲液 2. 5 μ l,25mM MgCl2 2 μ I, IOmM dNTPO. 5 μ 1，25mM 引物 F 和 R 各 O. 5 μ 1，DNA 20ng,Taq DNA 聚合酶 O. 2 μ I，加 ddH20 补足至 25 μ I。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为95°C8分钟；95°C30秒，55°C 30秒，72°C I分钟，共35个循环；72°C 10分钟。
4.权利要求1-3任一项所述方法在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用。
5.用于检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括选自以下引物对中的一对或多对引物i ) G1408F 5' -ATAGGCAAGTGCAGGTTG-3'G1408R 5/ -GATGGCTAATACTGAACAAGAA-3'；ii ) G2997F 5' -ATCTCATCCACGAAACAT-3'G2997R 5/ -CAGCGACAACTTGAACTA-3'；iii) G2723F 5/ -CCACGCTCATCCATTCCT-3' G2723R 5/ -TGCCACCTCATCATCCACTA-3';以及 iν ) G5301F 5' -CAGTGAAACGAACGCTAT-3'G5301R 5/ -ATCTCCACAAGGGACACC-3'。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
全文摘要
本发明提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的分子标记方法，共筛得4个特异性分子标记G1408、G2997、G2723和G5301。利用这4个与抗稻瘟病基因共分离的特异性分子标记，对水稻亲本或杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，凡检测到含有4个特异分子标记中任意一个标记的水稻植株则可作为含高抗稻瘟病Pigm基因的育种材料。该方法操作简便，检测结果准确，可满足高通量分子标记辅助育种的要求。
文档编号C12Q1/68GK102899400SQ20121032587
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者戴小军, 杨远柱, 陈良碧, 胡小淳, 秦鹏, 符辰建 申请人:袁隆平农业高科技股份有限公司, 湖南师范大学, 湖南亚华种业科学研究院