专利名称：源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病理学、农药学和微生物基因工程领域，提供了一个来源于稻瘟病菌的、在营养生长、孢子产生、附着胞形成与致病性中起重要作用的新基因mgATG5的启动子与编码区的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。本发明提供的核苷酸序列和氨基酸序列可以作为靶标应用于抗真菌药剂的筛选与设计中，也可以利用该核苷酸序列的某一区段作为探针或利用该蛋白制备的抗体应用于稻瘟病菌及其他真菌的与该序列具有一定同源性的基因的克隆中。
背景技术：
由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是世界性的一种水稻上的毁灭性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在10～30％之间。我国几乎每年都有稻瘟病菌的流行爆发。最近的2005年，四川省和重庆市遭受到10年来最严重的稻瘟病，四川省共有20个市、127个县的230万亩稻田发生稻瘟病，重庆市共有100多万亩稻田发生稻瘟病菌；这次稻瘟病流行迅速、危害程度重、发病水稻品种多、对水稻产量影响严重。除了水稻外，稻瘟病菌也能侵染其它50多种禾本科植物，也对小米(Eleusine coracana)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)等重要农作物造成严重的危害。稻瘟病菌也是一种研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的模式生物，具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环，包括孢子产生、萌发、附着胞形成、侵染栓形成、侵入菌丝生长等致病过程；许多发达国家正在进行研究其致病分子机制，期望通过此类研究设计出新型农药筛选的药靶，从而开发、设计新型抗真菌药物。
稻瘟病菌的生活史包括有性阶段和无性阶段。有性阶段由2个不同交配型的菌株交配后产生子囊和子囊孢子。稻瘟病菌的交配型由交配基因MAT1-1和MAT1-2控制。无性阶段为营养菌丝分化产生分生孢子梗和梨形分生孢子。在自然界，稻瘟病菌主要通过无性阶段完成生活史，而分生孢子是植物的主要侵入源。
稻瘟病菌无性孢子落到水稻叶片表面后，侵染过程开始。当孢子与水相遇后，孢子顶端分隔内的粘胶释放出来，使孢子紧紧粘附在水稻叶片表面。水稻叶片表面具有一层蜡质角质膜，该膜具有很大的疏水性，而粘胶使孢子粘附在这一疏水的排斥性表面。粘附后2小时内，孢子萌发并产生芽管。芽管通常从孢子的一个顶端细胞伸出并生长。芽管顶端也分泌一种粘胶物质，使芽管紧紧粘附在植物叶片表面，防止被水滴冲走。4小时内，芽管生长停止，顶端钩状体形成并膨大形成附着胞。基质的硬度是芽管分化的一个重要因子，如稻瘟病菌孢子仅在硬的固体表面形成附着胞，而不能在液体表面或软基质表面形成附着胞。而基质疏水表面也通过类似于水稻叶片表面的蜡质的作用激发附着胞的形成。在孢子萌发后不久，产生芽管的细胞进行一次有丝分裂。一个细胞核留在孢子内，而另一个细胞核通过芽管移动，与孢子和芽管的细胞质内容物一起转移到形成中的附着胞。这些细胞质内容物包括储存在正在发育的附着胞中央大液泡的脂滴。然后，在附着胞和芽管之间形成隔膜。随着附着胞成熟，附着胞细胞壁出现黑色素沉积，最终形成黑色素层。黑色素层允许水分子自由通过，但溶解于水的物质不能自由通过，从而让附着胞建立并维持一个很大的细胞内膨压。附着胞的黑色素化过程完成后，附着胞产生一根狭小的菌丝--侵染栓。侵染栓对水稻叶片的穿透由于附着胞产生巨大的膨压而得以完成。膨压只要稍微降低就会阻止附着胞在人工表面或水稻叶片表面穿透。测量结果表明附着胞膨压达到8.0Mpa，相当于40倍汽车轮胎的压力。附着胞黑色素层的作用在于限制了细胞壁的渗透性，有利于细胞内渗透物质的积累和膨压的产生。甘油是一种可溶性物质，产生的渗透势足以使附着胞产生巨大的膨压。在膨压产生过程中，甘油在细胞内累积浓度超过3M。
侵入后，侵染栓分化成侵染菌丝，迅速在水稻叶片内生长并侵染其它细胞。侵入72小时后，病原菌生物量已经达到感染叶片的10％。5～7天后，分生孢子梗上分化出大量新的分生孢子，并从病斑释放出来。这些新形成的孢子被潮湿的空气带到邻近的植物开始新的侵染过程。在冬天，稻瘟病菌以菌丝和分生孢子形式在稻草和稻谷上越冬，完成侵染循环。
稻瘟病菌的致病过程是一个复杂的分子过程。目前已经克隆了许多与稻瘟病菌致病性相关的基因，如MPG1、CPKA、PMK1、MAGB、PLS1、SMO1、PDE1、MPS1、PTH11、CBP1、ICL1、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1。其中多数与附着胞形成有关，如PMK1、MAGB、MAC1等；部分参与黑色素的形成和积累(ALB1、RSY1、BUF1等)以及甘油合成相关(ICL1等)；少数与稻瘟病菌的穿透相关(MPS1、PLS1、PDE1等)。稻瘟病菌芽管分泌的一种疏水蛋白，由MPG1基因编码，参与菌丝和水稻叶表的互作，为形成正常的附着胞所必须(Talbot，1999)。MAGB基因编码的异源三聚G蛋白的α亚单位和MAC1编码的cAMP环化酶也是形成附着胞所必需的(Liu and Dean，1997；Choiand Dean，1997；Kulkarni and Dean，2004)。CPKA基因编码的cAMP依赖性蛋白激酶A的催化亚单位PKA-c是附着胞穿透所必须的(Mitchell & Hamer，1995；Xu et al，1997)，而正在分化的芽管中的PKA活性对于形成正常的附着胞也非常关键(Adachi & Hamer1998)。同样，有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)基因PMK1是附着胞形成所需的(Xu & Hamer 1996)。黑色素合成系列基因也证明是附着胞穿透所不可缺少的(Chumley and Valent，1990；Motoyama等，1998)。在各种突变子库中也发现了一些突变子缺失致病性，如编码一种与ATP运输体(ATP-bindingcassette transporters)相关的蛋白的ABC1基因(Urban等，1999)、编码P-型ATP酶的PDE1基因(Balhadere等，1999，2001)和编码tetraspannin样蛋白的PLS1基因(Clergeot等，2001)。尽管如此，稻瘟病菌的分子致病机制还是不清楚。
鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为设计、筛选抗真菌药物提供有用的靶标位点。目前已经在包括稻瘟病菌在内的一些真菌中证明了一些药物的靶点，如三环唑是一种很重要的稻瘟病菌杀菌剂，其作用是抑制黑色素的合成，靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶；多肽杀菌剂sorphen A的作用靶点是青霉的的脱甲基酶(CYP51)。因此，利用分子生物学技术鉴定、克隆新的在稻瘟病菌的致病过程中具有重要功能的致病性基因，可以为设计、筛选新的抗真菌药物提供有用的药物靶点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的、对稻瘟病菌等真菌的菌丝生长、分生孢子产生、分生孢子发芽、附着孢形成和侵染栓形成以及致病性有重要影响的基因mgATG5及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5，该基因的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO1。
本发明同时提供了上述基因mgATG5编码的cDNA序列，该cDNA序列具有SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。
本发明同时提供了上述基因mgATG5编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
本发明同时提供了上述基因mgATG5的启动子，该启动子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了利用上述基因mgATG5的表达作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
本发明还提供了利用上述蛋白质的表达与修饰作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
本发明还提供了结合利用上述蛋白质以及启动子作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物的中应用。
本发明的基因mgATG5及该基因编码的蛋白质序列，以其全长核苷酸为探针，通过杂交分离源于其它病原真菌的具有相同功能的基因；或以序列设计引物，通过PCR分离源于其它病原真菌的具有相同功能的基因；或以其编码的蛋白质，杂交分离源于其它病原真菌的具有相同功能的蛋白。上述真菌包括禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦颖枯病菌(Stagonospora nodorum)。
本发明所称的抗真菌药物包括抗稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦颖枯病菌(Stagonospora nodorum)的药物。
本发明利用基因敲除和基因互补证明了稻瘟病菌中一个对稻瘟病菌附着胞的穿透过程以及致病力具有关键性作用的基因mgATG5。该基因的启动子、编码蛋白的表达和修饰可以作为新农药设计和筛选的药物靶点。
本发明的基因mgATG5是通过cDNA差减文库从稻瘟病菌中克隆的。具体过程包括通过筛选稻瘟病菌cDNA的SSH差减文库获得在菌丝或附着孢中差异表达的EST序列。通过RT-PCR验证目的基因在稻瘟病菌菌丝、孢子、附着孢中的存在情况。通过高保真长距离PCR从稻瘟病菌基因组DNA中获得目的基因。通过PCR或以该基因的EST序列为探针从稻瘟病菌cDNA文库验证和分离目的基因的完整的cDNA。目的基因的功能验证和注释通过目的基因的敲除和互补恢复来完成。目的基因在稻瘟病菌内的作用位点通过目的基因与报告基因GFP的融合蛋白在细胞的位置来确定。基因启动子的测定是将启动子与报告基因GFP连接，通过观察GFP在启动子指导下在稻瘟病菌的各个发育阶段的表达来进行的。
本发明所涉及的稻瘟病菌SSH差减文库是指利用SSH技术(Suppression subtractivehybridization，SSH)构建的、含有若干独立克隆的稻瘟病菌cDNA文库。
本发明所涉及的RT-PCR分析是指根据cDNA序列设计引物，对基因缺失突变子和互补恢复突变子的mRNA逆转录形成的cDNA进行PCR扩增，分别验证基因缺失突变子和基因互补恢复突变子中基因缺失和恢复后的转录本等情况。
本发明所涉及的目的基因克隆是指根据SSH文库中获得的EST序列，以此设计探针从cDNA文库中筛选cDNA克隆，对获得的cDNA克隆进行测序；并利用cDNA序列比对基因组数据库中DNA序列，以此设计引物从稻瘟病菌基因组DNA扩增获得基因的DNA序列，克隆到T载体中，进行测序；根据获得的DNA序列利用程序分析其转录序列，并以此设计引物从稻瘟病菌cDNA文库中扩增获得基因的cDNA序列，连接到T载体中，进行测序分析。
本发明所涉及的Shouthern杂交分析是指利用基因侧翼的DNA序列作为探针，对所获得的基因敲除转化子和基因恢复转化子分别进行Southern杂交，以分析基因敲除转化子的基因缺失情况和敲除载体的插入拷贝数，以及分析基因互补恢复转化子基因插入拷贝数等情况。
本发明所涉及的目的基因的功能确定是通过mgATG5的敲除和恢复进行的。具体的mgATG5基因的敲除过程包括敲除载体的构建，将敲除载体转入稻瘟病菌，得到基因敲除突变子；mgATG5的基因敲除突变子的互补恢复过程包括互补载体的构建，互补载体导入基因敲除突变子菌株，得到基因恢复的转化子。基因敲除载体的构建是指将待敲除基因的两侧翼的一段DNA片段各自连接到含潮霉素抗性基因载体的潮霉素抗性基因的两侧。基因互补载体的构建是指将含有目标基因的全长的DNA片段与带有一个不同于潮霉素抗性基因的筛选标记(本发明中是草胺磷抗性基因)的载体连接。在本发明中将外源载体导入稻瘟病菌的优选方法是原生质体转化，实验者也可以根据自己的情况选用其它方法如ATMA法、基因枪法等。本发明中，基因敲除载体所导入的稻瘟病菌菌株是野生型菌株Guy11，实验者也可以选用其它稻瘟病菌野生型菌株，基因缺失使突变子的表型发生不同于原来野生型的变化，对水稻等植物的致病性丧失。本发明中，基因互补载体所导入的菌株是本发明所得到的基因缺失突变子，互补载体在该基因缺失突变子基因组中的异位整合使该突变子的表型恢复正常。
本发明所提供的mgATG5的cDNA克隆过程包括从SSH差减文库中筛选含有目标基因mgATG5的cDNA克隆，获得其EST序列，利用其EST序列从稻瘟病菌基因组数据库中获得相对应的一段DNA序列，在根据其序列设计引物从稻瘟病菌基因组DNA中扩增到目标基因的DNA片段，测序获得其DNA序列，利用GenScan(http//genes.mit.edu/genscan.html)进行启动子、编码区和加尾点的预测。根据预测的转录本序列设计引物，并通过PCR从稻瘟病菌cDNA文库中扩增获得，其序列如SEQ IDNO2所示。
本发明还提供了mgATG5编码的蛋白质，其具有如SEQ ID NO3所示氨基酸序列或与SEQ IDNO2所示的序列具有42％以上的序列一致性的并具有相似功能的氨基酸序列。该蛋白可以源于稻瘟病菌，也可以源于其它病原真菌。本发明提供了禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦颖枯病菌(Stagonosporanodorum)的中具有与mgATG5蛋白具有42％以上氨基酸序列一致性的同源蛋白的氨基酸序列。
本发明所涉及的基因因为同源重组造成的基因缺失突变导致稻瘟病菌产孢量下降、孢子萌发和附着胞形成延迟、附着胞膨压降低和侵入栓形成率降低，并且在感病水稻品种上的致病力缺失。因此，本发明最重要的用途是应用上述成果，设计和筛选能够破坏该基因的表达、剪切及其编码蛋白的表达的化合物，或设计和筛选能对该蛋白的氨基酸序列进行修饰的化合物，从而开发出新的抗真菌药物。此外，本发明的用途还包括利用该基因的DNA或cDNA序列作为探针在其它真菌中分离与该基因具有一定序列同源性的序列。
以上述所克隆基因编码蛋白的表达、修饰为靶标，设计、筛选新型抗真菌药物，或者以具有如SEQ ID No3所示序列或与SEQ ID No3具有42％以上序列一致性的并具有相似功能的蛋白中任一区域的氨基酸序列设计多肽，并制备抗体用于检测在化合物处理状况下蛋白的表达，均属于本发明的保护范围之内。
以上述所克隆基因的启动子为靶标，设计和筛选新型抗真菌药物，也属于本发明的保护范围之内。
因此，本发明具有以下优点1、附着胞是稻瘟病菌侵入寄主植物的重要结构，附着胞膨压是稻瘟病菌穿透寄主植物表皮角质层的主要机械力量，mgATG5基因参与稻瘟病菌附着胞膨压的产生，mgATG5基因与稻瘟病菌的致病性密切相关，mgATG5失活或缺失，导致稻瘟病菌附着胞膨压下降，致病性丧失。因此mgATG5基因在稻瘟病菌致病过程中作用重大。
2、稻瘟病菌借助分生孢子在水稻等植物叶片之间传播，分生孢子是稻瘟病菌致病循环中的一个环节，消灭分生孢子从而切断致病循环是防止病菌流行的一个有效措施。mgATG5参与稻瘟病菌分生孢子的形成过程，mgATG5失活或缺失，导致稻瘟病菌分生孢子形成率显著下降(约为野生型的4.5％)，可以有效抑制稻瘟病的流行和爆发。因此mgATG5基因在稻瘟病菌致病过程中作用重大。
3、mgATG5为开发新的抗真菌药物提供了特异的药物作用靶标，针对mgATG5作为药物开发的靶标药靶，通过对大量化合物进行筛选，可以找到能够与药靶起作用的物质，这些物质可以被用做阻止真菌侵染。由于药靶的特异性，筛选到的抗真菌药物一般对于动物和植物的毒性较小。
图1是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补转化子ATG5-HB1在水稻感病品种CO39上的致病性比较图。Guy11为野生型菌株，ΔATG5为mgATG5基因缺失突变子，ATG5-HB1为mgATG5基因互补恢复转化子，明胶为0.2％(w/v)的明胶对照溶液。喷雾接种的孢子浓度为1×105/ml，接种后7天拍照。
图2是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补转化子HB24在大麦表皮上侵入栓形成比较图。Guy11为野生型菌株，ΔATG5为mgATG5基因缺失突变子；24h、48h、72h、96h为接种后拍照时间。离体点接种的孢子浓度为1×105/ml。
图3是基因敲除载体构建示意图。
图4是基因互补载体构建示意图。
图5是基因敲除位置和过程示意图。
图6是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补突变子ATG5-HB1形成的附着胞膨压(附着胞塌陷率)大小比较图，为孢子接种24h后附着胞在不同甘油浓度溶液(1M、2M、3M和4M)中的细胞塌陷率。
图7是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补突变子ATG5-HB1的分生孢子形成率比较图。稻瘟病菌菌株在CM固体培养基上培养11天后，用直径为0.7CM的打孔器打取菌丝片，统计孢子的数量；单位为×104个孢子/片。
图8是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补转化子ATG5-HB1的孢子萌发率(％)比较图。
图9是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补转化子ATG5-HB1的附着孢形成率(％)比较图。
图10是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补转化子ATG5-HB1在MM培养基、缺氮培养基、缺炭培养基上的生长速度比较图。MM为MM培养基，MM-N为缺氮培养基，MM-C为缺炭培养基；测定的菌落直径为生长12天时的菌落直径。
图11是mgATG5基因编码蛋白的细胞质定位图。mgATG5-GFP融合蛋白分布于细胞质中，在某些位置呈点状分布，左侧为明视场下拍摄，右侧为暗视场下拍摄。左上(A)为普通光镜下的孢子照片，右上(B)为荧光显微镜下的孢子照片，左中(C)为普通光镜下的菌丝照片，右中(D)为荧光显微镜下的菌丝照片，左下(E)为普通光镜下的附着胞照片，右下(F)为荧光显微镜下的附着胞照片。
图12是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5及mgATG5互补转化子ATG5-HB1形成的孢子中的糖原颗粒比较图(电镜照片)。上图(A)为野生型菌株Guy11，中图(B)为mgATG5基因缺失突变子ΔATG5，下图(C)为mgATG5互补转化子ATG5-HB1。
图13是野生型菌株Guy11与mgATG5基因缺失突变子ΔATG5在缺氮培养基中自噬泡形成的比较图。上图为野生型菌株Guy11菌株自噬泡形成的照片，中图为mgATG5基因缺失突变子菌株自噬泡形成的照片，下图为mgATG5互补转化子ATG5-HB1自噬泡形成的照片。
图14是几种病原真菌中ATG5蛋白的序列比较图(Phylip tree，NJ)。图示说明mgATG5、fgATG5、ssATG5、snATG5分别为来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦颖枯病菌(Stagonospora nodorum)的ATG5蛋白。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
实施例1与稻瘟病菌致病性相关的基因的克隆1、SSH文库筛选稻瘟病菌附着胞cDNA与产孢菌丝cDNA差减后获得的差减cDNA，克隆到T载体，测序获得cDNA序列，将获得的序列与稻瘟病菌数据库比较，确定获得的差异表达基因，并用RT-PCR验证差异表达特异性。
2、mgATG5 cDNA的克隆取保存在-20℃的稻瘟病菌Guy11菌株的附着胞cDNA文库，根据预测的基因cDNA序列设计合成PCR引物，扩增包含整个基因编码区在内的基因cDNA片段，克隆到T载体，测序获得mgATG5 cDNA的序列，其序列如SEQ ID2所示。
3、mgATG5基因组DNA的克隆取保存在-20℃的稻瘟病菌Guy11菌株的基因组DNA，根据预测的基因DNA序列设计合成PCR引物，扩增包含整个全长基因的DNA片段，克隆到T载体，测序获得mgATG5基因组DNA的序列，其序列如SEQ ID1所示。
实施例2mgATG5基因缺失突变子的获得和鉴定1、基因敲除载体的构建将mgATG5基因上游和下游的长约500～2000bp的DNA片段分别插入到含有潮霉素抗性基因的载体中潮霉素抗性基因的两侧，如图3和图5所示。具体如下采用高保真PCR的方法分别从稻瘟病菌DNA基因组中扩增mgATG5基因上游和下游的长约500～2000bp的DNA片段，先连接到T载体上；然后上游DNA片段用限制性内切酶XhoI和SalI从T载体上切下，插入到含有潮霉素抗性基因的pBShph1载体的同样酶切位点上；接着下游DNA片段也从T载体上用限制性内切酶SpeI和XbaI从T载体上切下，插入到上述已经插入上游DNA片段的pBShph1载体的SpeI和XbaI位点上，即获得mgATG5基因敲除载体。含有潮霉素抗性基因的pBShph1载体的构建过程先采用高保真PCR的方法从pCB1003质粒中扩增到潮霉素抗性基因(HPH或HygBr)，连接到T载体上；然后用限制性内切酶HindIII和SalI切下，并插入到pBS质粒的同样酶切位点中，即获得pBShph1载体。
2、稻瘟病菌原生质载体的制备和DNA转化稻瘟病菌菌株先在CM平板上生长6天左右。切取两个直径约3cm的菌落，置于150mL CM液体培养基中，用捣碎器将其捣碎；然后均匀分装到两瓶200mL CM液体培养基中，28℃，125rpm，培养48小时。四层纱布过滤收集菌丝，用无菌水冲洗两遍，将水分压干。菌丝在酶解液(Glucanex，酶液浓度7.5mg/mL，0.7M NaCl溶液)酶解2-3hr中30℃，80rpm。取出酶解液，三层滤纸过滤，0.7M NaCL洗涤，除去残渣，滤液收集到50mL的离心管中。4℃，3000rpm，离心10min。用10-20mL STC(1.2M Sorbitol，10mM Tris-HCL PH7.5，20mM CaCL2)悬浮沉淀。4℃，3000rpm，离心10min；重复两次。取适量的STC悬浮沉淀，使终浓度为0.5～1.0×108个/mL。每个50ml离心管分装150μl原生质体，加入2μg线性化DNA，室温下放置25min。逐滴加入1mL PTC(60％PEG4000，10mM Tris-HCL PH7.5，20mMCaCL2)，混匀，室温放置25min。缓慢加入5mL OCM液体培养基(CM液体培养基中加入1.2M Sorbitol/1M Sucrose)，轻轻摇匀，置于28℃，100rpm，摇过夜。每管过夜培养的原生质体中加入含有200μg/mL潮霉素的固体OCM Top培养基(CM液体培养基中加入20％Sucrose，琼脂粉1g)，混匀，倒入已铺有OCM Bottom培养基(CM液体培养基中加入20％Sucrose，琼脂粉1.5g)的平板，每管铺三个平板。黑暗，28℃，培养约一周左右，挑取转化子，接种到含有200μg/mL潮霉素的固体CM上。
3、mgATG5基因缺失突变子的鉴定提取具有潮霉素抗性的转化子DNA，用PCR、Southern杂交等方法验证转化子。
实施例3、mgATG5基因缺失突变子的互补恢复将mgATG5基因的全长DNA序列连接到带有草胺磷抗性基因的载体中，如图4所示。具体为采用高保真长片段PCR方法(LD PCR)从稻瘟病菌基因组DNA中扩增得到含有mgATG5基因全长编码区、启动子区域和终止区区域的DNA片段，先插入到pCR-XL-TOPO载体中，然后再用限制性内切酶NotI和MluI从TOPO载体中切下该DNA片段，插入到含有草胺磷抗性基因的pBARKS1载体的NotI和MluI位点，即构建成mgATG5基因的互补恢复载体——pBAR-ATG5载体。在进行DNA的原生质转化前，pBARATG5载体在用限制性内切酶NotI酶切线性化。
然后按照实施例2的方法，将线性化的此mgATG5基因的互补载体转化mgATG5基因缺失菌株原生质体。挑取具有草胺磷抗性的转化子接种到含有草胺磷的固体CM上。提取具有草胺磷抗性的转化子DNA和RNA，用RT-PCR、Southern杂交等方法验证转化子。
通过以下方法比较了基因恢复后表型的变化状况在完全培养基上比较了mgATG5基因突变子和互补恢复转化子(即互补突变子或互补转化子)的产孢量变化(见图7)；比较了mgATG5基因突变子和互补恢复转化子孢子的萌发变化(见图8)；比较了mgATG5基因突变子和互补恢复转化子的附着孢形成率的变化(见图9)；比较了mgATG5基因突变子和互补恢复转化子形成的附着孢的膨压变化(见图6)；比较了mgATG5基因突变子和互补恢复转化子形成的菌丝自噬泡形成情况(见图13)；比较了mgATG5基因突变子和互补恢复转化子形成的孢子的糖原含量变化(见图12)；在MM培养基、缺氮培养基、缺碳培养基上比较mgATG5基因突变子和互补恢复转化子的生长变化(见图10)；互补转化子致病性的恢复见图1。
实施例4mgATG5基因缺失突变子和互补突变子的致病性测定1、喷雾接种大麦或水稻CO39种子种于花钵泥土中，培养8天(大麦)或14天(3～4叶期的水稻CO39植株)。从培养12天的CM平板上洗取稻瘟病菌野生型菌株、突变子和互补转变子的孢子，孢子浓度用0.2％(wt/v)的明胶稀释至1×105/ml。用微型的油漆喷雾器将孢子悬浮液喷雾接种到植株叶片表面。同时，以0.2％的明胶作为阴性对照喷雾接种。接种植物放在一个潮湿箱子内，于25℃黑暗环境中保湿培养24小时(大麦)或48小时(水稻)。然后接种植物放入人工气候箱(25℃，80％以上湿度，12小时光照周期)内继续培养至第4天(大麦)或第7天、第14天(水稻)，使植物病症充分显示。拍照记录植物叶片的稻瘟病症状，并根据Bonman等(1986)报道的方法记录和评价植物的病症严重程度。同时，从每株受试植物中挑选一片受感染最严重的叶片，记录叶片上5cm长的一段区域内的稻瘟病菌病斑。结果见图1。
2、离体接种大麦种子种于花钵泥土中，培养7～10天。从培养12天的CM平板上洗取稻瘟病菌野生型菌株、突变子和互补转变子的孢子，稀释至孢子浓度为5×104/ml或1×105/ml。孢子液20μl一滴点接种于离体大麦叶片上表面。在人工气候箱内保湿光照培养(光照/黑暗，12h∶12h)，25℃。分别在培养24h，48h，72h和96h后，取出部分叶片观察。先观察病斑形成情况，并拍照记录。然后剪取部分病斑放入甲醇溶液中固定并脱去叶绿素。病斑叶片在甲醇溶液中固定24小时(室温)后，移入乳酚油固定透明液(乳酚油∶95％乙醇＝1∶2)室温固定1小时。乳酚油配方为乳酸20ml、苯酚20ml、20％甘油40ml、蒸馏水20ml。病斑叶片再用苔酚蓝/苯胺蓝(0.01％苔酚蓝/0.06％苯胺蓝，乳酚油)染色5～10分钟。染色叶片在乳酚油中脱色。在显微镜下观察病斑发展情况，统计24h和48h的附着胞穿透率、以及侵入菌丝的生长和次生孢子的产生情况，并拍照记录。结果见图2。
实施例5mgATG5的亚细胞定位将GFP基因的完整编码区序列连接到不带终止密码子的mgATG5基因编码区的下游，构建成融合基因并连接到带有潮霉素抗性基因的载体中。按照实施例2的方法，将线性化的此载体转化野生型Guy11菌株原生质体。挑取具有潮霉素抗性的转化子在荧光显微镜下观察mgATG5-GFP融合蛋白在稻瘟病菌细胞中的分布。结果表明mgATG5定位于细胞质中，在有些细胞器中数量比较大。结果见图11。
实施例6mgATG5启动子的界定和表达分析将GFP基因的完整编码区序列连接到mgATG5基因编码区上游(不含编码区序列)的一段DNA序列后，构建成融合基因并连接到带有潮霉素抗性基因的载体中。按照实施例2的方法，将线性化的此载体转化野生型Guy11菌株原生质体。挑取具有潮霉素抗性的转化子在荧光显微镜下观察mgATG5启动子指导下的GFP蛋白在稻瘟病菌不同发育阶段的表达情况。mgATG5启动子序列见SEQ ID NO4所示。
实施例7真菌ATG5蛋白的生物信息学分析为了明确ATG5蛋白在其他病原真菌中是否保守，针对下列病原真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦颖枯病菌(Stagonospora nodorum)，将mgATG5蛋白的氨基酸序列对这些真菌的蛋白序列进行Blastp检索，获得上述病原真菌的同源蛋白的氨基酸序列，其序列分别如SEQ ID 5、6和7所示，并将这些蛋白分别命名为fgATG5、ssATG5和snATG5。序列分析表明上述真菌的ATG5蛋白在氨基酸序列上与mgATG5蛋白的一致性分别达到59％，54％和42％。利用clustalw程序(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)绘制的上述真菌的ATG5蛋白的同源性关系图(Phylip tree)见图14。
实施例8利用mgATG5蛋白的表达或修饰作为靶标，筛选抗真菌的药物。
把稻瘟病菌在液体完全培养基中大量培养，收集菌丝后分成若干小份，每一份中加入待筛选的化合物或候选药物继续在完全培养基培养数小时，然后在缺氮培养基中(同时也加入待筛选的化合物或候选药物)继续诱导培养2小时左右，取菌丝在相差显微镜下观察菌丝的自噬泡形成状况(图13)，或者菌丝利用常规电镜制片方法制成超薄切片后在电子显微镜下观察自噬泡的形成状况。如果mgATG5蛋白发生被候选药物修饰事件而失去活性，则菌丝不形成自噬泡。获得的化合物再利用实施例4的方法，测定野生型稻瘟病菌在这种化合物存在的条件下对水稻的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。
实施例9利用mgATG5的表达作为靶标，筛选抗真菌的药物。
把稻瘟病菌在液体完全培养基中大量培养，收集菌丝后分成若干小份，每一份中加入待筛选的化合物或候选药物继续在完全培养基培养数小时，然后在缺氮培养基中(同时也加入待筛选的化合物或候选药物)继续诱导培养2小时左右，提取菌丝的RNA，采用实时定量PCR的方法检测mgATG5的表达状况。如果mgATG5的表达被候选药物抑制，则菌丝细胞内没有mgATG5的转录本或mgATG5的转录本显著减少。获得的化合物再利用实施例4的方法，测定野生型稻瘟病菌在这种化合物存在的条件下对水稻的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。
实施例10利用mgATG5的启动子作为靶标，筛选抗真菌的药物。
把mgATG5的启动子与荧光蛋白GFP构建成融合蛋白载体，或把mgATG5的启动子与荧光蛋白GFP以及mgATG5蛋白一起构建成融合蛋白载体，通过实施例2的方法转入到稻瘟病菌中，然后把在mgATG5的启动子调控下的GFP表达的稻瘟病菌转化子菌株在液体完全培养基中大量培养，收集菌丝后分成若干小份，每一份中加入待筛选的化合物或候选药物继续在完全培养基培养数小时至数天，取菌丝在荧光显微镜下观察菌丝的GFP的绿色荧光表达情况。如果mgATG5的启动子的被化合物抑制而失去活性，则GFP蛋白不表达从而菌丝失去绿色荧光。获得的化合物再利用实施例4的方法，测定野生型稻瘟病菌在这种化合物存在的条件下对水稻的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO1CTCTAGGGGG TTGCAGTGCG TTCGTCACGC GTAAGGCTTC CTCGGCCAGT AAGATGGTGT 60GCTGGGGGGA CTTTTCTTTC TGACCTGGAA TCACTCACTG CTGGTTGCTT GCCAAGCTTG 120CTTGCTCGGA AAGGGGTTAA TACAAAACCA GCTAGAAAAA AAAAAAGATC TACAAATGGT 180GCATGTCTCA TCGCGGGAAC GTGAATGGTT CGTTTTGCTG GCTGTAGTCT GTACCTCTAA 240TTTCTTTTTT TTTCTTTTTT CCCCGGTGGC TTTTTGGATT CCCTCACTGC AAAAAAGAGA 300TGGAAGCGAG TGCAACCTGA TAGTGGCTAC ATGCCAACCT AGCTAGCTAT ACATCCTTTT 360ACAGCCTGGG CCATTTGAAT TCGGCGGGCA AGCGGGGTTA ATGGTACTCT CTCTGGTTTT 420TGGTAGTGGT TCCCTGGTTT GCGGAGGTGA AATGGCAGCT GTCATCCCAA ACATACGGAG 480TAAACTGATC ACAGCAAAGT GAGAAGGGGG GATGTGATCC GGATCACGGC AATGAGCTAG 540TCCCTACCTA CAGGCAGTGC CTGCCTACCA ATAGCTCGTA CAGAAAATCC CTGCCCCTCT 600CTCTGTTGTG TCTCCGAGTT GCTTTTCTCG TCCTCTCTCC AAACCCCGCA TCGAAAAAGT 660AAAGCCCGAT GCTCACCCAC CCCTGTCTGC AGGTTCCCCA TCGCCAAGTT ATCTTGTGTC 720TCTTGAGCTG CAAAAGCAAC CCATTGAAGC AACCATCAAC AGCGCCGATT AAATTTGATA 780TCGACAAGGT AAAAAAGGAT AAGAACAACA AGAAGAAAAA GAGATCAGAA AAAAAAGGAA 840ATCGCCCAAA GTTTTACGGT TCCCTCAGCT TTCAAGACGG TCGCGCCATT GTGAAAACGG 900TGGCACGGCT TCACGACTTA ACGGCTTGAA CGGGTAACCG CACCCAGGAG GGTCGGCTGG 960ATAATTGATT CTCGGCCGGT CCAGAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GGCTGCCTAG 1020AGTAACATTT GAACTACCTA CGAATAATCG GCGGGGTACT GCATAGGTAG TACAATAGTC 1080GGGAGATATT TAGTCTTTTT GGGTTGGTTT CATTTTCGTT ACCTTTTTTT TTACACCCCA 1140CGTGCAGCTC GTCGTTTTCG TCCCCTAAAA AAAACGCGAC CCGGTTCTTG GGCCGTTTCT 1200TCGAGACCAG GAAAAAGAGA GACAAGGGTG TGTGGGGGGA AAACCACAAC CGACGAGAAG 1260GCATTCGGCA GATCGCTATC TCCCTACGGA TAATCCAAAT AAGAGAAATC GTGATCGGGG 1320AACCCGGATA TTTCAAACTC ACCGCTTCTG ACTGAACACA CCCTACTGTA TCTTGTTGTT 1380GCCGTCAGAA TTACCGTTTA CGTTTGCAGA CAACCGTCAC TGCTACCACC CGACAGGGGG 1440TCGCATGGGT GTTTAAATGG CTTCGCCGCG CCGATCAGAA GCCGACCTCG CCAGCCCGGC 1500ACGCGGGCCG GGTTCGGGCC CGCCATCCCC ACCTCATCCC GGTCCCGACT CGGCAAGGCC 1560ACTATCAAGA ATCACGTCGG CGGCAGCGTC ACCACCACCA CCGGGACAAC GAACCGCGGA 1620ACCACCCACA ACCATCTCTA TCCCCCGCAC CCTCTGGCGC CTCAGCATCC CTTTGTACAT 1680CACTCACCCC TCCCTCCCCA ACACACCCTT CATAACCTCC CTCCCGCGCG TATCCTACCT 1740GTCTCTTCTT CTCCCCCGGA TCCGCGCCTT CCTGCCCCCA TCCATCCCAG CCCCGACCAG 1800CTTCCACCAC GAAGGGATCG CGCTGCGCGC CCTGCCGCTC GGCCTGCTCG TCGACCTGTA 1860CCAGCCCACG CTGCCGTGGC GCCTGACGGT CGACCAAGGG GACGACTGGC ACGTGGGCGA 1920CACCTTCCTC AACGGCGTCA AGGAGGCCGA CTTTGTGCGC AACGGACACG CCAAGCAGAT 1980TATGGGCATG AGCAAGGCCG ACACCACGGC GCTGTGGAAC GCCGTCCGCG ACGCAGACTA 2040CCCGGCTTGG GCCCGCATCA ACGCCCGTCT GCTCAACCCT AGCACCCCGA TCAAGCACGT 2100GCCCCTGCGC ATCTACATCC CCAGCAGCGG TGGTGGTGGC GCCGGGGGAG CAACGCCCGC 2160CGGGTCTTTT AGGGTCATGC AGACCCTCGT TCCACCCCGG ACGGCAAACC GTGAGTAAAC 2220CATCAGCCTC GACTTGCTTT TTGCCGCCAT TCAACTCTTT AAAGTTTTTT TTTTTTTTTT 2280TTTTTTTTTG AGAGCACGGA ACCGAGCCTG ACGTGTCGCT GACTTGGTTT GCTTCCACAG 2340GTATTCCGCA GACTCTCGGC CCAACACTAC GTGACTTGCT CCCTGTCTTG TTCCCGAGCA 2400GCAGAGATCC CGTACTGGCC AACGTGGTGC TTCACGGCGC TCCCGTGCCA TTCTCGGCCC 2460
CGCTAGAGGG CTTGATGCGC GAGGCCGCCT ATCCAGACGG CTGGCTTTGT TTAACCGTCG 2520TGCCATTATG ATTTTTTGAC AGGGGCAAAA ACAGTAGTCT TGAGCTCAAG GGCTAAAAAC 2580TTGACCGTTG TTTCCCTCCA ACTAGAACTA GATGGTGATT TGAGCGACGT TCGATTTCAC 2640GTGCATTGAA TTTGGTTTCA CAATTCTTGG AGCTGAAAAG ATGCAAGGAT GGCCTTTGAT 2700GTTTATTGCC TCACAAAGAG ATTCAAGAGA CCAAAAAAGA ACAACATGTC TTATCCAACA 2760AAGTACTTCA AGATCAAATA TGATCCACCC TCAACCAGCC ATCTATATAT GCAACATGTA 2820CTTGCAACGG ACCTGTCCGC CGCGCAGCTA TCACTTCGTA CCACCTCGCA ATAAAAAAAG 2880AAAAAGGAAT ATACCATCAT TAGAGTATGC GTGTATAACA TAACTCAGAA AGTGAAAAGA 2940AAATCAAAGA AAAAGCCGAC CTAGTAAATG GGTATGTATG CAGGTACGCT TCATCCAAGA 3000AGATAAACAA AGAATACAAA ACGTCGCTGA GCATGATACT TGTTGCCTTT GCCATAAAAC 3060AGCTTCATCC ACATGAGGGG CCGTCATTAT CTTGTCAAGT CGGAAAGGAA AAGAACATGA 3120AACAAGTATG ATCTTAAATG CAAGCAAGAT GCCAGCCAGA AAAAAAGGGA GAAGCTGATC 3180CTAATCCAGA AGAAAATACG AGGGTGTTTA AATGGCAAAA TATTAGCGAG ATAATTATGT 3240GGTAGAGCTC AACTGCAATC CTTTGCAGCG CGAGCTTTCC CAAGTAATTA AATGCAGCGA 3300GCCCTCTGTC GCCACGGCAA ATCAGGCCAT GTCGGGTCCG GTCTTGAACA TTCGCCAAAC 3360TTGCTTTTCG GGCGAGCCCT GTCAACATGA CACAGCAGGT AGAATCTGAA GGGAAGCGAG 3420GCTTAGCAGG AGCGTACTGC AACAGCCTGT TTCTTGCTAG CAGAGAACCT TGATGGTGTG 3480GTGAATGCGA GTTCCGCTTT CCTGGGAGCA CTTTCATCGA GGTACCTGAA CATCCACTGC 3540TCCGTTGGGT GTTGGATGGG GCGGCTGATG AGGATGAGGA GAGTAAGAGA ACGGCGGT3598SEQ ID NO2AGGGGGTCGC ATGGGTGTTT AAATGGCTTC GCCGCGCCGA TCAGAAGCCG ACCTCGCCAG 60CCCGGCACGC GGGCCGGGTT CGGGCCCGCC ATCCCCACCT CATCCCGGTC CCGACTCGGC 120AAGGCCACTA TCAAGAATCA CGTCGGCGGC AGCGTCACCA CCACCACCGG GACAACGAAC 180CGCGGAACCA CCCACAACCA TCTCTATCCC CCGCACCCTC TGGCGCCTCA GCATCCCTTT 240GTACATCACT CACCCCTCCC TCCCCAACAC ACCCTTCATA ACCTCCCTCC CGCGCGTATC 300CTACCTGTCT CTTCTTCTCC CCCGGATCCG CGCCTTCCTG CCCCCATCCA TCCCAGCCCC 360GACCAGCTTC CACCACGAAG GGATCGCGCT GCGCGCCCTG CCGCTCGGCC TGCTCGTCGA 420CCTGTACCAG CCCACGCTGC CGTGGCGCCT GACGGTCGAC CAAGGGGACG ACTGGCGCGT 480GGGCGACACC TTCCTCAACG GCGTCAAGGA GGCCGACTTT GTGCGCAACG GACACGCCAA 540GCAGATTATG GGCATGAGCA AGGCCGACAC CACGGCGCTG TGAAACGCCG TCCGCGACGC 600AGACTACCCG GCTTGGGCCC GCATCAACGC CCGTCTGCTC AACCCTAGCA CCCCGATCAA 660GCACGTGCCC CTGCGCATCT ACATCCCCAG CAGCGGTGGT GGTGGCGCCG GGGGAGCAAC 720GCCCGCCGGG TCTTTTAGGG TCATGCAGAC CCTCGTTCCA CCCCGGACGG CAAACCGTAT 780TCCGCAGACT CTCGGCCCAA CACTACGTGG CTTGCTCCCT GTCTTGTTCC CGAGCAGCAG 840AGATCCCGTA CTGGCCAACG TGGTGCTTCA CGGCGCTCCC GTGCCATTCT CGGCCCCGCT 900AGAGGGCTTG ATGCGCGAGG CCGCCTATCC AGACGGCTGG CTTTGTTTAA CCGTCGTGCC 960ATTATGATTT TTTGACAGGG GCAAAAACAG TAGTCTTGAG CTCAAGGGCT AAAAACTTGA 1020CCGTTGTTTC CCTCCAACTA GAACTAGATG GTGATTTGAG CGACGTTCGA TTTCACGTGC 1080ATTGAATCTG GTTTCACAAT TCTTGGAGCT GAAAAGATGC AAGGATGGCC TTTGATGTTT 1140ATTGCCTCAC AAAGAGATTC AAGAGACCA1169
SEQ ID NO3Met Ala Ser Pro Arg Arg Ser Glu Ala Asp Leu Ala Ser Pro Ala1 5 10 15Arg Gly Pro Gly Ser Gly Pro Pro Ser Pro Pro His Pro Gly Pro20 25 30Asp Ser Ala Arg Pro Leu Ser Arg Ile Thr Ser Ala Ala Ala Ser35 40 45Pro Pro Pro Pro Gly Gln Arg Thr Ala Glu Pro Pro Thr Thr Ile50 55 60Ser Ile Pro Arg Thr Leu Trp Arg Leu Ser Ile Pro Leu Tyr Ile65 70 75Thr His Pro Ser Leu Pro Asn Thr Pro Phe Ile Thr Ser Leu Pro80 85 90Arg Val Ser Tyr Leu Ser Leu Leu Leu Pro Arg Ile Arg Ala Phe95 100 105Leu Pro Pro Ser Ile Pro Ala Pro Thr Ser Phe His His Glu Gly110 115 120Ile Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Gly Leu Leu Val Asp Leu Tyr125 130 135Gln Pro Thr Leu Pro Trp Arg Leu Thr Val Asp Gln Gly Asp Asp140 145 150Trp His Val Gly Asp Thr Phe Leu Asn Gly Val Lys Glu Ala Asp155 160 165Phe Val Arg Asn Gly His Ala Lys Gln Ile Met Gly Met Ser Lys170 175 180Ala Asp Thr Thr Ala Leu Trp Asn Ala Val Arg Asp Ala Asp Tyr185 190 195Pro Ala Trp Ala Arg Ile Asn Ala Arg Leu Leu Asn Pro Ser Thr200 205 210Pro Ile Lys His Val Pro Leu Arg Ile Tyr Ile Pro Ser Ser Gly215 220 225Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Pro Ala Gly Ser Phe Arg Val230 235 240Met Gln Thr Leu Val Pro Pro Arg Thr Ala Asn Arg Ile Pro Gln245 250 255Thr Leu Gly Pro Thr Leu Arg Asp Leu Leu Pro Val Leu Phe Pro260 265 270Ser Ser Arg Asp Pro Val Leu Ala Asn Val Val Leu His Gly Ala275 280 285Pro Val Pro Phe Ser Ala Pro Leu Glu Gly Leu Met Arg Glu Ala290 295 300Ala Tyr Pro Asp Gly Trp Leu Cys Leu Thr Val Val Pro Leu305 310
SEQ ID NO4CTCTAGGGGG TTGCAGTGCG TTCGTCACGC GTAAGGCTTC CTCGGCCAGT AAGATGGTGT 60GCTGGGGGGA CTTTTCTTTC TGACCTGGAA TCACTCACTG CTGGTTGCTT GCCAAGCTTG 120CTTGCTCGGA AAGGGGTTAA TACAAAACCA GCTAGAAAAA AAAAAAGATC TACAAATGGT 180GCATGTCTCA TCGCGGGAAC GTGAATGGTT CGTTTTGCTG GCTGTAGTCT GTACCTCTAA 240TTTCTTTTTT TTTCTTTTTT CCCCGGTGGC TTTTTGGATT CCCTCACTGC AAAAAAGAGA 300TGGAAGCGAG TGCAACCTGA TAGTGGCTAC ATGCCAACCT AGCTAGCTAT ACATCCTTTT 360ACAGCCTGGG CCATTTGAAT TCGGCGGGCA AGCGGGGTTA ATGGTACTCT CTCTGGTTTT 420TGGTAGTGGT TCCCTGGTTT GCGGAGGTGA AATGGCAGCT GTCATCCCAA ACATACGGAG 480TAAACTGATC ACAGCAAAGT GAGAAGGGGG GATGTGATCC GGATCACGGC AATGAGCTAG 540TCCCTACCTA CAGGCAGTGC CTGCCTACCA ATAGCTCGTA CAGAAAATCC CTGCCCCTCT 600CTCTGTTGTG TCTCCGAGTT GCTTTTCTCG TCCTCTCTCC AAACCCCGCA TCGAAAAAGT 660AAAGCCCGAT GCTCACCCAC CCCTGTCTGC AGGTTCCCCA TCGCCAAGTT ATCTTGTGTC 720TCTTGAGCTG CAAAAGCAAC CCATTGAAGC AACCATCAAC AGCGCCGATT AAATTTGATA 780TCGACAAGGT AAAAAAGGAT AAGAACAACA AGAAGAAAAA GAGATCAGAA AAAAAAGGAA 840ATCGCCCAAA GTTTTACGGT TCCCTCAGCT TTCAAGACGG TCGCGCCATT GTGAAAACGG 900TGGCACGGCT TCACGACTTA ACGGCTTGAA CGGGTAACCG CACCCAGGAG GGTCGGCTGG 960ATAATTGATT CTCGGCCGGT CCAGAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA GGCTGCCTAG 1020AGTAACATTT GAACTACCTA CGAATAATCG GCGGGGTACT GCATAGGTAG TACAATAGTC 1080GGGAGATATT TAGTCTTTTT GGGTTGGTTT CATTTTCGTT ACCTTTTTTT TTACACCCCA 1140CGTGCAGCTC GTCGTTTTCG TCCCCTAAAA AAAACGCGAC CCGGTTCTTG GGCCGTTTCT 1200TCGAGACCAG GAAAAAGAGA GACAAGGGTG TGTGGGGGGA AAACCACAAC CGACGAGAAG 1260GCATTCGGCA GATCGCTATC TCCCTACGGA TAATCCAAAT AAGAGAAATC GTGATCGGGG 4320AACCCGGATA TTTCAAACTC ACCGCTTCTG ACTGAACACA CCCTACTGTA TCTTGTTGTT 1380GCCGTCAGAA TTACCGTTTA CGTTTGCAGA CAACCGTCAC TGCTACCACC CGACAGGGGG 1440TCGCATGGGT GTTTAA 1456SEQ ID NO5＞fgATG5 Fusarium graminearum 禾谷镰刀菌Met Ser Ser Pro Ile Pro Gln Ala Leu Trp Ser Ala Gln Ile Pro1 5 10 15Leu His Ile Thr His Pro Ala Ser Pro Thr Thr Pro Phe Ile Thr20 25 30Ser Ile Pro Arg Phe Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Ile Pro Arg Leu35 40 45Ser Thr Phe Phe Asn Ser Pro Cys Ser Ser Phe His Phe Glu Asp50 55 60Val Gln Leu Arg Asn Leu Ala Val Gly Leu Leu Val Asp Leu Tyr65 70 75Gln Pro Ala Leu Pro Trp Lys Leu Thr Val Asn Asp Gly Val Gly80 85 90Trp Asp Ile Ala Asp Thr Phe Leu Asn Cys Val Lys Glu Ala Asp95 100 105
Phe Val Arg Asn Gly Asn Ala Asn Gln Ile Met Lys Met Ser Lys110 115 120Glu Asn Thr Thr Gln Leu Trp Asn Ala Val Ile Asp Asn Asp His125 130 135Pro Ser Phe Asn Arg Ile Asn Ser His Leu Leu Asn Ala Pro Thr140 145 150Ala Leu Lys His Val Pro Ile Arg Ile Tyr Val Pro Thr Ser Gly155 160 165Pro Asp Ser Ser Ala Thr His Pro Glu His Ala Thr Phe Lys Val170 175 180Ile Gln Ser Leu Met Ala Ala Thr Ser Ser Asp Arg Arg Pro Lys185 190 195Leu Leu Gly Gln Ala Leu Lys Glu Val Leu Pro Gly Leu Phe Pro200 205 210Ser Ser Arg Asp Pro Ile Leu Ala Lys Val Val Met His Gly Ala215 220 225Gly Val Pro Phe Asp Ala Pro Leu Glu Asp Leu Met Arg Glu Ala230 235 240Ala Tyr Pro Asp Gly Trp Leu Cys Leu Val Val Ile Val Leu245 250SEQ ID NO6＞ssATG5 Sclerotinia sclerotiorum 油菜菌核病菌Met Gln Ser Leu Ile Trp Ala Ser Ala Ile Pro Leu Tyr Ile Thr1 5 10 15His Ser Ser Ser Thr Ile Pro Tyr Leu Ile Asn Val Pro Arg Val20 25 30Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Phe Pro Arg Leu Thr Ser Phe Phe Gly35 40 45Glu Asn Val Ser Ser Phe Ser Tyr Glu Gly Ile Leu Leu Lys Asn50 55 60Leu Pro Val Gly Leu Leu Cys Asp Leu Tyr Gln Pro Glu Leu Pro65 70 75Trp Arg Ile Glu Leu Gly Asp Gly Pro Leu Phe Asp Ile His Asp80 85 90Thr Phe Ile Asn Ser Val Lys Glu Ala Asp Phe Met Arg Asn Gly95 100 105Asn Ala Lys Gly Ile Met Ser Met Ser Lys Glu His Ser Thr Gln110 115 120Leu Trp Asn Ser Val Gln Asp Asn Asp Phe Ser Thr Tyr His Lys125 130 135Ile Ser Thr Ile Leu Leu Asn Pro Ala Thr Ala Leu Lys His Ile140 145 150
Pro Leu Arg Ile Tyr Leu Pro Ser Ser Ser Thr Pro Ser Ser Thr155 160 165Pro His Pro Gly Ser Ser Gly Ser Ser Lys Ala Pro Ser Thr Ala170 175 180Ser Pro Pro Ser Pro Leu Phe Thr Phe Lys Thr Ile Gln Thr Leu185 190 195Ile Gln Pro Gln Thr Thr Ser Arg Glu Pro Gln Thr Leu Gly Gly200 205 210Ala Leu Asn Ser Val Leu Pro Thr Leu Phe Pro Ser Lys Arg Asp215 220 225Ala Ile Leu Ala Glu Val Ile Leu His Gly Ala Thr Val Pro Phe230 235 240Lys Ala Val Leu Glu Asp Leu Met Arg Glu Ala Ser Tyr Ala Asp245 250 255Gly Trp Leu Asn Val Cys Val Val Met Leu Asn260 265SEQ ID NO7＞snATG5 Stagonospora nodorum 小麦颖枯病菌Met Ser Ser Arg Glu Val Thr Ser Arg Leu Arg Glu Lys Val Trp1 5 10 15Asn Gly Ser Val Pro Leu Glu Ile Arg Leu His Lys Gly Asp Cys20 25 30Arg Thr Tyr Asp Asp Ser Asp Ala Tyr Leu Ile Gln Phe Pro Arg35 40 45Leu Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Ile His Lys Leu His Ala Phe Phe50 55 60Ala Pro Ser Leu Ile Tyr Pro Asp Ile His Pro Ser Asp Leu Trp65 70 75Phe Ser Tyr Glu Gly Val Pro Leu Lys Trp His Tyr Pro Leu Gly80 85 90Leu Leu Tyr Asp Leu Tyr Ser Gly Ala Glu Pro Tyr His Pro Ser95 100 105Asp Ser Pro Pro Pro Ser Pro Thr Thr Pro Ser Lys Gln Asp Ser110 115 120Lys Gln Pro Leu Pro Trp Arg Leu Thr Leu His Thr Ser Ala Tyr125 130 135Pro Thr Thr Gln Leu Ile Pro Leu Asp Asn Asn Asn Leu Gln Ile140 145 150His Asp Leu Phe Ile His Ser Val Lys Glu Ala Asp Tyr Leu Arg155 160 165Thr Gly Thr Gly Lys Thr Val Met Phe Leu Ser Gln Ala Asp Ser170 175 180
Thr Gln Leu Trp Asp Ala Val Val Lys His Asp Phe Ala Leu Phe185 190 195Asn Pro Ile Asn Gln Lys Leu Leu Asn Pro Gln Gly Val Asn Leu200 205 210Arg His Leu Pro Val Arg Leu Tyr Leu Pro His Ala Gly Val Asp215 220 225Glu Glu Asp Arg Gly Met Gly Ser Val Arg Val Val Gln Ser Leu230 235 240Val Lys Val Glu Val Gly Ser Arg Gln Pro Gln Thr Ile Gly Thr245 250 255Ala Leu Asn Gln Ile Leu Pro Thr Leu Phe Pro Ser Arg Arg Ser260 265 270Ala Leu Leu Ala Gln Ala Val Leu His Gly Ala Val Val Pro Leu275 280 285Gly Ala Ser Val Glu Glu Leu Ile Arg Ser Val Ala Tyr Leu Asp290 295 300Gly Trp Leu His Ile Ala Ile Val Met Met Gly305 310
权利要求
1.一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5，其特征是该基因的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO1。
2.如权利要求1所述的基因mgATG5编码的cDNA序列，其特征是所述cDNA序列具有SEQID NO2所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的基因mgATG5编码的蛋白质，其特征是所述蛋白质具有SEQ IDNO3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的基因mgATG5的启动子，其特征是所述启动子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.利用如权利要求1所述的基因mgATG5的表达作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
6.利用如权利要求3所述的蛋白质的表达和修饰作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
7.结合利用如权利要求3所述的蛋白质以及如权利要求4所述的启动子作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因mgATG5，其核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO1。基因mgATG5编码的cDNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。基因mgATG5编码的蛋白质具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。基因mgATG5的启动子具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。分别利用基因mgATG5的表达作为靶标、利用上述蛋白质的表达和修饰作为靶标、结合利用上述蛋白质以及启动子作为靶标，在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
文档编号C07K14/37GK101050463SQ20071006758
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月16日 优先权日2007年3月16日
发明者刘小红, 卢建平, 冯晓晓, 林福呈, 章初龙 申请人:浙江大学