专利名称：一种核酸以及鉴定真菌菌株致病型的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及农作物病害防治领域，具体地，涉及一种核酸、一种鉴定真菌菌株致病型的方法和一种试剂盒。
背景技术：
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种植物致病真菌,它可以导致植物(特别是棉花)发生黄萎病。但是，不同致病型的大丽轮枝菌菌株的致病表现差别很大，例如某些高致病型的菌株感染棉花后会导致棉花的严重病害而引起农田产量的下降，而某些低致病型的菌株感染棉花后仅导致棉花的轻微病害且对农田产量影响较小。此外，大丽轮枝菌的致病型还表现出一定的潜伏性，即高致病型菌株在感染当年可能不致病，而在次年大范围地严重致病。如果能够检测 出农田中大丽轮枝菌的主要菌株类型，并对其致病型作出准确的判
断，就可以结合药物防治和轮作等农业手段抑制病害的发生，从而增加经济效益和社会效
发明内容
本发明的目的是解决如何准确判断大丽轮枝菌菌株的致病型的技术问题，提供一种核酸、一种鉴定真菌菌株致病型的方法和一种试剂盒。SEQ ID NO:1所示的序列为本发明人发现的在高致病型的大丽轮枝菌菌株的基因组序列中出现而在低致病型的大丽轮枝菌的基因组序列中不出现的序列。因而，对于某一致病型待测的大丽轮枝菌菌株，只要鉴定该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中是否存在SEQ ID NO:1所示的序列，即可获知该大丽轮枝菌菌株是否为高致病型大丽轮枝菌。具体地，如果鉴定出该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列，则判断该大丽轮枝菌菌株不属于高致病型；如果鉴定出该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中存在SEQ ID NO:1所示的序列，则判断该大丽轮枝菌菌株属于高致病型。并且，如果该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列，就能够充分证明该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO:1所示的序列。由此，本发明的发明人得到了本发明的技术方案。为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种核酸，该核酸具有SEQ ID N0:1所示的序列，或者具有SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列所示的序列，并且所述SEQ IDNO:1所示的序列中的特异性序列在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列范围内仅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中。另一方面，本发明还提供了与如上所述的核酸互补的核酸。另一方面，本发明还提供了一种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),该方法包括以下步骤:(I)制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；(2)检测所述待测样本中是否存在第一分子标记，所述第一分子标记为如上所述的核酸；(3)根据步骤(2)的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述待测样本中不存在所述第一分子标记的情况下，则指示所述大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型；在所述待测样本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互补核酸的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株属于高致病型。另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的核酸，以及PCR试剂和/或分子杂交试剂。通过上述技术方案，本发明鉴定的高致病型的大丽轮枝菌的导致棉花发生黄萎病的平均病情指数为56.6 ;本发明鉴定的低致病型的大丽轮枝菌的导致棉花发生黄萎病的平均病情指数为12.0。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明提供一种核酸，该核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列，或者具有SEQ ID NO:I所示的序列中的特异性序列，并且所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列范围内仅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中。 其中，术语“大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列”是指已经公布在公共数据库中的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列，具体是指文献(Klosterman SJ et.al, Comparative genomics yields insights into nicheadaptation of plant vascular wilt pathogens.PLoS Pathog.201IJul ；7 (7):el002137.Epub 2011Jul 28.)中提及的数据库(http://www.broadinstitute.0rg)中公布的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列。其中，SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列可以基于SEQ ID NO:1所示的序列和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列，通过本领域常规的序列比对(blast)方法得到。例如，本领域技术人员可以凭借已公开的计算机程序(商业化的和免费的均可，例如NCB1-PRMERBLAST)，穷举SEQ ID NO:1所示的序列的所有可能的片段，然后
将其与大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列进行--比对，如果该片段仅
出现于SEQ ID NO:1所示的序列中，而不出现于SEQ ID NO:1所示的序列以外的序列中，该片段即为SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列。其中，本发明中所述的SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列是用于鉴定SEQID NO:1所示的序列是否存在的，因此SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度没有特别的要求，本领域技术人员可以根据所选取的检测方法进行常规的选择。例如，所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度可以为15-5000bp。其中，为了使SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特异性序列可以作为聚合酶链式反应(PCR)法鉴定SEQ ID NO:1所示的序列的扩增祀(amplified target)序列，优选情况下，所述SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特异性序列的长度为100-5000bp，更优选为lOO-lOOObp，进一步优选为100_500bp，更进一步优选为150_250bp。
其中，为了使SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特异性序列可以作为聚合酶链式反应(PCR)法鉴定SEQ ID NO:1所示的序列的引物(primer)序列，或者作为核酸杂交(如Southern Blot)法鉴定SEQ ID NO:1所示的序列的探针(probe)序列，优选情况下，所述SEQ ID NO:1所示的序列所示的序列中的特异性序列的长度为15-99bp，更优选为20-50bp，进一步优选为20-40bp，更进一步优选为22_35bp。本发明还提供了与如上所述的核酸互补的核酸。需要说明的是，本发明如上所述的各种核酸中，除碱基序列外，均无特别的要求，本领域技术人员可以对如上所述的各种核酸进行各种修饰，修饰后的核酸也属于本发明的范围。本发明还提供了一种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌，该方法包括以下步骤:⑴制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；(2)检测所述待测样本中是否存在第一分子标记，所述第一分子标记为如上所述的核酸；(3)根据步骤
(2)的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述待测样本中不存在所述第一分子标记的情况下，则指示所述大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型；在所述待测样本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互补核酸的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株属于高致病型。其中，制备待测样本的步骤可以按照本领域常规的制备用于检测核酸的样本的方法进行，本发明没有特别的要求，例如可以从棉花植株上采集组织，并且将采集的组织在含有抗性的培养基上培养，并且筛选、辨别和分离大丽轮枝菌的菌落，然后按照(《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版))中所述的方法提取大丽轮枝菌的基因组DNA，即可制备得到待测样本。其中，检测所述待测样本中是否存在第一分子标记的方法可以为本领域常规的检测核酸的方法，本发明没有特殊的要求，例如可以为测序法(如双脱氧核糖核苷酸中止测序法和芯片测序法)、PC·R法(如实时定量PCR法)和核酸杂交法(如Southern Blot法)中的至少一种。其中，判断所述检测结果显示所述待测样本中是否存在所述第一分子标记或具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸可以按照本领域常规的方法和标准进行，例如可以通过设置外参和/或内参进行平行检测，并且通过平行检测结果来进一步判断。另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的核酸，以及PCR试剂和/或分子杂交试剂。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，各种大丽轮枝菌的菌株属于经过合法渠道获得的遗传资源。需要说明的是，SEQ ID NO:1所示的序列中，出现多个由连续的n(n为a，c，g，或t)组成的片段，该片段表示在不同的大丽轮枝菌菌株中可以自由改变的碱基序列，其不影响大丽轮枝菌菌株的致病型的判断。实施例1本实施例用于说明待测样本的制备。具体地，是从80个不同的大丽轮枝菌菌株(编号为VDGl至VDG80)的基因组DNA的制备。切取棉花植株离地表约10_35cm处的莖，切成Imm3左右大小的小块，接种在在含有抗生素(氨苄青霉素、利福平和链霉素，浓度均为lOOyg/ml)的PDA培养基(含有马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L)上，25°C下培养7天，根据大丽轮枝菌的标准菌落形态鉴别大丽轮枝菌的菌落。得到鉴别的大丽轮枝菌的菌落即作为大丽轮枝菌菌株样品。按照上述方法，从80个不同的棉花植株中取得80个不同的大丽轮枝菌菌株，将上述80个不同的大丽轮枝菌菌株按照《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法，分别提取基因组DNA样本，得到待测样本1-80。实施例2本实施例用于说明上述80个不同的大丽轮枝菌菌株的致病型的检测结果。参照文献(朱荷琴，冯自力，李志芳，赵丽红，师勇强.蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法鉴定棉花品种(系)的抗黄萎病性.中国棉花，2010,37(12):15-17)中的蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法，对实施例1中所述的80个不同的大丽轮枝菌菌株进行棉花苗期致病型鉴定。以所述的80个不同的大丽轮枝菌菌株在接种健康棉花植株后的病情指数来表征致病型的高低。具体地，将大丽轮枝菌在查比克培养基(2g/L的NaNO3, lg/L的K2HPO4,0.5g/L的KCl, 0.5g/L的MgSO4,0.0 lg/L的FeSO4, 30g/L的蔗糖，20g/L的琼脂)上培养至产生孢子，用无菌水洗下孢子得到孢子悬液，并将孢子悬液中的孢子浓度调整至5X IO6个/ml。然后，播种在纸钵的棉花幼苗至少有一片真叶展开时接种，向纸牒底部注入IOmL孢子悬浮液，将纸钵放入纸牒中，接种棉苗30株以上。接种后4周发病情况，调查采用5级分级法，分级标准:0级，健苗、无病状；1级，1-2片子叶表现病状、子叶变黄、真叶不显病状；2级，子叶和I片真叶表现病状；3级、2片真叶表现病状；4级，全部叶片表现病状，严重时叶片脱落，顶心枯死。根据调查结果，计算出病情指数，公式如下所示:
权利要求
1.一种核酸，该核酸具有SEQ ID NO:1所示的序列，或者具有SEQ ID N0:1所示的序列中的特异性序列，并且所述SEQ ID NO:1所示的序列中的特异性序列在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的全基因组序列范围内仅存在于SEQ ID NO:1所示的序列中。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度为100-5000bp。
3.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度为100-1000bp。
4.根据权利要求3所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度为100-500bp，优选为150-250bp。
5.根据权利要求1所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度为15-99bp。
6.根据权利要求5所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度为18-50bp。
7.根据权利要求6所述的核酸，其中，所述SEQID NO:1所示的序列中的特异性序列的长度为20-40bp，优选为22-35bp。
8.—种核酸,该核 酸与权利要求1-7中任意一项所述的核酸互补。
9.一种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae),该方法包括以下步骤: (1)制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本； (2)检测所述待测样本中是否存在第一分子标记，所述第一分子标记为根据权利要求1-8中任意一项所述的核酸； (3)根据步骤(2)的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型，在所述待测样本中不存在所述第一分子标记的情况下，则指示所述大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型；在所述待测样本中存在具有SEQ ID NO:1所示的序列的核酸或它的互补核酸的情况下，则指示该大丽轮枝菌的菌株属于高致病型。
10.一种试剂盒，所述试剂盒含有根据权利要求8所述的核酸，以及PCR试剂和/或分子杂交试剂。
全文摘要
本发明提供了一种核酸，该核酸具有SEQ ID NO1所示的序列，或者具有SEQ ID NO1所示的序列中的特异性序列。本发明还提供了与如上所述的核酸互补的核酸。本发明还提供了一种鉴定真菌菌株致病型的方法，所述真菌菌株为大丽轮枝菌，该方法包括以下步骤(1)制备含有大丽轮枝菌的全基因组DNA的待测样本；(2)检测所述待测样本中是否存在第一分子标记，所述第一分子标记为如上所述的核酸；(3)根据步骤(2)的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型。本发明还提供了一种试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK103243092SQ20121005220
公开日2013年8月14日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者戴小枫, 李蕾, 陈捷胤, 王金龙, 陈相永, 柳少燕 申请人:中国农业科学院作物科学研究所