利用nim1基因赋予植物抗病性的方法

专利名称：：利用nim1基因赋予植物抗病性的方法
技术领域：
：本发明一般地涉及植物中的广谱抗病性，包括系统获得性抗性(SAR)这一现象。更特别地，本发明涉及NIM1基因的野生型和变形体的重组表达，其参与导致SAR的信号传导级联反应以建立具有广谱抗病性的转基因植物。本发明进一步涉及在具有广谱抗病性转基因植物中克隆NIM1基因的高水平表达。植物经常受到大量的病原生物的侵袭，包括病毒、细菌、真菌和线虫。作物类植物特别脆弱，因为它们常常是以遗传均一的单种栽培；一旦发病则损失严重。然而，大多数植物具有它们自己天生的抵抗病原生物的防卫机制。植物育种家和病理学家已经鉴定了抵抗植物病原体的天然变异并育成许多作物类植物。这些自然抗病基因常常提供对病原体的高水平的抗性或免疫性。系统获得性抗性(SAR)是植物用于保护自身不受病原体侵害的复杂系统的一个成份(Hunt和Ryals，植物科学评论(Crit.Rev.InPlantSci.)15，583-606(1996)，在此完整引入作为参考；Ryals等，植物细胞(PlantCell)8，1809-1819(1996)，在此完整引入作为参考。还参考美国专利5,614,395，在此完整引入作为参考)。SAR是植物-病原体反应的一个特别重要的方面，因为它是病原体可诱导的针对广谱传染剂的系统性抗性，广谱传染剂包括病毒、细菌和真菌。当SAR信号传导途径被阻断时，植物变得对通常致病的病原体更加敏感，而且它们对一些通常不致病的传染剂也变得敏感起来(Gaffney等，科学(Science)261，754-756(1993)，在此完整引入作为参考；Delaney等，科学266，1247-1250(1994)，在此完整引入作为参考；Delaney等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，6602-6606(1995)，在此完整引入作为参考；Delaney，植物生理(PlantPhys.)113，5-12(1997)，在此完整引入作为参考；Bi等，植物杂志(PlantJ.)8，235-245(1995)，在此完整引入作为参考；Mauch-Mani和Slusarenko，植物细胞(PlantCell)8，203-212(1996)，在此完整引入作为参考)。这些观察显示SAR信号传导途径对于维持植物健康是至关重要的。在概念上，SAR反应可分为两个阶段。在初始阶段中，病原体感染被识别，信号被释放并通过韧皮部到达远处的组织。这种系统性信号被靶细胞所感受，其反应为SAR基因和抗病性的表达。SAR的维持阶段是指一段时间，从几个星期到植物的一生，在此期间植物处于准稳态，抗病性得以维持(Ryals等，1996)。水杨酸(SA)的积累似乎是SAR信号传导所需的。通过利用特殊抑制剂处理、后生性的苯丙氨酸解氨酶的抑制、或水杨酸羟化酶(专一降解水杨酸)的转基因表达形成的不能积累水杨酸的植物，也不能诱导SAR基因的表达和抗病性(Gaffney等，1993；Delaney等，1994；Mauch-Mani和Slusarenko1996；Maher等，美国国家科学院院报，91，7802-7806(1994)，在此完整引入作为参考；Pallas等，植物杂志，10，281-293(1996)，在此引入作为参考)。尽管已经表明水杨酸可能作为系统性信号，最近却有争论，而且至今明确已知的是如果不能积累水杨酸，则SAR信号传导被阻断(Pallas等，1996；Shulaev等，1995，植物细胞，7，1691-1701(1995)，在此完整引入作为参考；Vernooij等，植物细胞，6，959-965(1994)，在此完整引入作为参考)。最近，拟南芥(Arabidopsis)开始作为研究SAR的模式系统(Uknes等，植物细胞，4，645-656(1992)，在此完整引入作为参考；Uknes等，分子植物-微生物相互作用(Mol.Plant-MicrobeInteract.)6，692-698(1993)，在此完整引入作为参考；Cameron等，植物杂志，5，715-725(1994)，在此完整引入作为参考；Mauch-Mani和Slusarenko，分子植物-微生物相互作用7，378-383(1994)，在此完整引入作为参考；Dempsey和Klessig，巴斯德研究所公报(BulletindeL′InstitutPasteur)93，197-186(1995)，在此完整引入作为参考)。已经表明在拟南芥中SAR可以被病原体和化学品所激活，例如水杨酸(SA)，2，6-二氯异烟酸(INA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯(BTH)(Uknes等，1992；Vernooij等，分子植物-微生物相互作用8，228-234(1995)，在此完整引入作为参考；Lawton等，植物杂志10，71-82(1996)，在此完整引入作为参考)。用INA或BTH或病原体感染处理后，至少三个与发病相关(PR)的蛋白质基因，即PR-1、PR-2和PR-5是与抗性发生同时被诱导的伴随物(Uknes等，1992，1993)。在烟草这一被最详细描述的品种中，用病原体或免疫化合物处理诱导了至少九套基因的表达(Ward等，植物细胞3，1085-1094(1991)，在此完整引入作为参考)。已经通过用不同的SAR基因转化植物建立了转基因抗病植物(美国专利5,614,395)。已经分离了大量的具有被改造的SAR信号传导的拟南芥突变型(Delaney，1997)。这些突变型的第一个是所谓的lsd(病斑模拟病)突变型和acd2(加速细胞死亡)突变型(Dietrich等，细胞(Cell)77，551-563(1994)，在此完整引入作为参考；Greenberg等，细胞77，551-563(1994)，在此完整引入作为参考)。这些突变型的叶子上都具有一定程度的随机坏死斑形成，且具有水平增高的SA、SAR基因的mRNA积累以及明显增强的抗病性。至少7个不同的lsd突变型已经被分离并表征(Dietrich等，1994；Weymann等，植物细胞7，2013-2022(1995)，在此完整引入作为参考)。另一类感兴趣的突变型是cim(组成型免疫)突变型(Lawton等，1993“系统获得性抗性的分子生物学”，见《植物中防卫反应的机制》，B.Fritig和M.Legrand编著(Dordrecht，荷兰Kluwer学院出版社)，第422-432页(1993)，在此完整引入作为参考)。还参考国际PCT申请WO94/16077，在此完整引入作为参考。象lsd和acd2突变型一样，cim突变型具有增强的SA和SAR基因表达和抗性，但是与lsd或acd2相反，cim突变型的叶子上没有出现可检测的病斑。cpr1(PR基因的组成型表达子)可能是cim突变型的一种；但是，因为还没有排除cpr1叶子上的微细病斑的存在，cpr1可能是lsd突变型的一种(Bowling等，植物细胞6，1845-1857(1994)，在此完整引入作为参考)。还分离出了SAR信号传导被阻断的突变型。ndr1(非品种特异性抗病性)是允许含有多种无致病力基因的丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)和通常寄生霜霉的(Peronosporaparasitica)无致病力分离物生长的突变型(Century等，美国国家科学院院报92，6597-6601(1995)，在此完整引入作为参考)。很明显这个突变型在SAR信号传导早期被阻断。npr1(PR基因的非表达子)是在经INA处理后不能诱导SAR信号传导途径表达的突变型(Cao等，植物细胞6，1583-1592(1994)，在此完整引入作为参考)。eds(增强的病害敏感性)突变型是根据它们在低浓度细菌接种后的支持细菌感染的能力被分离的(Glazebrook等，遗传(Genetics)143，973-982(1996)，在此完整引入作为参考；Parker等，植物细胞8，2033-2046(1996)，在此完整引入作为参考)。某些eds突变型在表型上非常相似于npr1，而且最近发现eds5和eds53与npr1是等位的(Glazebrook等，1996)。nim1(非诱导免疫)是经INA处理后支持寄生霜霉(即霜霉病的致病菌)生长的突变型(Delaney等，1995，国际PCT申请WO94/16077)。尽管nim1在被病原体感染后能够积累SA，但它不能诱导SAR基因表达或抗病性，提示该突变阻断了SA的下游途径。nim1对INA或BTH反应的能力也受到损害，提示该阻断存在于这些化学品作用的下游(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。最近，两个等位的拟南芥基因被分离并表征，它们的突变型分别负责nim1和npr1的表型(Ryal等，植物细胞9，425-439(1997)，在此完整引入作为参考；Cao等，细胞88，57-63(1997)，在此完整引入作为参考)。野生型NIM1基因产物参与导致拟南芥中的SAR和基因-基因抗病性的信号传导级联反应(Ryals等，1997)。Ryals等，1997还报告了nim1的另外5个等位基因的分离，它们表现出不同的表型，程度从化学诱导的PR-1基因表达和对真菌的抗性受到弱的损害到十分严重的阻断。将野生型NPR1基因转化到npr1突变型中不但互补了突变，恢复了对SAR诱导的反应引起PR基因表达和抗病性，而且还赋予转基因植物在不存在SAR诱导时对丁香假单胞菌的感染更强的抗性(Cao等，1997)。NF-κB/IκB信号传导途径NF-κB/IκB信号传导途径与从果蝇(Drosophila)到哺乳动物范围内不同的生物体中的抗病性反应有关。在哺乳动物中，NF-κB/IκB信号传导可被许多不同的刺激诱导，包括将细胞暴露在脂多糖中、肿瘤坏死因子中、白细胞介素1(IL-1)中或被病毒感染(Baeuerle和Baltimore，细胞87，13-20(1996)；Baldwin，免疫学年度综述(Annu.Rev.Immunol.)14，649-681(1996))。被活化的途径导致合成许多参与炎症和免疫反应的因子，例如IL-2、IL-6、IL-8和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(deMartin等，基因，152，253-255(1995))。在转基因小鼠研究中，NF-κB/IκB信号传导的敲出(knockout)导致免疫反应的缺陷，包括对细菌和病毒病原体的敏感性增强(Beg和Baltimore，科学，274，782-784(1996)；VanAntwerp等，科学，274，787-789(1996)；Wang等，科学，274，784-787(1996)；Baeuerle和Baltimore(1996))。在拟南芥中，SAR在功能上与炎症的相似性在于SAR活化后使正常抗性过程被激发从而导致抗病性的增强(Bi等，1995；Cao等，1994；Delaney等，1995；Delaney等，1994；Gaffney等，1993；Mauch-Mani和Slusarenko1996；Delaney，1997)。而且，该途径的失活导致对细菌、病毒和真菌病原体的敏感性增强。令人感兴趣的是，据报道SA阻断哺乳动物细胞中NF-κB的活化(Kopp和Ghosh，科学265，956-959(1994))，而在拟南芥中SA激活信号传导。果蝇的细菌性感染激活了信号传导级联反应导致合成许多抗真菌蛋白如cercropinB、防卫素(defensin)、diptericin和drosomycin(Ip等，细胞75，753-763(1993)；Lemaitre等，细胞86，973-983(1996))。果蝇中这种诱导依赖于dorsal和dif两个NF-κB同系物的基因产物，并受cactus，一个IκB同系物的阻遏。抗真菌和抗细菌蛋白合成降低的突变型对感染的抗性急剧下降。尽管进行了很多研究和利用复杂的和强化的作物保护措施，包括植物的遗传转化，由于病害造成的损失每年仍有数十亿美元。因此，存在持续的需求，根据不断增加的对植物抗病性的遗传基础的理解发展新的作物保护措施。下列定义将有助于理解本发明。植物细胞植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。术语“植物细胞”指植物的部分或衍生于植物的任何细胞。细胞的一些例子包括属于活体植物一部分的分化的细胞；培养时分化的细胞；培养时未分化的细胞；未分化组织如愈伤组织或瘤；种子、胚胎、繁殖体和花粉的分化细胞。植物组织组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植株和培养物形成的植物的任何组织。该术语包括但不限于，整个植物、植物器官、植物种子、组织培养和任何一组组织成结构和/或功能单位的植物细胞。本术语与上面列出的或本定义所包括的任何特定类型的植物组织相结合使用，或是单独使用，但并不意在排除任何其它类型的植物组织。原生质体没有细胞壁的植物细胞。子代植物经有性或无性繁殖的下一代植物，包括但不限于后代植物。转基因植物在其基因组中具有稳定结合的重组DNA的植物。重组DNA通过连接不同来源的DNA片段利用重组DNA技术产生的任何DNA分子。重组DNA技术在体外产生重组DNA并将重组DNA转移到细胞中使其表达或增殖的技术(参阅《简明生物医学和分子生物学词典》(ConciseDictionaryofBiomedicineandMolecularBiology)，Juo编，CRC出版，BocaRaton(1996))，例如将DNA转入不同形式的原生质体或细胞，包括如，(1)裸露的环状、线状或超螺旋形式的DNA，(2)在核小体、染色体、核或其部分中所含的DNA，(3)与其它分子相复合或结合的DNA，(4)包含在脂质体、球状体、细胞或原生质体中的DNA，或(5)从宿主以外的生物体中(例如根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefiaciens))转移的DNA。这些或其它的将重组DNA引入细胞的不同方法为本领域所熟知，并可用于产生本发明的转基因细胞或转基因植物。重组DNA技术还包括在Treco等，WO94/12650和Treco等，WO95/31560中描述的同源重组方法，其可用于增加单子叶植物的过氧化物酶活性。特殊地，调控区(如启动子)可被引入到植物基因组中以增加内源过氧化物酶的表达。重组DNA技术还包括将缺失了所选表达信号的过氧化物酶编码序列插入到单子叶植物中，并分析转基因单子叶植物由于内源控制序列引起的过氧化物酶的表达增加。这可能导致植物中过氧化物酶编码序列拷贝数的增加。初始的将重组DNA插入到R0植物的基因组中并不限于通过传统的植物育种方法获得，而是由此处描述的技术方法得到的。初始插入之后，转基因子代可以通过基本上传统的育种方法进行繁殖。嵌合基因含有至少两个异源部分的DNA分子，例如衍生自预先存在的DNA序列的部分，但这些序列并不以预先存在的状态相联系，这些序列已经利用重组DNA技术优选地产生。表达盒含有启动子和终止子的DNA分子，在启动子和终止子之间可以插入一段编码序列。编码序列一种DNA分子，当它转录并翻译后导致多肽或蛋白质的形成。基因一种不连续的染色体区，它含有负责控制表达即控制转录和翻译的调控DNA序列，以及控制当转录和翻译后形成不同的多肽或蛋白质的编码序列的调控DNA序列。本发明描述了NIM1基因的鉴别、分离和表征，它编码一个参与信号传导级联反应的蛋白质，其应答生物和化学诱导物，引起植物的系统获得性抗性。因此，本发明公开了编码参与引起植物系统获得性抗性的信号传导级联反应的NIM1蛋白之经分离的DNA分子(NIM1基因)。在本发明范围内描述了一个编码NIM1蛋白的DNA分子，在下列条件下杂交到克隆BAC-04，ATCC保藏号97543在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗一次，洗15分钟。在一个特别优选实施方案中，NIM1基因包含在克隆BAC-04，ATCC保藏号97543中。进一步描述了一个编码NIM1蛋白的DNA分子，在下列条件下杂交到粘粒D7，ATCC保藏号97736在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗一次，洗15分钟。在一个特别优选实施方案中，NIM1基因包含在粘粒D7，ATCC保藏号97736中。这里描述的NIM1基因可以分离自双子叶植物如拟南芥、烟草、黄瓜或番茄。或者，NIM1基因可以分离自单子叶植物如玉米、小麦或大麦。进一步描述了含有SEQIDNO3中公开的氨基酸序列编码的NIM1蛋白。进一步描述了NIM1基因编码序列在下列条件下与SEQIDNO2中公开的编码序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗三次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，洗15分钟。在一个特别优选实施方案中，NIM1基因编码序列含有在SEQIDNO2中公开的编码序列。本发明还描述了含有植物中有活性的启动子有效地连接到NIM1基因编码序列的嵌合基因，含有这种嵌合基因的重组载体，其中该载体能够稳定地转化到宿主中，以及用该载体稳定转化的宿主。优选地，宿主是植物，如一种下列农业上重要的作物水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。在一个特别优选实施方案中，NIM1蛋白在转化植物中以高于野生型植物的水平表达。本发明还涉及通过利用重组载体转化植物赋予植物CIM表型的方法，该重组载体含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地连接到NIM1基因编码序列的启动子，其中编码的NIM1蛋白在转化植物中以高于野生型植物的水平表达。而且，本发明涉及通过利用重组载体转化植物活化植物中系统获得性抗性的方法，该重组载体含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地连接到NIM1基因编码序列的启动子，其中编码的NIM1蛋白在转化植物中以高于野生型植物的水平表达。另外，本发明还涉及通过利用重组载体转化植物赋予植物广谱抗病性的方法，该重组载体含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地连接到NIM1基因编码序列的启动子，其中编码的NIM1蛋白在转化植物中以高于野生型植物的水平表达。本发明的另一个方面是利用认识到植物中的SAR途径表现出与哺乳动物和果蝇中的NF-κB/IκB调节策略在功能上相似，以及发现NIM1基因产物是哺乳动物信号传导因子IκB的α亚类的结构同系物。IκB的突变已被描述，其作用为超阻遏物或NF-κB/IκB调节策略的显性-负性调节子。本发明包括野生型NIM1基因(SEQNO2)的变形体，其作用为SAR信号传导途径的显性-负性调节子。这些NIM1的变形体赋予由其转化的植物以相反的表型如nim1突变型；植物，即用NIM1变形体转化的植物，表现出组成型SAR基因表达和CIM表型。本发明还包括根据此前定义能与本发明的DNA分子杂交的DNA分子，但优选地与一个寡核苷酸探针在中度严格的条件下杂交，该探针可从含有所说的NIM1变形体的连续编码序列的DNA分子中得到，它至少10个核苷酸长。影响杂交稳定性的因素决定杂交的严格度。一个这样的因素是熔解温度Tm，其可以根据在《DNA探针》，GeorgeH.Keller和MarkM.Manak编，Macmillan出版公司出版，1993年，第一部分分子杂交技术，自第8页起提供的公式容易地计算出来。优选的杂交温度是在大约低于计算的熔解温度Tm25℃的范围，优选地在大约低于计算的熔解温度Tm12-15℃的范围，对于寡核苷酸则在大约低于计算的熔解温度Tm5-10℃的范围。在本发明的一个实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物在相应于野生型拟南NIM1氨基酸序列(SEQIDNO3)的55和59位点的氨基酸位点上以丙氨酸取代了丝氨酸。一个NIM1基因变形体的优选实施方案的例子示于SEQIDNO22中，它导致了这些丝氨酸残基变为丙氨酸残基。在氨基酸位点55和59上具有丙氨酸取代丝氨酸的NIM1蛋白一个示范性的显性-负性形式示于SEQIDNO23。本发明还包括NIM1的等位基因的变形体，其中等位基因的编码序列在中度严格的条件下与SEQIDNO22中所示的编码序列杂交，特别优选是在下列条件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO22杂交的NIM1等位基因被改变，使得编码产物在相应于SEQIDNO22的位点55和59的氨基酸位点具有取代丝氨酸的丙氨酸。在本发明的另一个实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物的N-末端被截短，去除了可能作为潜在的遍在蛋白质化位点的赖氨酸残基，另外还去除了相应于野生型蛋白的位点55和59的氨基酸位点上的丝氨酸。这种NIM1基因变形体的优选实施方案的一个例子，编码具有N-末端缺失的基因产物，示于SEQIDNO24。具有N-末端缺失的NIM1蛋白的一个示范性的显性-负性形式示于SEQIDNO25。本发明还包括NIM1的等位基因的变形体，其中该等位基因的编码序列在中度严格的条件下与SEQIDNO24中所示的编码序列杂交，特别优选的是下列条件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO24杂交的NIM1等位基因被改变，使得编码产物N-末端缺失，去除了可能作为潜在的遍在蛋白质化位点的赖氨酸残基，另外还去除了相应于野生型基因产物的位点55和59的氨基酸位点上的丝氨酸。在本发明的另一个实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物的C-末端被截短，相信通过阻断在野生型基因产物C-末端的丝氨酸和苏氨酸残基的组成型磷酸化导致了内在稳定性的提高。这种NIM1基因变形体的优选实施方案的一个例子示于SEQIDNO26，其编码C-末端缺失的基因产物。具有C-末端缺失的NIM1蛋白的一个示范性的显性-负性形式示于SEQIDNO27。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中该等位基因的编码序列在中度严格的条件下与SEQIDNO26中所示的编码序列杂交，特别优选的是下列条件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO26杂交的NIM1等位基因被改变，使得编码产物C-末端缺失，去除了丝氨酸和苏氨酸残基。而在本发明的另一个实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物的N-末端缺失和C-末端被截短，其具有本发明的上述两个实施方案的优点。本发明的一个优选实施方案是NIM1蛋白的变形体，它在相应于SEQIDNO2的大约氨基酸位点1-125处的氨基酸的N-末端被截短，以及在相应于SEQIDNO3的大约氨基酸位点522-593处的C-末端被截短。这种NIM1基因变形体的优选实施方案的一个例子示于SEQIDNO28中，其编码基因N-末端和C-末端缺失的基因产物。具有C-末端缺失的NIM1蛋白的示范性的显性-负性形式示于SEQIDNO29中。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中该等位基因的编码序列在中度严格的条件下与SEQIDNO28中所示的编码序列杂交，特别优选的是下列条件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO28杂交的NIM1等位基因被改变，使得编码产物N-末端缺失，去除了可能作为潜在的遍在蛋白质化位点的赖氨酸残基，另外还去除了相应于野生型基因产物的位点55和59的氨基酸位点上的丝氨酸，以及C-末端缺失，去除了丝氨酸和苏氨酸残基。在本发明的甚至另一个实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物基本上仅仅由野生型基因产物的锚蛋白结构域组成。优选的是一个分离的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体基本上由相应于SEQIDNO3的大约氨基酸位点103-362的锚蛋白基元组成。这种NIM1基因变形体的优选实施方案的一个例子示于SEQIDNO30中，其编码锚蛋白结构域。基本上由锚蛋白结构域组成的NIM1蛋白的示范性的显性-负性形式示于SEQIDNO31中。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中该等位基因的编码序列在中度严格的条件下与SEQIDNO30中所示的编码序列杂交，特别优选的是下列条件在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO30杂交的NIM1等位基因被改变，使得编码产物基本上由野生型基因产物的锚蛋白结构域组成。因此，本发明涉及编码NIM1基因变形体的DNA分子，例如上述那些和利用中度严格条件与其杂交的所有DNA分子。本发明还包括含有在植物中有活性的启动子有效地连接到一个上述的NIM1基因变形体的嵌合基因，含有这种嵌合基因的重组载体，其中该载体能够稳定地转化到宿主中，以及用该载体稳定转化的宿主。优选地，宿主细胞是植物、植物细胞和其后代，例如一种下列农业上重要的作物水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦，黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。本发明还涉及通过利用重组载体转化植物赋予植物CIM表型的方法，该重组载体含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地连接到一个上述的NIM1基因变形体的启动子，其中编码显性-负性形式的NIM1蛋白在转化植物中表达并赋予植物CIM表型。而且，本发明涉及通过利用重组载体转化植物活化植物系统中获得性抗性的方法，该重组载体含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地连接到一个上述的NIM1基因变形体的启动子，其中编码显性-负性形式的NIM1蛋白在转化植物中表达并激活植物中的系统获得性抗性。另外，本发明还涉及通过利用重组载体转化植物赋予植物广谱抗病性的方法，该重组载体含有嵌合基因，嵌合基因本身含有在植物中有活性的有效地连接到一个上述的NIM1基因变形体的启动子，其中编码显性-负性形式的NIM1蛋白在转化植物中表达并赋予植物广谱抗病性。在另一个方面，本发明涉及筛选参与导致植物系统获得性抗性的信号传导级联反应的NIM1基因的方法，包括用一个在下列条件下与SEQIDNO2中所示的编码序列杂交的NIM1编码序列探查该植物的基因组或cDNA文库在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。本发明还包括下列内容一种根据本发明的经分离的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白的变形体在相应于SEQIDNO3的55和59位点的氨基酸处以丙氨酸取代了丝氨酸，其中该DNA分子在下列条件下与SEQIDNO22中所示的核苷酸序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。一种根据本发明的经分离的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白的变形体在相应于SEQIDNO3的大约1-125氨基酸位点的氨基酸处N-末端被截短，其中该DNA分子在下列条件下与SEQIDNO24中所示的核苷酸序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。一种根据本发明的经分离的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白的变形体在相应于SEQIDNO3的大约522-593氨基酸位点的氨基酸处C-末端被截短，其中该DNA分子在下列条件下与SEQIDNO26中所示的核苷酸序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。一种根据本发明的经分离的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白的变形体含有SEQIDNO28中所示的氨基酸序列，其中该DNA分子在下列条件下与SEQIDNO28中所示的核苷酸序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。一种根据本发明的经分离的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白的变形体基本上由相应于SEQIDNO3的大约103-362氨基酸位点处的锚蛋白基元组成，其中该DNA分子在下列条件下与SEQIDNO30中所示的核苷酸序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。一种通过诱变构建的本发明的NIM1基因的变形体。本发明的经分离的DNA分子激活植物细胞、植物及其后代中的系统获得性抗性的用途。本发明的经分离的DNA分子赋予植物细胞、植物及其后代广谱抗病性的用途。本发明的经分离的DNA分子赋予植物细胞、植物及其后代CIM表型的用途。本发明的抗性植物及其后代通过育种使抗病性状体现在植物种系中的用途。NIM1基因的变异体赋予由其转化的植物以抗病性并激活SAR基因表达的用途。一种产生NIM1基因变形体的方法。一种产生转基因亲本植物的转基因后代的方法，转基因植物含有编码本发明的NIM1蛋白变形体的经分离的DNA分子，该方法包括用本发明的重组载体分子转化亲本植物，并通过已知的植物育种技术将其性状转移到转基因亲本植物的后代中去。一种产生包括含有编码NIM1蛋白变形体的DNA部分之DNA部分的DNA分子的方法(a)制备能够与NIM1基因变形体或mRNA特异杂交的核苷酸探针，其中该探针包括编码NIM1变形体至少10个核苷酸长的序列的连续部分。(b)利用根据步骤(a)制备的核苷酸探针从选定的生物体之克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群体中探查其它NIM1变形体的编码序列；以及(c)分离并扩增包括含有编码NIM1蛋白变形体的DNA部分之DNA部分的DNA分子。一种分离含有NIM1变形体序列的DNA部分之DNA分子的方法，它包括(a)制备能够与NIM1基因变形体或mRNA特异杂交的核苷酸探针，其中该探针包括编码植物NIM1蛋白变形体序列至少10个核苷酸长的连续部分；(b)利用根据步骤(a)制备的核苷酸探针从选定的生物体之克隆的基因组DNA片段或cDNA片段群体中探查其它NIM1变形体编码序列；以及(c)分离包括含有NIM1基因变形体的DNA部分之DNA分子。一种产生表达水平高于野生型的NIM1基因或其功能变异体和突变型的转基因植物的方法。一种产生表达水平高于野生型的NIM1基因或其功能变异体和突变型的转基因植物的方法，其中NIM1基因的表达水平至少是野生型植物中的NIM1基因表达水平的2倍以上。一种产生表达水平高于野生型的NIM1基因或其功能变异体和突变型的转基因植物的方法，其中NIM1基因的表达水平至少是野生型植物中的NIM1基因表达水平的10倍以上。nim突变型表型本发明涉及突变型植物以及从其中分离的基因，它们对病原体感染的正常反应是缺陷的，这在于它们不能表达与SAR相关的基因。这些突变型是指nim突变型(非诱导免疫)，和根据它们对宿主植物的许多病原体菌株和病变型是敏感的，以及对通常不感染宿主植物而通常感染其它宿主的病原体也是敏感的这一特点而称为“广泛疾病敏感的”(UDS)。这些突变型可以这样选择到用诱变剂处理种子或其它生物材料，然后通过用已知的SAR化学诱导物处理后代植物选择UDS表型的后代植物，然后用已知的病原体感染植物。在这些环境下，非诱导突变型发生严重的病症，而野生型植物由化合物诱导产生系统获得性抗性。nim突变型可以从通过化学和辐射突变产生的群体中选择到，同样也可从通过T-DNA插入和转座子诱导突变产生的群体中选择到。产生突变型植物种系的技术在本领域是众所周知的。nim突变型可用作在田间发病实验中评价病害压力的指示物，所谓的野生型(即非突变型)植物的天然抗性表型可能有变化，因此不能提供敏感性的可靠标准。而且，nim植物还可用于候选抗病性转基因的实验。利用nim原种种系作为转基因受体，转基因对抗病性的贡献可以直接根据敏感性的基础水平进行评价。而且，nim也用于理解植物-病原体相互作用的工具中。nim宿主植物对病原体的攻击没有系统性反应，而且病原体不减弱的发生是一个理想的系统，其可用于研究它与宿主的生物学相互作用。nim宿主植物对于其通常敏感的宿主范围之外的病原体也可能是敏感的，这些植物还在宿主-病原体相互作用的分子、遗传和生物学研究中具有明显的实用性。而且，nim植物的UDS表型还使它们在杀真菌剂筛选方面有实用性。在特定的宿主中筛选的nim突变型对于利用宿主和宿主的病原体筛选杀真菌剂具有相当的实用性。其优越性在于突变型的UDS表型克服了宿主所面临的对不同的病原体和病变型具有不同敏感性，或对一些病原体和病变型甚至具抗性的问题。nim突变型对于利用异源宿主筛选针对一些病原体和病变型的杀真菌剂更具有实用性，异源宿主就是通常不属于特定病原体的宿主范围以内的宿主。因此，拟南芥的nim突变型对其它种类(如作物类植物)的病原体的敏感性促进了针对作物类植物的重要病原体之化合物中有效杀真菌剂的筛选过程。拟南芥nim1突变型在Delaney等，1995中描述了称为nim1(非诱导免疫)的拟南芥突变型，经INA处理后支持寄生霜霉(即霜霉病的致病菌)的生长。尽管nim1在被病原体感染后能够积累SA，但SAR基因表述和抗病性都不能被诱导，提示此突变阻断了SA的下游途径。nim1对INA或BTH的反应能力也受到损伤，提示此阻断存在于这些化学物作用的下游(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。通过将2周龄植物用0.33mMINA喷雾然后接种寄生霜霉，自80,000株T-DNA标记的拟南芥Issilewskija生态型(Ws-0)群体分离出第一个拟南芥nim1突变型(此处命名为nim1-1)(Delaney等，1995)。经INA处理后支持真菌生长的植物被选为推断的突变型。5个另外的突变型(此处命名为nim1-2、nim1-3、nim1-4、nim1-5和nim1-6)从甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的Ws-0群体的280,000株M2植物中分离。为确定突变型是显性的还是隐性的，将Ws-0植物用作花粉供体与这些突变型的每一个杂交。根据经INA处理后支持真菌生长的能力选择F1植物。如表3所示的例子，所有的nim1-1、nim1-2、nim1-3、nim1-4和nim1-6F1植物表型都是野生型，说明每个种系都是隐性突变。nim1-5在所有35个F1植物中表现nim表型，说明此特定突变是显性的。为证实这一点，利用nim1-5作为花粉供体给Ws-0植物受精进行互交。在这种情况下，所有18个F1植物表型都是nim，证明了nim1-5突变的显性。为确定nim1-2到nim1-6的突变是否为以前表征的nim1-1突变的等位基因，来自nim1-1的花粉用于给nim1-2到nim1-6受精。因为nim1-1带有卡那霉素抗性，通过抗生素抗性来鉴定F1子代。在所有情况下，卡那霉素抗性的F1植物为nim，说明它们都是nim1-1突变的等位基因。因为nim1-5突变是显性的而且很明显突变是纯合的，就必须分析在F2代中nim1-1的互补作用。如果nim1-1和nim1-5是等位基因，那么预期所有的F2植物都具nim表型。如果不是的话，那么16株F2植物中的13株将预期具有nim表型。94株植物中的88株在INA处理后确实支持真菌生长。6株植物显示叶片上有黑斑的相关表型，为损伤模拟表型的痕迹，经INA处理后几乎不支持真菌生长。因为nim1-5带有NIM1基因中的点突变(参见下文)，它被视为一个nim1等位基因。为了确定不同nim1等位基因的相对强度，用SA、INA或BTH预处理后分析每个突变体在正常生长条件下寄生霜霉的生长。如表1所示，在正常生长时，nim1-1、nim1-2、nim1-3、nim1-4和nim1-6都支持大约相同速率的真菌生长，比Ws-0对照稍微快一些。nim1-5是例外，其中真菌的生长相对于其它nim1突变型和Ws-0对照而言被延迟了数天，但最终所有的nim1-5植物都死于真菌。SA处理后，突变型可以分成三类nim1-4和nim1-6表现相对较快的真菌生长；nim1-1、nim1-2和nim1-3植物表现稍微慢速的真菌生长；在nim1-5中的真菌生长比未处理的Ws-0对照的生长速率更慢。INA或BTH处理后，突变型似乎也可以分为三类，其中nim1-4是经化学处理后限制真菌生长的能力受到最严重损害的；nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6都受到中等损害；而nim1-5仅受到轻微损害。在这些实验中，Ws-0经INA或BTH处理后不支持真菌生长。于是，从经化学处理后抑制真菌生长来看，突变型分为三类，nim1-4受到最严重损害，nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6显示中等的对真菌的抑制，而nim1-5的真菌抗性仅有轻微损害。PR-1mRNA的积累也用作表征不同nim1等位基因的标准。用水或化学处理后三天，或接种相容性真菌(寄生霜霉分离物Emwa)14天后，从植物中提取RNA。图3中的RNA凝胶印迹显示经SA、INA或BTH处理或被寄生霜霉感染的野生型植物其PR-1mRNA积累到很高水平。相对于野生型，在nim1-1、nim1-2和nim1-3植物中PR-1mRNA的积累经化学处理后急剧下降。经寄生霜霉感染后PR-1mRNA也下降，但在这些突变型中仍有一些积累。在nim1-4和nim1-6植物中，相对于其它等位基因，经化学处理后PR-1mRNA的积累下降更急剧(长时间暴露更明显)，而被寄生霜霉感染后PR-1mRNA的积累显著降低，这支持了它们是特别强的nim1等位基因的观点。有趣的是，PR-1mRNA的积累在nim1-5中提高了，但只是经化学处理或寄生霜霉感染后被轻微诱导。根据PR-1mRNA的积累和真菌感染，突变型分为三类被严重损害的等位基因(nim1-4和nim1-6)；被中等损害的等位基因(nim1-1、nim1-2和nim1-3)；以及被轻度损害的等位基因(nim1-5)。nim1突变的精细结构作图为了确定NIM1的粗略的图谱位置，鉴定了来自nim1-1(Ws-0)和Landsbergerecta(Ler)杂交的74株F2nim表型植物对寄生霜霉的敏感性和经INA处理后失去了积累PR-1mRNA的情况。在测试了许多简单序列长度多态性(SSLP)标记后(Bell和Ecker，1994)，发现nim1位于染色体1的短臂上距nga128约8.2厘摩(cM)、距nga111约8.2cM的位置。在随后的分析中，发现nim1-1位于nga111和SSLP标记ATHGENEA约4cM之间。为了精细结构作图，根据它们不能积累PR-1mRNA和经INA处理后支持真菌生长的能力，鉴定了衍生自nim1-1和1erDP23杂交F2群体的1138株nim植物。从这些植物中提取DNA并在ATHGENEA和nga111上检查接合性。如图5A-5D中所示，93个重组染色体被鉴定位于ATHGENEA和nim1之间，遗传距离大约为4.1cM(93比2276)，以及239个重组染色体被鉴定位于nga111和nim1之间，表示遗传距离大约为10.5cM(239比2276)。在ATHGENEA到nga111的间隔中有信息的重组子被进一步利用扩增片段长度多态性(AFLP)进行分析(Vos等，1995)。开始，鉴定了位于ATHGENEA和nga111之间的10个AFLP标记，并利用它们构建了该区域的低分辨率图谱(图5A)。AFLP标记W84.2(距nim11cM)和W85.1(距nim10.6cM)被用于从CIC(Centred′EtudeduPolymorphismeHumain，INRA和CNRS)文库中分离酵母人工染色体(YAC)克隆(Creusot等，1995)。用标记W84.2鉴定了两个YAC克隆，CIC12H07和CIC12F04；用标记W85.1鉴定了两个YAC克隆，CIC7E03和CIC10G07(数据没有列出)。但是，确定在两套邻近YAC克隆之间有一个裂隙。从这一点，细菌人工染色体(BAC)和重叠了CIC12H07和CIC12F04的P1克隆被分离并作图，然后通过三个顺序步行步骤将BAC/P1毗连序列群向NIM1延伸(Liu等，1995；Chio等，1995)。在步行的不同时间，产生了对BAC或P1克隆特异的新AFLP，它们被用于确定NIM1基因是否被交叉(cross)。确定了当分离BAC和P1克隆时交叉了NIM1，产生了AFLP标记L84.6a和L84.8。发现于P1克隆P1-18、P1-17和P1-21的AFLP标记鉴定了三个重组子，发现于P1克隆P1-20、P1-22和P1-23和P1-24及BAC克隆的AFLP标记鉴定了一个重组子。因为这些克隆重叠形成了大的毗连序列群(＞100kb)，并包含邻近nim1的AFLP标记，该基因被定位于毗连序列群上。含有毗连序列群的BAC和P1克隆被用于产生8个另外的AFLP标记，这说明nim1位于L84.Y1和L84.8之间，代表一个约0.09cM的裂隙。利用BAC-06、BAC-04和P1-18的DNA在土壤杆菌相容的T-DNA粘粒载体pCLD04541中构建了粘粒文库。利用衍生自这些克隆的AFLP标记形成了一个粘粒毗连序列群。物理作图显示L84.Y1和L84.8之间的物理距离大于90kb，表示遗传距离和物理距离之比为每cM大约1兆碱基。为了有利于后面鉴定NIM1基因，测定了BAC-04的DNA序列。NIM1基因的分离为了鉴定哪个粘粒含有NIM1基因，实施例的表4中列出的12个粘粒被转化至nim1-1，根据它们互补突变型表型的能力评价转化子。通过测定经INA处理后转化子积累PR-1mRNA的能力，发现粘粒D5、E1和D7都互补nim1-1。对这些粘粒的末端进行测序，发现它们位于BAC-04的DNA序列上。在此DNA区域有9918个碱基对由含有NIM1基因的D7和D5所共享。如图5D中所示，在这个10kb序列上鉴定了四个推断的基因区段。区段1能够潜在地编码一个19105D的蛋白质，区段3能够编码一个44554D的蛋白质，而区段4能够编码一个52797D的蛋白质。区段2具有4个紧紧连在一起的不同大小的开放阅读框，提示是一个有三个内含子的基因。利用NetPlantGene程序(Hebsgoard等，1996)分析显示很可能开放阅读框可被一起剪接以形成一个编码66039D的大的开放阅读框。为确定哪个基因区段含有NIM1基因，含有分离自经水或化学处理后的Ws-0和不同nim1突变型之叶片组织的RNA的凝胶印迹，用来自四个基因区段中每一个区段的DNA进行探查。在这些实验中，注意将探针标记成高比活力并且放射自显影曝光1周以上。在我们过去的经验中，这些条件可检测RNA的浓度为大约每个细胞一个拷贝。产生可检测到的RNA之唯一的基因区域是基因区2。如图7中所示，用基因区2探针鉴定的mRNA由BTH处理野生型植物所诱导，但并不是在任何突变型中都这样。而且，被寄生霜霉感染后所有植物的RNA积累都提高了，说明这个特定的基因在病原体感染后被诱导。为了进一步建立编码NIM1的基因区，检测了四个基因区中每一个的DNA序列之nim1等位基因，并与相应的Ws-0的基因区相比较。在Ws-0和基因区3或4的突变型等位基因之间没有检测到突变，仅仅在nim1-6突变型的基因区段1中发现了一个改变。但是，在区段2相对于Ws-0的每个等位基因中都发现有单个碱基对突变。基因区段2的DNA序列示于图6中。如表5和图6中所示，在nim1-1中，在位点3579插入引起移码的单个腺嘌呤导致七个氨基酸改变以及349个氨基酸的缺失。在nim1-2中，在位点3763有胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换使组氨酸变成酪氨酸。在nim1-3中，在位点3301删除单个腺嘌呤引起改变了10个氨基酸的移码并从预期的蛋白质中缺失了412个氨基酸。有趣的是，nim1-4和nim1-5二者都在位点4160处有鸟嘌呤到腺嘌呤的转换使精氨酸变成赖氨酸，而在nim1-6中，有一个胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换导致终止子，引起从预期蛋白质中缺失了255个氨基酸。尽管nim1-4和nim1-5中的突变改变了mRNA的共有供体剪接位点，RT-PCR分析表明此突变没有引起mRNA剪接的改变(数据未给出)。NIM1同系物基因区段2的DNA序列被用于Blast搜索(Altschul等，1990)，并鉴定了一个与拟南芥表达序列标签(EST)T22612完全相符合的序列，以及与水稻ESTS2556、S2861、S3060和S3481明显相符合的序列(见图8)。覆盖2081至3266碱基对的DNA探针用于筛选拟南芥cDNA文库，并分离到14个相应于基因区段2的克隆。从cDNA序列中，我们能够确证在图6中所示的外显子/内含子边界的排列。用来自INA处理的Ws-0植物的RNA通过聚合酶链反应进行cDNA末端快速扩增(RACE)，可能的转录起始位点确定为图6中位点2588的A。利用NIM1cDNA作探针，可以鉴定拟南芥NIM1的同系物，并通过筛选不同植物的基因组或cDNA文库而分离，这些植物如，但不限于下列作物类植物水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。完成上述过程的标准技术包括杂交筛选平板DNA文库(或是噬菌斑或是菌落，参阅，例如Sambrook等《分子克隆》，冷泉港实验室出版，(1989))和利用寡核苷酸引物通过PCR进行扩增(参阅，例如，Innis等，《PCR技术方法与应用指南》，学院出版社(1990))。被鉴定的同系物通过遗传工程连入下列表达载体，并转化到上述作物中。利用供试植物的相关病原体评价转化子的抗病性增强。例如，通过DNA印迹分析检测了黄瓜、蕃茄、烟草、玉米、小麦和大麦的基因组的NIM1同系物。从黄瓜、蕃茄、烟草、玉米、小麦和大麦中分离了基因组DNA，用BamHI、HindIII、XbaI和SalI酶进行限制性酶切，在0.8％琼脂糖凝胶电泳分离并通过毛细管印迹转移到尼龙膜上。紫外交联吸附DNA后，将膜在低严格条件下杂交(1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时)将膜用32P放射性标记的拟南芥NIM1cDNA杂交。然后杂交印迹在低严格条件下洗涤(6×SSC中洗3次，每次15分钟，3×SSC中洗1次，15分钟，55℃；1×SSC是0.15MNaCl、15mM柠檬酸钠(pH7.0))，并在X-光胶片上曝光使相应于NIM1的条带变得可见。另外，被鉴定与NIM1基因相似的表达序列标签(EST)如上述水稻EST也可用于分离同系物。水稻的EST对于从其它单子叶植物中分离NIM1同系物特别有用。同系物还可以通过PCR得到。在这个方法中，比较了已知的同系物(例如水稻和拟南芥)。氨基酸和DNA高度相似或相同的区段被用于制作PCR引物。一旦鉴定了一个合适的区段，就可以制作该区段的在第3位密码子有各种替换的引物。在不同标准条件下进行cDNA或基因组DNA的PCR反应。当一条带出现时，此带被克隆和/或测序以确定它是否为NIM1同系物。NIM1的过量表达赋予植物抗病性本发明还涉及表达水平高于野生型的NIM1基因、或其功能变异体和突变型并且籍此具有广谱抗病性的转基因植物的产生。在本发明的一个优选实施方案中，NIM1基因的表达水平至少是野生型植物NIM1基因表达水平的2倍以上，并且优选地为野生型表达水平的10倍以上。NIM1基因的过量表达模拟了诱导化合物的作用，其在于产生带组成型免疫(CIM)表型的植物。描述了一些产生过量表达NIM1基因并籍此具有CIM表型的植物的方法。第一个方法是选择高水平表达NIM1并由于插入位点效应具有CIM表型的转化植物。表6显示了许多转化子对真菌感染之抗性的测试结果。从这个表中可以看出，大量转化子显示出比正常水平低的真菌生长，并且有几个转化子完全不显示可见的真菌生长。从收集的样品中制备RNA并按Delaney等，1995中所述加以分析。将印迹与拟南芥基因探针PR-1杂交(Uknes等，1992)。三条线显示PR-1基因表达的早期诱导，真菌处理后24或48小时PR-1mRNA可见。这三条线还表示对真菌感染的抗性。另外，描述了构建植物转化载体的方法，载体含有组成型的植物活性启动子，例如CaMV的35S启动子，其有效地连接到编码活性NIM1蛋白的编码区。高水平的活性NIM1蛋白产生如用BTH、INA和SA等诱导物进行化学诱导相同的抗病性效果。NIM1基因是IκBα的同系物NIM1基因是植物中的系统获得性抗性(SAR)途径的主要成分(Ryals等，1996)。NIM1基因与化学或生物诱导物对SAR的激活相关，并与这些诱导物一起为SAR和SAR基因表达所需。通过分子生物学分析已知携带突变型nim1基因的突变型植物之基因组，确定了NIM1基因的位置，突变型nim1基因使宿主植物对大量病原体极端敏感，并使它们不能应答病原体和SAR的化学诱导物。拟南芥的野生型NIM1基因已被作图并测序(SEQIDNO2)。野生型NIM1基因产物(SEQIDNO3)参与导致拟南芥中的SAR和基因对基因抗病性的信号传导级联反应(Ryals等，1997)。野生型形式的NIM1的重组过量表达造成带组成型免疫(CIM)表型的植物并因此赋予转基因植物抗病性。活性NIM1蛋白水平的增加产生了如用BTH、INA和SA等诱导化学物进行化学诱导相同的抗病作用。NIM1基因的序列(SEQIDNO2)被用于BLAST搜索，根据在许多蛋白质中发现的锚蛋白结构域与在NIM1基因序列中一个高度保守的结构域的同源性鉴定了相符合的序列，这些蛋白质如血影蛋白、锚蛋白、NF-κB和IκB(Michaely和Bennett，细胞生物学进展(TrendsCellBiol.)2，127-129(1992))。但是除了锚蛋白基元以外，传统计算机分析没有检测到其它强的同源性，包括与IκBα的同源性。尽管计算机程序失败了，在NIM1蛋白(SEQIDNO3)和70个已知含锚蛋白的蛋白质之间进行了智能配对可视检测(pair-wisevisualinspection)，并且发现了与IκBα类转录调控因子成员的惊人的相似性(Baeuerle和Baltimore1996；Baldwin1996)。如图9中所示，NIM1蛋白(SEQIDNO3)与小鼠、大鼠和猪的IκBα(分别为SEQIDNOs18、19和20)具有显著的同源性。在全长的蛋白质中NIM1含有几个重要的IκBα结构域，包括锚蛋白结构域(在图9中以虚下划线表示)、2个氨基末端丝氨酸(NIM1的氨基酸55和59)、一对赖氨酸(NIM1的氨基酸99和100)和一个酸性C-末端。总的来说，NIM1和IκBα具有30％相同的残基和50％残基的保守性替换。因此，在IκBα和NIM1整个蛋白之间具有同源性，总的相似性为80％。IκBα蛋白在信号传导中起作用的一个途径是通过与胞质转录因子NF-κB结合，阻止它进入核内并改变靶基因的转录(Baeuerle和Baltimore1996；Baldwin1996)。NF-κB的靶基因调节(激活或抑制)几个细胞过程，包括抗病毒、抗微生物和细胞死亡反应(Baeuerle和Baltimore1996)。当信号传导途径被激活时，IκBα在两个丝氨酸残基(小鼠IκBα的氨基酸32和36)上被磷酸化。这就在两个赖氨酸(小鼠IκBα的氨基酸21和22)上安排了遍在蛋白质化。遍在蛋白质化后，NF-κB/IκB复合物通过蛋白体被指定了路径，其中IκBα被降解而NF-κB被释放到细胞核。在IκBα功能中重要的磷酸化丝氨酸残基在NIM1中被保留在从氨基酸35到84的保守序列的一个大的连续区域中(图9)。在IκBα中两个赖氨酸位于距蛋白质N-末端大约15个氨基酸处，与此相反，在NIM1中两个赖氨酸位于距C-末端大约40个氨基酸处。而且，NIM1和IκBα之间在富含丝氨酸/苏氨酸的羧基末端区存在高度的同源性，羧基末端区已经显示出在基础转换速率中很重要(Sun等，分子细胞生物学16，1058-1065(1996))。根据本发明，在结构同源性分析和存在已知对IκBα的功能很重要的元件之基础上，期望NIM1象IκBα一样起作用，对植物基因调控具有相似的效果。预料当用诱导化学品处理时含有野生型NIM1基因的植物具有更多的基因产物(IκB同系物)或更少的NIM1基因产物(IκB同系物)被磷酸化。按照这一模式，结果是植物的NF-κB同系物被排除在细胞核外，SAR基因表达和抗性反应得以发生。在nim1突变型植物中存在一个非功能性的NIM1基因。因此，按照这一模式，NF-κB同系物能够到达细胞核并阻遏抗性及SAR基因的表达。与这一思想相符，用水杨酸处理的动物细胞表现出增强的稳定性/丰富的IκB以及细胞核中活性NF-κB的减少(Kopp和Ghosh，1994)。IκB的突变已知作为超阻遏物或显性-负性(Britta-MareenTraenckner等，EMBO142876-2883(1995)；Brown等，科学2671485-1488(1996)；Brockman等，分子和细胞生物学152809-2818(1995)；Wang等，科学274784-787(1996))。这些突变型形式的IκB与NF-κB结合但并不被磷酸化或遍在蛋白质化，因此不被降解。NF-κB仍与IκB结合而不能进入细胞核。NIM1基因的变形体从上面来看，本发明包括作为SAR信号传导途径显性-负性调节物的NIM1的变形体。用这些显性负性形式的NIM1转化的植物具有与nim1突变型植物相反的表型，即用NIM1变形体转化的植物表现组成型SAR基因表达并因此具有CIM表型。由于在SAR信号传导途径中NIM1基因所在的位点，期望除了此处特别公开的那些以外的基因的许多改变将导致SAR基因的组成型表达并因此形成的CIM表型。人IκBα中丝氨酸残基的磷酸化是刺激IκBα的活化降解所需的，并因此激活NF-κB。人IκBα中的丝氨酸残基(S32和S36)突变为丙氨酸残基抑制了刺激-诱导的磷酸化，因此阻断了IκBα的蛋白体-介导的降解(Traenckner等，1995；Brown等，1996；Brockman等，1995；Wang等，1996)。这种IκBα变形体可以作为显性-负性形式通过将NF-κB保留在胞质中而阻断下游信号传导事件。根据比较图9所示NIM1和IκB的氨基酸序列，NIM1(SEQIDNO3)的丝氨酸55(S55)和59(S59)与人IκBα的S32和S36同源。为构建NIM1的显性-负性形式，在氨基酸位点55和59的丝氨酸被突变为丙氨酸残基。于是，在本发明的一个优选实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物在相应于拟南芥NIM1氨基酸序列的位点55和59的氨基酸位点上由丙氨酸代替了丝氨酸。本发明还包括用这种NIM1基因变形体转化的抗病性转基因植物，以及利用这种NIM1基因变形体赋予所转化的植物以抗病性并激活SAR基因表达的方法。人IκBα的氨基酸1-36(Brockman等，1995)或1-72(Sun等，1996)缺失后，由于缺失部分含有遍在蛋白质化赖氨酸残基K21和K22以及磷酸化位点S32和S36，导致了被转染的人细胞培养物的显性-负性IκBα表型。NIM1基因产物N-末端的前125个氨基酸的缺失去除了作为遍在蛋白质化位点的8个赖氨酸残基以及上述推断的磷酸化位点S55和S59。因此，在本发明的一个优选实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物与天然拟南芥NIM1的氨基酸序列相比丢失了大约前125个氨基酸。本发明还包括用这种NIM1基因变形体转化的抗病性转基因植物，以及利用这种NIM1基因变形体赋予所转化的植物以抗病性并激活SAR基因表达的方法。人IκBα的氨基酸261-317的缺失可能通过阻断C-末端的丝氨酸和苏氨酸残基的组成型磷酸化而导致内在稳定性提高。预期这种改变形式的IκBα以显性-负性形式起作用。一个富含丝氨酸和苏氨酸的区域存在于NIM1C-末端的氨基酸522-593处。于是，在本发明的一个优选实施方案中，NIM1基因被改变，使得编码产物与天然拟南芥NIM1的氨基酸序列相比丢失了大约其C-末端部分，包括氨基酸522-593。本发明还包括用这种NIM1基因变形体转化的抗病性转基因植物，以及利用这种NIM1基因变形体赋予所转化的植物以抗病性并激活SAR基因表达的方法。在本发明的另一个实施方案中，NIM1基因产物的变形体是由于C-末端和N-末端片段缺失或形成嵌合体而产生的。而在本发明的另一个实施方案中，提供了含有来自NIM1基因的锚蛋白结构域的构件。本发明包括用这种NIM1嵌合体或锚蛋白构件转化的抗病性转基因植物，以及利用NIM1基因的这些变异体赋予所转化的植物以抗病性并激活SAR基因表达的方法。本发明涉及编码如上述NIM1基因变形体的DNA分子，含有这种DNA分子的表达载体，以及由其转化的植物和植物细胞。本发明还涉及通过用编码NIM1基因产物变形体的DNA分子转化植物而激活植物中的SAR并赋予植物CIM表型和广谱抗病性的方法。本发明另外涉及用NIM1基因变形体转化的植物。抗病性在植物中过量表达野生型NIM1基因和在植物中表达NIM1基因变形体使植物对大量植物病原体产生免疫，病原体包括但并不限于病毒或类病毒，如烟草或黄瓜花叶病毒、环斑病毒或坏死病毒、天竺葵卷叶病毒、红花草斑点病毒、烟草丛矮病毒、以及其它病毒；真菌，如寄生疫霉(Phythophthoraparasitica)和烟草霜霉(Peronosporatabacina)；细菌，如丁香假单胞菌和烟草假单胞菌(Pseudomonastabaci)；昆虫如蚜虫，如桃蚜(Myzuspersicae)；和鳞翅目如棉铃虫(Heliothisspp.)；以及线虫，如南方根结线虫(Meloidogyneincognita)。本发明的载体和方法有助于控制许多病原生物体，包括但并不限于霜霉病菌如大孢子指疫霉(Scleropthoramacrospora)，玉米褐条霜霉(Scleropthorarayissiae)，禾生指梗霉(Sclerosporagraminicola)，Peronosclerosporasorghi，Peronosclerosporaphilippinensis，Peronosclerosporasacchari和Peronosclerosporamaydis；锈菌如高粱柄锈菌(Pucciniasorphi)，多堆柄锈菌(Pucciniapolysora)和Physopellazeae；其它真菌如Cercosporazeae-maydis，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，串珠镰孢菌(Fusariumnoliforme)，玉蜀黍赤霉菌(Gibberellazeae)，Exserohilumturcicum，玉蜀黍球梗孢(Kabatielluzeae)，禾白粉菌(Erysiphegraminis)，壳针孢(Septoria)和Bipolarismaydis；以及细菌如斯氏欧文氏菌(Erwiniastewartii)。本发明的方法可用于赋予多种植物抗病性，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。尽管可以赋予这些大类的任何植物以抗病性，但对于农业上的重要作物类植物特别有用，例如水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。被转化的细胞可以再生为整株植物从而该基因赋予完整的转基因植物以抗病性。可以改造表达系统使抗病基因连续或组成型表达。重组DNA技术通过诱导SAR基因表达赋予植物抗病性的NIM1DNA分子或基因片段，或通过提高SAR基因表达赋予植物抗病性的NIM1基因变形体均可以利用传统的重组DNA技术导入植物或细菌细胞。通常地，这些技术包括将含有SEQIDNO1或其功能变异体或上述编码NIM1变形体的分子插入到与DNA分子异源(即正常不存在的)的表达系统中。异源DNA分子以合适的方向和正确的阅读框的形式插入到表达系统中。载体含有插入的蛋白质编码序列转录和翻译所需的元件。可以采用本领域已知的多种载体系统，例如质粒、噬菌体病毒和其它经改造的病毒。合适的载体包括但不限于，病毒载体如λ载体系统λgtl1、λgtl10和Charon4；质粒载体如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII；以及其它相似的系统。此处描述的NIM1编码序列和改变的NIM1编码序列可以利用本领域的标准程序克隆到载体中，如Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1982)中所述。为了使本发明的基因或基因片段有效表达，在表达载体中必须存在一个能够导致有效表达水平或组成型表达的启动子。RNA聚合酶通常与启动子结合并起始基因的转录。启动子的强度即启动转录的能力有所不同。根据采用的宿主细胞系统，可以采用任何一个或多个合适的启动子。表达盒的成分可以被改造以提高表达。例如，可以采用被截短的序列、核苷酸替换或其它改造。经这种改造的表达系统转化的植物细胞可表现出过量表达或组成型表达活化SAR所需的基因。A.植物转化载体的构建许多转化载体可用于植物转化，并且本发明的基因可以与任何这些载体联合使用。载体的选择依赖于优选的转化技术和转化的目标品种。对于确定的目标品种，不同的抗生素或除草剂选择标记是优选的。在转化中常规采用的选择标记包括赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983))、赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等，核酸研究181062(1990)，Spencer等，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet)79625-631(1990))、赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学42929-2931)和赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBOJ.2(7)1099-1104(1983))以及赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利4,940,935和5,188,642)。1.合适土壤杆菌转化的载体许多载体可用于根癌土壤杆菌转化。它们一般携带至少一个T-DNA边界序列并包括载体如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ。下面描述了两个典型的载体。a.pCIB200和pCIB2001双元载体pCIB200和pCIB2001被用于构建利用土壤杆菌的重组载体并以下列方式进行构建。pTJS75kan是通过用NarI酶切pTJS75构建的(Schmidhauser和Helinski，细菌学杂志164446-455(1985))允许删除了四环素抗性基因，随后插入了来自携带NPTII的pUC4K的AccI片段(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)Bevan等，自然304184-187(1983)McBride等，植物分子生物学14266-276(1990))。XhoI衔接物(linker)连接到pCIB7的EcoRV片段上，它含有T-DNA的左右边界、一个植物选择性nos/nptII嵌合基因和pUC多衔接物(polylinker)(Rothstein等，基因53153-161(1987))，XohI酶切的片段被克隆到SalI酶切的pTJS75kan形成pCIB200(参阅EP0332104，实施例19)。pCIB200含有下列独特的多衔接物限制位点EcoRI，SstI，KpnI，BgIII，XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，其是通过在多衔接物中插入另外的限制位点而建立的。pCIB2001中多衔接物的单一限制位点是EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI，SalI，MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。除了含有这些单一限制位点以外，pCIB2001还具有植物和细菌的卡那霉素选择性、用于土壤杆菌介导的转化的T-DNA左右边界、RK2衍生的在大肠杆菌和其它宿主之间移动的trfA功能件(function)，以及同样来自RK2的OriT和OriV功能件。pCIB2001多衔接物适用于克隆含有其自身调控信号的植物表达盒。b.pCIB10和它的潮霉素选择衍生物双元载体pCIB10含有用于在植物中选择的编码卡那霉素抗性的基因和T-DNA左右边界序列，并结合了来自宽宿主范围质粒pRK252的序列，使它能够在大肠杆菌和土壤杆菌中复制。Rothstein等描述了它的构建(基因，53153-161(1987))。构建了pCIB10的多种衍生物，它们结合了由Gritz等描述的潮霉素B磷酸转移酶基因(基因25179-188(1983))。这些衍生物使之能够仅仅依靠潮霉素选择转基因植物细胞，或依靠潮霉素和卡那霉素选择(pCIB715，pCIB717)。2.适合非土壤杆菌转化的载体不用根癌土壤杆菌的转化克服了在所选转化载体中对T-DNA序列的需要，从而除了如上述含有T-DNA序列的这些载体以外，还可以采用缺少这些序列的载体。不依赖土壤杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体吸收(如PEG和电穿孔)和显微注射。载体的选择很大程度上依赖于对转化品种的优选选择。a.pCIB3064pCIB3064是一个pUC衍生的载体，适合于结合通过除草剂basta(或膦丝菌素)的选择的直接基因转移技术。质粒pCIB246包含有效地融合到大肠杆菌GUS基因的CaMV35S启动子和CaMV35S转录终止子，在PCT申请WO93/07278中描述了此质粒。该载体的35S启动子在起始位点的5’端含有两个ATG序列。这些位点用标准PCR技术诱变，去除两个ATG并形成限制位点SspI和PvuII。新的限制位点是距单一的SalI位点96和37bp，距真正起始位点101和42bp的。形成的pCIB246衍生物命名为pCIB3025。然后通过用SalI和SacI酶切将GUS基因从pCIB3025中去除，产生平末端并重新连接起来形成质粒pCIB3060。质粒pJIT82获自JohnInnesCentre，Norwich，含有来自绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)的bar基因之400bp的SmaI片段被切下并插入到pCIB3060的HpaI位点(Thompson等EMBOJ62519-2523(1987))。这就产生了pCIB3064，它含有受CaMV35S启动子和终止子控制用于除草剂选择的bar基因，一个氨苄抗性基因(用于在大肠杆菌中选择)和一个具有单一位点SphI，PstI，HindIII和BamHI的多衔接物。此载体适用于克隆含有其自身调控信号的植物表达盒。b.pSOG19和pSOG35pSOG35是利用大肠杆菌的二氢叶酸还原酶基因(DFR)赋予对氨甲喋呤抗性作为选择标记转化载体。用PCR扩增35S启动子(-800bp)、玉米Adh1基因的内含子6(-550bp)和pSOG10的GUS非翻译前导序列的18bp。编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II基因的250bp的片段也用PCR扩增，这两个PCR片段与pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段组装，该片段含有pUC19载体骨架和胭脂碱合成酶终止子。这些片段组装成pSOG19，它含有与内含子6序列、GUS前导序列、DHFR基因和胭脂碱合成酶终止子相融合的35S启动子。将pSOG19中的GUS前导序列替换成玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)形成载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带氨苄青霉素抗性的pUC基因并具有适合克隆外源序列的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位点。B.构建植物表达盒的需求要想在转基因植物中表达的基因序列首先被组装到表达盒中位于合适的高水平表达启动子之后、合适的转录终止子的上游。这些表达盒可以容易地转化到上述植物转化载体中。1.启动子选择用于表达盒中的启动子的选择将决定转基因在转基因植物中的空间和时间表达方式。所选的启动子将在特定的细胞类型(例如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮层细胞)或在特定的组织或器官(例如根、叶或花)中表达转基因，并且这种选择将反映NIM1基因产物或NIM1基因产物变形体期望积累的目的部位。可选择地，所选的启动子可能驱动处于光诱导或其它时间调控启动子调控下的基因的表达。a.组成型表达，CaMV35S启动子质粒pCGN1761的构建在公开专利申请EP0392225(实施例23)中有描述，在此引入作为参考。pCGN1761含有“双”35S启动子和tml转录终止子，在启动子和终止子之间有单一EcoRI位点并具有pUC型骨架。构建了pCGN1761的一个衍生物，它具有除了已有的EcoRI位点外还含有带NotI和XhoI位点的经改造的多衔接物。这个衍生物被命名为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于在其多衔接物内克隆cDNA序列或基因序列(包括微生物的ORF序列)，目的是为了在转基因植物中的35S启动子控制下进行表达。整个35S启动子-基因序列-tml终止子盒这样一个构件可以在启动子5’端的HindIII、SphI、SalI和XbaI位点和终止子3’端的XbaI、BamHI和BgaII位点被剪切以转入如上述的转化载体。而且，双35S启动子片段可在5’通过HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI剪切除去，以及在3’通过任何一个多衔接物限制位点(EcoRI，NotI或XhoI)剪切除去，用其它启动子加以替换。b.通过优化转录起始位点改造pCGN1761ENX对任何一个此处描述的构件，围绕克隆位点的改造可以通过引入可增强翻译的序列来进行。当需要过量表达时这尤其有用。将pCGN1761ENX用SphI酶切，用T4DNA聚合酶处理并连接，因此破坏了位于双35S启动子5’侧的SphI位点。这样形成了载体pCGN1761ENX/Sph-。pCGN1761ENX/Sph-用EcoRI酶切，并与一个序列退火的分子接头(adaptor)连接，其序列为5’-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3′/5’-AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3′(SEQIDNO12和13)。这样形成了载体pCGNSENX，其含有准优化的植物转录起始序列TAAA-C，它与ATG相邻，而ATG本身是SphI位点的一部分，它适合于在其起始甲硫氨酸处克隆异源基因。SphI位点下游的EcoRI、NotI和XohI位点被保留。利用在起始ATGNcoI位点构建了另一个载体。这个载体命名为pCGN1761NENX，是通过在pCGN1761ENXEcoRI位点插入一个序列退火的分子接头构建的，该序列为5’-AATTCTAAACCATGGCGATCGG-3’/5′-AATTCCGATCGCCATGGTTTA-3′(SEQIDNO14和15)。这样载体含有与起始ATG相邻的准优化的序列TAAACC，ATG处于NcoI位点内。下游位点是EcoRI，NotI和XhoI。但是进行此操作前，pCGN1761ENX载体中的两个NcoI位点(在35S启动子单位的上游位点)被破坏，所采用的是与那些上述用于SphI的相似技术或替代地采用“内-外”(inside-outside)PCR技术。Innes等《PCR技术方法与应用指南》。学院出版社，纽约(1990)。可以通过将任何植物cDNA或报告基因插入到克隆位点并进行在植物中的常规表达分析来评价此操作任何可能的对表达有害的效应。c.在化学/病原体调节启动子控制下的表达pCGN1761ENX中的双35S启动子可以替换为可导致合适的高表达水平的任何一个其它所选启动子。例如，一个化学调节的PR-1启动子(在美国专利5,614,395中有描述，在此完整引入作为参考)可以替换双35S启动子。优选地所选的这个启动子被用限制性酶从它的原始来源中剪切，但是还可以用携带适当末端限制位点的引物进行PCR扩增。如果进行PCR扩增，那么在扩增启动子被克隆到目标载体后启动子应该重新测序以检查扩增错误。化学/病原体调节的烟草PR-1a启动子剪切自质粒pCIB1004(参阅EP0332104，实施例21的构建，在此引入作为参考)，并转移到质粒pCGN1761ENX(Uknes等，1992)。pCIB1004用NcoI酶切，产生的线性片段之3′突出部分用T4DNA聚合酶处理形成平末端。该片段然后再用HindIII酶切，产生的含PR-1a启动子的片段经凝胶纯化，克隆到已去除双35S启动子的pCGN1761ENX。这是通过用XhoI酶切并用T4DNA聚合酶形成平末端，然后用HindIII酶切并分离含大的载体终止子的片段，在此片段中克隆了pCIB1004启动子片段。这样形成了一个pCGN1761ENX衍生物，它具有PR-1a启动子和tml终止子以及一个具有单一EcoRI和NotI位点的插入片段的多衔接物。选择的NIM1可插入到该载体中，并且融合产物(即启动子-基因-终止子)可随后转移到任何选择的转化载体中，包括那些在本申请中描述的载体。可以采用不同的化学调节物诱导根据本发明转化的植物中NIM1编码序列的表达。在此公开的上下文中，“化学调节物”包括已知是植物中PR-1启动子诱导物的化学品，或其相近的衍生物。PR-1启动子的一组优选调节物是以苯并-1，2，3-噻二唑(BTH)结构为基础的，包括但并不限于以下类型的化合物苯并-1，2，3-噻二唑羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑硫代羧酸、氰基苯并-1，2，3-噻二唑、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酰胺、苯并-1，2，3-噻二唑羧酸肼、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸、苯并-1，2，3-噻二唑-7-硫代羧酸、7-氰基苯并-1，2，3-噻二唑，苯并-1，2，3-噻二唑羧酸酯(其中烷基含有一到六个碳原子)、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸甲基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸正丙酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸苄基酯、苯并-1，2，3-噻二唑-7-羧酸异丁基肼、及其适当的衍生物。其它化学诱导物包括，例如，苯甲酸、水杨酸(SA)、聚丙烯酸及其取代的衍生物；适当的取代物包括低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基和卤原子。本发明的可化学诱导的DNA序列的另一组调节物是以吡啶羧酸结构为基础的，例如异烟酸结构和优选的卤异烟酸结构。优选的是二氯异烟酸及其衍生物，例如低级烷基酯。这一组调节化合物的合适的成员是，例如，2，6-二氯异烟酸(INA)，以及其低级烷基酯，特别是甲基酯。d.组成型表达，肌动蛋白启动子已知肌动蛋白的几种同工型在大多数细胞类型中表达，因此肌动蛋白启动子是组成型启动子的一个好的选择。特别地，水稻ActI基因的启动子已被克隆并表征(McElroy等，植物细胞2163-171(1990))。发现此启动子的一个1.3kb的片段含有在水稻原生质体中表达所需的全部调控元件。而且，已经构建了以ActI启动子为基桀的许多表达载体，特别是用于单子叶植物(McElroy等，分子与基因遗传学(Mol.Gen.Genet.)231150-160(1991))。它们结合了ActI内含子1、AdhI5′侧翼序列和AdhI内含子1(来自玉米乙醇脱氢酶基因)和来自CaMV35S启动子的序列。表现高表达的载体是35S和ActI内含子或ActI5′侧翼序列和ActI内含子的融合体。起始ATG(GUS报告基因的)附近序列的优化也提高表达。McElroy等(分子与基因遗传学231150-160(1991))描述的启动子表达盒可以容易地被加以改造以表达纤维素酶基因，并特别适用于单子叶植物宿主。例如，含启动子的片段被从McElroy构件中移去并用于替换pCGN1761ENX的双35S启动子，然后可以插入特定的基因序列。这样构建的融合基因可以再转移到适当的转化载体中。在一个单独的报告中，发现具有第一内含子的水稻ActI启动子指导在培养的大麦细胞中的高表达(Chibbar等，植物细胞报告(PlantCellRep.)12506-509(1993))。e.组成型表达，遍在蛋白质启动子遍在蛋白质是已知在许多细胞类型中积累的另一个基因产物，并且它的启动子已被从一些品种中克隆并用于转基因植物(例如向日葵-Binet等，植物科学7987-94(1991)和玉米-Christensen等，植物分子生物学12619-632(1989))。玉米遍在蛋白质启动子已经在转基因单子叶植物系统中建立，其序列及用于单子叶植物转化而构建的载体在专利公开文本EP0342926(Lubrizol)中公开，在此引入作为参考。Taylor等(植物细胞报告12491-495(1993))描述了一个载体(pAHC25)，它含有玉米遍在蛋白质启动子和第一内含子，并且通过微粒轰击导入后可以在许多单子叶植物细胞悬液中有很高活性。遍在蛋白质启动子适合于在转基因植物，特别是单子叶植物中表达纤维素酶基因。合适的载体是pAHC25或本发明所描述的任何一个转化载体的衍生物，其通过导入适当的遍在蛋白质启动子和/或内含子序列加以改造。f.根部特异性表达本发明的NIM1基因的另一种表达模式是根部特异性表达。一个合适的根部启动子由Framond(FEBS290103-106(1991))以及发表的专利申请EP0452269(Ciba-Geigy)所描述，在此引入作为参考。这个启动子转移到合适的载体如pCGN1761ENX用于插入纤维素酶基因，随后将完整的启动子-基因-终止子盒转移到目标转化载体上。g.创伤诱导型启动子创伤诱导型启动子也可能适合于本发明NIM1基因的表达。许多这样的启动子已经被描述(例如Xu等，植物分子生物学22573-588(1993)，Logemann等，植物细胞1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22783-792(1993)，Firek等，植物分子生物学22192-142(1993)，Warner等，植物杂志3191-201(1993))，而且都适用于本发明。Logemann等描述了来自双子叶植物马铃薯wunl基因的5′上游序列。Xu等指出来自双子叶植物马铃薯的创伤诱导型启动子(pin2)在单子叶植物水稻中也具活性。而且，Rohrmeier和Lehle描述了玉米WipIcDNA的克隆，它是由创伤诱导的并且可以用于通过标准技术分离同类的启动子。相似地，Firek等和Warner等描述了一个来自单子叶植物Asparagusofficinalis的创伤诱导基因，它在局部创伤和病原体侵染部位表达。利用本领域熟知的克隆技术，这些启动子可被转移到适当的载体，融合到本发明的NIM1基因上，并用于在植物受伤的部位表达这些基因。h.木髓(pith)优先型表达专利申请WO93/07278(Ciba-Geigy)，在此引入作为参考，描述了在木髓细胞中优选表达的玉米trpA基因的分离。公布了基因序列和从转录起始点延伸到-1726bp的启动子。利用标准分子生物学技术，该启动子或其部分可转移到如pCGN1761的载体上，在载体中它替换35S启动子并用于以木髓优先的方式驱动外源基因的表达。实际上，含有木髓优先启动子或其部分的片段可被转移到任何载体并加以改造以用于转基因植物。i.叶部特异表达编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因已被Hudspeth和Grula(植物分子生物学12579-589(1989))描述。利用标准分子生物学技术，这个基因的启动子可用于驱动任何一个基因以叶部特异性方式在转基因植物中的表达。i.叶绿体定向表达Chen和Jagendorf(生物化学杂志2682363-2367)描述了成功利用叶绿体转运肽转入异源转基因。所用的肽是来自Nicotianaplumbaginifolia的rbcS基因的转运肽(Poulsen等，分子基因遗传学205193-200(1986))。利用限制酶DraI、SphI.prTsp5091和SphI，可从质粒prbcS-8B中剪切编码此转运肽的DNA序列并加以操作以用于上述任何一个构件。DraI-SphI片段从对应于起始rbcSATG的-58延伸到，并包括成熟肽的第一个氨基酸(也是甲硫氨酸)，它紧靠在转入切割位点之后，而Tsp5091-SphI片段从对应于起始rbcSATG的-8延伸到，并包括，成熟肽的第一个氨基酸。因此，这些片段可被适当地插入到任何所选的表达盒的多衔接物中，形成所选启动子的不翻译前导序列的转录融合体(例如，35S、PR-1a、肌动蛋白、遍在蛋白质等等)，从而能够在转运肽的下游以正确的融合体插入一个NIM1基因。这种(融合体)构建在本领域是常规的。例如，鉴于Dral末端已经是平头，5′Tsp5091位点可用T4聚合酶处理形成平头，或者可以连接到衔接物或接头(adaptor)序列帮助它与所选启动子的融合。3′SphI位点可被保留，或者可以连接到接头或衔接物序列以帮助它插入到所选载体，这是采用这样一种方式如产生适当的限制位点用于以后插入一个选择的NIM1基因。理想地，SphI位点的ATG被保留并含有所选的NIM1基因的第一个ATG。Chen和Jagendorf提供为了向叶绿体转入的理想切割共有序列，并且在每一种情况下在成熟蛋白质的第一个位点优选的是甲硫氨酸。在后面的位点有更多的变化并且氨基酸可以不那么严格。在任何情况下，融合构件可以利用Bartlett等(见Edelmann等(编)叶绿体分子生物学方法，Elsevier第1081-1091页(1982))和Wasmann等(分子基因遗传学，205446-453(1986))描述的方法评价其体外转入效率。一般，最好的方法是用所选NIM1基因或NIM1基因变形体产生在氨基末端没有修饰的融合体，并且仅仅在明显发现这种融合体不能以高效率向叶绿体转入时才引入修饰，在这种情况下的修饰可以按照已公布的文献进行(Chen和Jagendorf；Wasman等；Ko和Ko，生物化学杂志26713910-13916(1992))。一个优选的载体是通过将prbcS-8B的Dral-SphI转运肽编码片段转移到克隆载体pCGN1761ENX/Sph-而构建的。将该质粒用EcoRI切割并用T4DNA聚合酶处理形成平端。质粒prbcS-8B用SphI切割并连接到一个序列的退火的分子接头上，其序列为5′-CCAGCTGGAATTCCG-3′/5′-CGGAATTCCAGCTGGCATG-3′(SEQIDNO16和17)。形成的产物用T4激酶处理使5’末端被磷酸化。随后用Dral切割释放转运肽编码片段，将其连接到上述改造的载体的平端外-EcoRI位点。通过测序鉴定以与35S启动子3’端相邻的5’端插入定向的克隆。这些克隆携带35S前导序列与rbcS-8A启动子转运肽序列的DNA融合体，该序列从相对于rbcSATG的-58延伸到成熟蛋白质的ATG，并且在该区域含有一个单一SphI位点、一个新建立的EcoRI位点以及原有的pCGN1761ENX的NotI和XhoI位点。这个新载体命名为pCGN1761/CT。DNA序列被依读框转移到pCGN1761/CT，方法是用PCR技术加以扩增并在扩增的ATG处引入SphI、NsphI或NlaIII位点，其用适当的限制酶切割后连接到用SphI切割的pCGN1761/CT中。为帮助构建，可能需要改变克隆基因产物的第二个氨基酸；然而，在大多数情况下利用PCR和标准的定点突变能够使得在切割位点周围和成熟蛋白的第一个甲硫氨酸处构建任何所需的序列。一个更优选的载体是通过用prbcS-8A的BamHI-SphI片段替换pCGN1761ENX的双35S启动子构建的，BamHI-SphI片段含有全长的、光调节的rbcS-8A启动子，其从-1083(相对于转录起始位点)到成熟蛋白的第一个甲硫氨酸。带有破坏了SphI的经改造的pCGN1761用PstI和EcoRI切割，并用T4DNA聚合酶处理以产生平端。用SphI切割prbcS-8A，并连接到上述序列的退火的分子接头上。形成的产物用T4激酶处理使5′末端被磷酸化。随后用BamHI切割释放含有启动子-转运肽的片段，其用T4DNA聚合酶处理形成BamHI平端。如此形成的启动子-转运肽片段被克隆到制备的pCGN1761ENX载体，形成了含有rbcS-8A启动子和转运肽的构件，并在切割位点有一个SphI位点用于外源基因插入。而且，在SphI位点的下游有EcoRI(重建的)、NotI和XhoI克隆位点。此构件命名为pCGN1761rbcS/CT。利用来自其它来源(单子叶植物和双子叶植物)和其它基因的GS2叶绿体转运肽编码序列，可以进行类似的操作。另外，类似的操作可以用于获得向其它亚细胞区室如线粒体的定向。2.转录终止子大量的转录终止子可用在表达盒中。它们负责转基因和正确聚腺苷酸化后的转录终止。适当的转录终止子是那些已知在植物中起作用的，包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子和豌豆rbcSE9终止子。它们可在单子叶植物和双子叶植物中使用。3.增强或调节表达的序列已经发现了大量序列增强转录单位内的基因表达，这些序列连同本发明的基因可用于提高它们在转基因植物中的表达。已表明许多内含子序列增强表达，特别是在单子叶植物细胞中。例如，已发现当被导入玉米细胞中时玉米AdhI基因的内含子显著增强在其同源启动子控制下野生型基因的表达。发现内含子1特别有效，且增强与氯霉素乙酰转移酶基因融合构件的表达(Callis等，基因发育(GeneDevelop.)11183-1200()1987))。在相同的实验系统中，来自玉米bronzel基因的内含子具有相似的增强表达的作用。内含子序列已被常规地结合到植物转化载体中，一般在非翻译前导序列内。已知衍生自病毒的大量非翻译前导序列能增强表达，它们在双子叶植物中特别有效。特别地，来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列表现出在增强表达中有效(例如Gallie等，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物学1565-79(1990))。4.基因产物在细胞中的定向已知植物中存在用于定向基因产物的各种机制，并且控制这些机制功能的序列已被一定程度地表征。例如，基因产物向叶绿体的定向是由一段信号序列控制的，该信号序列位于不同蛋白质的氨基端，在转入叶绿体形成成熟蛋白质时被切割(如Comai等，生物化学杂志26315104-15109(1988))。这些信号序列可被融合到异源基因产物上，影响异源产物向叶绿体的转入(VandenBroeck，等，自然313358-363(1985))。编码合适的信号序列的DNA可从编码RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合成酶、GS2蛋白和许多其它已知定位于叶绿体的蛋白质的cDNA的5′末端分离到。其它基因产物定位于其它器官如线粒体和过氧化物酶体(如Unger等，植物分子生物学，13411-418(1989))。编码这些产物的cDNA也可经操作以影响异源基因产物向这些器官的定向。这种序列的例子是核编码的ATP酶和线粒体特异的天冬氨酸氨基转移酶同工酶。定向细胞蛋白体已被Rogers等(美国国家科学院院报，826512-6516(1985))描述。另外，表征了引起基因产物向其它细胞区室向的序列。氨基末端序列负责向内质网、非原质体和从糊粉体向胞外分泌的定向(Koehler和Ho，植物细胞2769-783(1990))。另外，氨基末端序列和羧基末端序列一起负责基因产物向液泡的定向(Shinshi等，植物分子生物学14357-368(1990))。通过将上述适当的定向序列融合到目标转基因序列中，就有可能将基因产物定向到任何细胞或细胞区室。例如对于叶绿体的定向，来自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合成酶基因或GS2基因的叶绿体信号序列依读框融合到转基因的氨基末端ATG上。所选的信号序列应含有已知的切割位点，并且构建的融合体应考虑到用于切割所需的切割位点后面的任何一个氨基酸。在一些情况下，这种要求可以通过在切割位点和转基因的ATG之间加入小数目的氨基酸得到满足，或者替换转基因序列中的一些氨基酸。用于叶绿体转入构建的融合体可以通过体外转录构件的体外翻译来测试叶绿体的吸收效率，随后利用由Bartlett等，见Edelmann等编的叶绿体分子生物学方法，Elsevier第1081-1091页(1982)和Wasmann等，分子基因遗传学205446-453(1986)中所描述的方法进行体外叶绿体吸收。这些构建技术在本领域众所周知，并且可以对等地用于线粒体和过氧化物酶体。上述用于细胞定向的机制不仅可以与其同源启动子一起应用，还可以与异源启动子一起应用以影响在启动子的转录调节下的特定细胞定向目标，该启动子具有不同于由定向信号驱动的启动子的表达方式。C.转化一旦NIM1编码序列被克隆到一个表达系统中，它就被转化到植物细胞中。适合转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织和原生质体。本系统可用于任何可被转化并再生的植物。这些用于转化和再生的方法在本领域是众所周知的。构建植物表达盒的方法学以及外源基因向植物中的导入在本领域有描述。通常地，为了将外源DNA导入植物，采用Ti质粒载体以输运外源DNA。用于这种输运的方法还有直接DNA吸收、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒轰击。这些方法在本领域已经公开。参阅，例如，Bilang等，(1991)基因100247-250；Scheid等，(1991)分子基因遗传学228104-112；Guerche等，(1987)植物科学52111-116；Neuhause等，(1987)理论与应用遗传学7530-36；Klein等，(1987)自然32770-73；Howell等，(1980)科学2081256；Horsch等，(1985)科学2271229-1231；Deblock等，(1989)植物生理91694-701；植物分子生物学方法(Weissbach和Weissbach，编著)学院出版公司(1989)。还参阅美国专利5,625,136,在此完整引入作为参考。要理解转化的方法依赖于待转化的植物细胞。烟草、番茄、马铃薯和拟南芥的转化采用双元Ti载体系统。植物生理81301-305，1986；Fry，J.，Barnason，A.，和Horsch，R.B.利用以根癌土壤杆菌为基础的载体转化芸苔。植物细胞报告6321-325，1987；Block，M.d.利用根癌土壤杆菌的不依赖于基因型的叶盘转化马铃薯(Solanumtuberosum)。理论与应用遗传学76767-774，1988；Deblock，M.，Brouwer，D.D.，和Tenning，P.利用根癌土壤杆菌转化芸苔和甘蓝及在转基因植物中bar和neo基因的表达。植物生理91694-701，1989；Baribault，T.J.，Skene，K.G.M.，Cain，P.A.，和Scott，N.S.转基因葡萄表达β-葡糖苷酸酶的幼芽的再生。植物细胞报告411045-1049，1990；Hinchee，M.A.W.，Newell，C.A.，ConnorWard，D.V.，Armstrong，T.A.，Deaton，W.R.，Sato，S.S.，和Rozman，R.J.，非茄科作物的转化和再生。Stadler.Genet.Symp.203212.203-212，1990；Barfield，D.G.和Pua，E.C.利用根癌土壤杆菌介导的转化在芥菜中的基因转移。植物细胞报告，10308-314，1991；Cousins，Y.L.，Lyon，B.R.，和Llewellyn，K.J.澳大利亚棉花栽培品种的转化通过基因工程改良棉花的展望。澳大利亚植物生理杂志18481-494，1991；Chee，P.P.和Slightom，J.L.利用微粒轰击鉴别含功能性或非功能性转移基因的黄瓜组织的转化。基因118255-260，1992；Christou，P.，Ford，T.L.，和Kofron，M.水稻的不依赖于品种的基因转移方法进展。生物技术进展(TrendsBiotechnol.)10239-246，1992；D′Halluin，K.，Bossut，M.，Bonne，E.，Mazur，B.，Leemans，J.，和Botterman，J.甜菜(BetavulgarisL.)的转化和转基因植物抗除草剂的评价。生物技术(Bio/Technol.)10309-314，1992；Dhir，S.K.，Dhir，S.，Savka，M.A.，Belanger，F.，Kriz，A.L.，Farrand，S.K.，和Widholm，J.M.从电穿孔原生质体再生转基因大豆(GlycineMax)。植物生理9981-88，1992；Ha，S.B.，Wu，F.S.，和Thorne，T.K.从原生质体再生的转基因草炭型高狐茅(FestucaarundinaceaSchreb.)植物。植物细胞报告11601-604，1992；Blechl，A.E.小麦改良第78次年会转化新工具要点评述。禾谷类食物世界(CerealFoodWorld)38846-847，19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麦。而且，小麦的转化已被Vasil等(生物技术10667-674(1992)描述，利用粒子轰击转入C型长期可再生愈伤组织，以及Vasil等(生物技术111553-1558(1993)和Weeks等(植物生理1021077-1084(1993))利用粒子轰击未成熟胚和未成熟胚衍生的愈伤组织。但是，小麦转化的一个优选技术包括利用粒子轰击未成熟胚转化小麦，并包括在基因转移前的一个高蔗糖或是高麦芽糖的步骤。轰击前，任何数目的胚(0.75-1mm长)涂布到含3％蔗糖和用于体细胞胚诱导的3毫克/升的2，4-D的MS培养基上(Murashiga和Skoog，PhysiologiaPlantarum15473-497(1962))，在暗处进行。在轰击当天，将胚从诱导培养基上移走并放到渗压剂上(即以所需浓度，通常15％，添加蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。使胚进行质壁分离2-3小时然后进行轰击。一般每个靶板上有20个胚，但并不关键。将合适的带有基因的质粒(如pCIB3064和pSG35)用标准步骤沉淀到微米大小的金粒上。将每个胚板用DuPontBiolistics氦设备轰击，轰击压约为1000psi，使用标准80目筛网。轰击后，将胚放回到暗处恢复约24小时(仍然在渗压剂上)。24小时后，将胚从渗压剂上移出并放回到诱导培养基上，在再生前放置约1个月。大约1个月后，将具有成胚愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基上(MS+1毫克/升NAA，5毫克/升GA)，并含有适当的选择剂(pCIB3064质粒用10毫克/升basta，pSG35质粒用2毫克/升氨甲喋呤)。大约1月后，形成的芽转移到较大的无菌容器如“GA7”，其中含有一半浓度的MS、2％蔗糖和相同浓度的选择剂。专利申请08/147,161描述了小麦转化的方法，在此引入作为参考。最近，利用土壤杆菌的单子叶植物的转化已被描述。参阅，WO94/00977和美国专利5,591,616，将二者在此引入作为参考。育种本发明的经分离的基因片段或NIM1基因变形体可用于赋予多种植物细胞以抗病性，包括裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。尽管基因可以插入到属于这些大类的任何植物细胞中，但是在作物类植物中特别有用，例如水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。SAR基因组成型表达所需的NIM1基因和其突变型的过量表达，与其它对于产量和质量重要的性状均可以通过育种引入到植物品系中。因此本发明的进一步的实施方案是产生转基因亲本植物的转基因后代的方法，其中转基因亲本植物含有编码本发明NIM1蛋白变形体的经分离的DNA分子，该方法包括用本发明的重组载体分子转化所说的亲本植物，并利用已知的植物育种技术将性状转移到所说的转基因亲本植物的后代中。育种途径和技术是本领域已知的。参阅，如，WelshJ.R.，植物遗传和育种基础(FundamentalsofPlantGeneticsandBreeding)，JohnWiley&amp;Sons，NY(1981)；作物育种(CropBreeding)，WoodD.R.美国农学会，Madison，Wisconsin(1983)；MayoO.，植物育种理论(TheTheoryofPlantBreeding)，第二版，Clarendon出版社，Oxford(1987)；Singh，D.P.，抗病和抗虫害育种(BreedingforResistancetoDiseasesandInsectPests)，Springer-Verlag，NY(1986)；和Wricke和Weber，数量遗传学和选择植物育种(QuantitativeGeneticsandSelectionPlantBreeding)，WalterdeGruyterandCo.，柏林(1986)。导入转基因种子和植物中的遗传特性的传播以及在后代植物中的维持导入上述转基因种子和植物中的遗传特性通过有性繁殖或营养体生长传递下去，因此可以在后代植物中维持和传播。一般所说的维持和传播利用了已知发展为适合特定目的，例如耕种、播种或收获的农业方法。专门化的方法如水耕法和温室技术也可以采用。因为生长的作物对由昆虫和感染引起的攻击和伤害以及对杂草植物的竞争十分脆弱，采取了控制杂草、植物疾病、昆虫、线虫和其它不利条件以提高产量的措施。它们包括机械化措施如耕地或除去杂草和被侵染的植物，以及利用农业化学品如除草剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、催熟剂和杀虫剂。在植物育种中可进一步利用本发明转基因植物和种子的有益的遗传特性，形成具有改良特性的植物，如对害虫、除草剂或逆境的抗性、改善营养价值、增加产量或改善结构使存放和粉碎时的损失减小。多种育种途径均以明确的人类干预为特征，例如选择合适的杂交品系、指导亲本系授粉，或选择合适的后代植物。根据所需特性可采取不同的育种策略。相关的技术在本领域是众所周知的，包括但并不限于杂交、自交、回交育种、多系育种、变种融合、种间杂交、非整倍体技术等等。杂交技术还包括通过机械、化学或生化方法的植物不育化以获得雄性或雌性不育植物。雄性不育植物与不同品系的花粉交叉授粉保证了雄性基因组不育，但雌性可育植物会一致地获得双亲品系的特性。因此，本发明的转基因种子和植物可用于改良的植物品系的育种，例如增加传统方法，如用除草剂或杀虫剂处理的有效性或允许用所说的方法根据其改造的遗传特性进行分配。或者，可以得到具有改善逆境抗性的新作物，由于其优化的遗传“装备”，与不能耐受相似的不利发育条件的作物相比可获得丰收的产量或更优良的品质。在种子生产中，发芽质量和种子的一致性是重要的产品特性，而农民收获和出售的种子的发芽质量和种子的一致性是不重要的。因为很难使一种作物与其它作物和杂草种子分开、难于控制种传病害和生产发芽好的种子，相当广泛的和确切的种子生产实践已被种子生产商开发出来，他们在种植、调节和营销纯种子的领域有经验。因此，对农民来说，购买符合特定质量标准的合格的种子而不是使用从他自己的作物中收获的种子，是正常的习惯。采用的作为种子的繁殖材料通常用含有除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀螺药或其混合物的保护剂涂层处理。通常采用的保护剂涂层含有化合物如克菌丹，萎锈灵，福美双(TMTD)，瑞毒霉(Apron)和甲基虫螨膦(Actellic)。需要的话，这些化合物可用另外的载体、表面活性剂或促进应用的助剂配制在一起，它们通常应用在本领域的配方中，对由细菌、真菌或动物害虫造成的伤害提供保护。保护剂涂层可采用用液体配方渗透传播材料，或用组合的湿的或干的配方包衣。应用的其它方法也是可能的，例如对芽或果实的处理。本发明的另一个方面是提供新的农业方法例如上面阐述的方法，它们的特征为利用本发明的转基因植物、转基因植物材料，或转基因种子。可以在由合适包装材料构成的袋中、容器或器皿中提供种子，袋或容器能够封闭以存放种子。袋、容器或器皿可以设计成用于短期或长期储存种子，或用于短期和长期储存种子。合适的包装材料的例子包括纸，如牛皮纸、硬或软塑料或其它聚合物材料、玻璃或金属。希望袋、容器或器皿含有多层相同或不同类型的包装材料。在一个实施方案中，提供了袋、容器或器皿以排除或限制水和潮气接触种子。在一个实施方案中，密封了袋、容器或器皿，如热密封，以防止水分或潮气的进入。在另一个实施方案中，在包装材料层之间放置了吸水性材料。在另一个实施方案中，袋、容器、器皿或所组成的包装材料经处理以限制、抑制或阻止病害、污染或其它对种子储存或运输不利的影响。这种处理的一个例子是消毒，例如通过化学法或通过暴露在射线中。本发明包括装有转基因植物的种子的商品袋，该种子含有至少一种NIM1蛋白变形体或者在所说的植物中比野生型植物表达水平高的NIM1蛋白，以及合适的载体，以及利用其赋予植物广谱抗病性的使用说明。抗病性抗病性的评价是根据本领域已知的方法进行的。例如参阅，Uknes等，(1993)植物与微生物的分子相互作用6680-685；Gorlach等，(1996)植物细胞8629-643；Alexander等，美国国家科学院院报907327-7331。A.寄生疫霉(黑胫病)抗性分析对黑胫病致病菌寄生疫霉的抗性的分析是在按照Alexander等，美国国家科学院院报907327-7331中所述培养的6周龄植物上进行的。给植物浇水，使排水良好，然后用10毫升孢子囊悬液(每毫升300孢子囊)接种到土壤中。被接种的植物放到温室中，维持白天的温度为23-25℃，夜间温度为20-22℃。作为分析的枯萎指标是0＝无症状；1＝无病症；1＝一些枯萎的迹象，饱满度降低；2＝明显的枯萎症状，但没有腐烂或发育迟缓；3＝明显的枯萎症状，发育迟缓，但没有明显的茎腐；4＝严重枯萎，有可见茎腐和根系受到某种程度损伤；5＝象4一样，但植株濒临死亡，并且根系严重损伤。所有分析都是在随机设计的植物上进行盲测。B.丁香假单胞菌抗性分析将丁香假单胞菌烟草致病变种菌株#551注射到几株6-7周龄植物的两片较矮的叶片中，细菌浓度为每毫升水106或3×106。在每一个时间点评价6株个体植株。被烟草假单胞菌感染的植株根据5点病害严重度进行分级，5＝100％组织死亡，0＝无症状。对每天的评价进行T-检验(LSD)，病害分级值经过平均后表示分组情况。在评价那天以相同字母表示的值在统计学上没有显著差异。C.烟草尾孢菌(Cercosporanicotianae)抗性分析烟草尾孢菌(ATCC#18366)孢子悬液(每毫升100,000-150,000个孢子)喷雾叶片表面至即将流下来。植物在100％湿度下维持5天。然后将植物每天喷水5-10次。在每个时间点评价6株个体植株。烟草尾孢菌以表现病害症状的叶片面积的百分数分级。对每天的评价进行T-检验(LSD)，病害分级值经过平均后表示分组情况。在评价那天以相同字母表示的值在统计学上没有显著差异。D.寄生霜霉抗性分析对寄生霜霉抗性的分析是在植物上按照Uknes等，(1993)所述进行的。植物通过用分生孢子悬液(每毫升大约5×104孢子)喷雾接种相容性寄生霜霉分离物。接种的植物在生长箱中培养在湿润、17℃条件下，以14小时白天/10小时夜间为一个循环。分生孢子接种后3-14天，优选地7-12天检测植物。另外，从每个处理中随机选择几株植物用乳酚-锥虫蓝染色(Keogh等，Trans.Br.Mycol.Soc.74329-333(1980))用于显微镜检测。附图简述图1表示化学诱导物对野生型和nim1植物中SAR基因表达的诱导作用。SAR基因的化学诱导在nim1植物中消失。水、SA、INA、或BTH应用于野生型(WT)和nim1植物。3天后，从这些植物中制备RNA并检测PR-1、PR-2，和PR-5的表达。图2描述在被病原体感染的Ws-O和nim1植物中PR-1基因的表达。病原体诱导的PR-1在nim1植物中消失。野生型(WT)和nim1植物用寄生霜霉Emwa种喷雾接种。在第0、1、2、4和6天收集样品，用斑点杂交分析RNA，即用拟南芥PR-1cDNA探针检测PR-1mRNA的积累。图3表示病原体感染或化学处理后PR-1mRNA在nim1突变型和野生型植物中的积累。含有nim1等位基因nim1-1、-2、-3、-4、-5和-6的植物和Ws-O(Ws)的植物在RNA分离前3天用水(C)、SA、INA、或BTH处理。Emwa样品含有从寄生霜霉Emwa分离物接种后14天的植物中分离的RNA。用拟南芥PR-1cDNA作探针进行斑点杂交(Uknes等，1992)。图4表示被丁香假单胞菌感染的Ws-O和nim1植物中SA积累的水平。nim1植物在接触病原体后积累SNA。野生型和nim1植物的叶片用PstDC3000(avrRpt2)或载体介质(10mMMgCl2)单独浸湿。2天后，从未处理的、MgCl2处理的和DC3000(avrRpt2)处理的植物中收集样品。用细菌处理的样品分为初级(浸湿的)和次级(未浸湿的)叶片。用β-葡糖苷酶水解后的游离SA和总SA由HPLC定量。误差带(errorbar)表示三个重复样品的标准差(SD)。图5A-D列出了以NIM1为中心的分辨率增加的总体图谱，指出了在NIM1区域的重组子，包括BAC、YAC和粘粒(A)NIM1在染色体1上的图谱位置。配子总数为2276。(B)用于克隆NIM1的酵母人工染色体(以条纹线表示)，细菌人工染色体(BAC)，和P1克隆。(C)覆盖NIM1座位的粘粒克隆。与nim1-1互补的三个粘粒以粗线表示。(D)在最小的互补基因组DNA片段上的四个推断的基因区域。包括NIM1基因的四个开放阅读框以中空条表示。箭头表示转录的方向。编号对应于粘粒D7上拟南芥基因组DNA的第一个碱基。图6表示NIM1基因的核酸序列和NIM1基因产物的氨基酸序列，包括在不同等位基因中的改变。位于SEQIDNO1上的9.9kb序列的相对链上的这个核酸序列也在SEQIDNO2中给出，NIM1基因产物的氨基酸序列也在SEQIDNO3中给出。图7表示在野生型植物和nim1突变型等位基因植物中被INA、BTH、SA和病原体处理诱导的NIM1的积累。在图3中的RNA凝胶斑点用衍生自图6所示序列中的2081至3266的探针检测RNA的表达。图8是四个水稻基因序列(SEQIDNO4-11)的NIM1蛋白和cDNA蛋白产物的表达序列标签区的氨基酸序列比较；编号对应于SEQIDNO3中的氨基酸位置。图9是NIM1蛋白序列与小鼠、大鼠和猪的IκBα的序列比较。序列上面的垂直条(I)表示NIM1和IκBα序列之间相同(阵列评分等于1.5)；序列上面的双点()表示相似得分＞0.5；序列上面的单点(.)表示相似得分＜0.5但＞0.0；而得分＜0.0表示没有相似性并且序列上面没有标记(参阅实施例)。哺乳动物的IκBα锚蛋白结构域的位置根据deMartin等，基因152253-255(1995)鉴定。序列内部的点表示NIM1和IκBα蛋白之间的间隔。IκBα中的5个锚蛋白重复以序列下面的虚线表示。氨基酸以对应于NIM1蛋白加以编号，在适当的地方引入间隔。加号(+)放在每隔10个氨基酸的序列上面。保藏物下列载体分子已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301ParklawnDriveRockville，MD20852，美国，保藏时间如下质粒BAC-04于1996年5月8日保藏于ATCC，编号ATCC97543。质粒P1-18于1996年6月13日保藏于ATCC，编号ATCC97606。粘粒D7于1996年9月25日保藏于ATCC，编号ATCC97736。序列表中序列的简述SEQIDNO1-图5D中NIM1基因区2的9919-bp基因组序列。SEQIDNO2-图6中的5655bp基因组序列(SEQIDNO1的相对链)，包括野生型拟南NIM1基因的编码区。SEQIDNO3-由SEQIDNO2的cds编码的野生型NIM1蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO4-图8的水稻-1的氨基酸序列33-155。SEQIDNO5-图8的水稻-1的氨基酸序列215-328。SEQIDNO6-图8的水稻-2的氨基酸序列33-155。SEQIDNO7-图8的水稻-2的氨基酸序列208-288。SEQIDNO8-图8的水稻-3的氨基酸序列33-155。SEQIDNO9-图8的水稻-3的氨基酸序列208-288。SEQIDNO10-图8的水稻-4的氨基酸序列33-155。SEQIDNO11-图8的水稻-4的氨基酸序列215-271。SEQIDNO12-寡核苷酸。SEQIDNO13-寡核苷酸。SEQIDNO14-寡核苷酸。SEQIDNO15-寡核苷酸。SEQIDNO16-寡核苷酸。SEQIDNO17-寡核苷酸。SEQIDNO18是图8的小鼠IκBα氨基酸序列。SEQIDNO19是图8的大鼠IκBα氨基酸序列。SEQIDNO20是图8的猪的IκBα氨基酸序列。SEQIDNO21是拟南芥NIM1基因的cDNA序列。SEQIDNO22和23分别是在氨基酸位点55和59以丙氨酸代替丝氨酸的一种显性-负性形式的NIM1蛋白之DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。SEQIDNO24和25分别是具有N-末端缺失的一种显性-负性形式的NIM1蛋白之DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。SEQIDNO26和27分别是具有C-末端缺失的一种显性-负性形式的NIM1蛋白之DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。SEQIDNO28和29分别是具有N-末端和C-末端氨基酸缺失的NIM1基因变形体之DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。SEQIDNO30和31分别是NIM1的锚蛋白结构域之DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。SEQIDNO32至39是寡核苷酸引物。定义acd加速细胞死亡突变型植物AFLP扩增片段长度多态性avrRpt2无毒基因Rpt2，分离自丁香假单胞菌BAC细菌人工染色体BTH苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯CIM组成型免疫表型(SAR是组成型激活的)cim组成型免疫突变型植物cM厘摩cpr1PR基因突变型植物的组成型表达体Col-O拟南芥哥伦比亚生态型ECs酶结合物Emwa与拟南芥Ws-O生态型相容的寄生霜霉分离物EMS甲基磺酸乙酯INA2，6-二氯异烟酸Ler拟南芥Landsbergerecta生态型lsd病斑刺激病突变型植物nahG水杨酸羟化酶，将水杨酸转化为儿茶酚的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)NahG用nahG基因转化的拟南芥品系ndr非种特异性抗病性突变型植物nim非诱导免疫突变型植物NIM1野生型基因，参与SAR信号传导途径级联反应NIM1由野生型NIM1基因编码的蛋白质nim1NIM1的突变型等位基因，赋予植物对病害敏感性；也指具有NIM1的nim1突变型等位基因的突变型拟南芥植物Noco与拟南芥Col-O生态型相容的寄生霜霉分离物ORF开放阅读框PCs引物结合物SA水杨酸SAR系统获得性抗性SSLP简单序列长度多态性UDS广泛疾病敏感表型Wela与拟南芥Weiningen生态型相容的寄生霜霉分离物Ws-O拟南芥Issilewskijia生态型WT野生型YAC酵母人工染色体实施例本发明通过下面详细的步骤、制备和实施例加以更详细的说明。实施例仅仅用于说明，不能将其解释为限制本发明的范围。这里采用的标准的重组DNA和分子克隆技术在本领域是众所周知的并已被描述Sambrook，等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman，和L.W.Enquist，基因融合实验，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989)以及Ausubel，F.M.等，分子生物学中的现代技术，GreenePublishingAssoc.AndWiley-Interscience出版(1987)。A.nim1突变型的表征实施例1植物品系和真菌菌株拟南芥Isilewskijia生态型(Ws-O；保藏号CS2360)和T-DNA转化品系的第4代(T4)种子来自俄荷俄州立大学拟南芥生物资源中心(Columbus，OH)。用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的Ws-O植物的第2代(M-2)种子来自LehleSeed(RoundRock，TX)。含有克隆avrRpt2基因的DC3000(avrRpt2)]的丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst)DC3000菌株来自B.Staskawicz，加利福尼亚大学，Berkeley。寄生霜霉致病变种及其来源如下Emwa来自E.Holub和I.R.Crute，园艺研究站，EastMalling，Kent；Wela来自A.Slusarenko和B.Mauch-Mani，InstitutfurPflanzenbiologie，Zurich，瑞士；而Noco来自J.Parker，Sainsbury实验室，Norwich，英格兰。真菌菌种通过培养在拟南芥上加以维持，对于寄生霜霉致病种Emwa、Wela和Noco分别用拟南芥生态型Ws-O、Weiningen和Col-O。实施例2突变型筛选M2或T4种子在土壤中生长2周，每天光照14小时，用0.33mMINA(0.25mg/ml，由25％可湿性粉剂制成；Ciba，Basel，瑞士)喷雾，4天后通过喷雾寄生霜霉分生孢子悬液接种，悬液中每毫升水含5-10×104个分生孢子。此真菌通常对拟南芥Ws-O生态型有毒害，除非用异烟酸(INA)或一种相似的化合物先在植物中引入抗性。植物保持在潮湿条件下，18℃持续1周，然后检查真菌孢子形成情况。经INA处理后支持真菌生长的植物被选作推断的突变型。在高湿环境下培养后，鉴定具有可见病害症状的植物，一般在感染7天后。尽管应用了抗性诱导化学品，这些植物也不表现对真菌的抗性，因此它们是潜在的nim(非诱导免疫)突变型植物。从360,000株植物中鉴定了75株潜在的nim突变型植物。这些潜在的突变型植物是从平原上分离的，放置在低湿度条件下，并使之结种子。从这些种子长成的植物以相同的方式根据对真菌Emwa的敏感性进行筛选，同样经过INA预处理后。显示感病症状的子代植物定义为nim突变型。这样鉴定了6个nim品系。-个品系(nim1-1)是从T-DNA群体中分离到的，5个(nim1-2，nim1-3，nim1-4，nim1-5，和nim1-6)是从EMS群体中分离到的。实施例3nim1植物的抗病性水杨酸(SA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲基酯(BTH)是象INA一样的化学品，在野生型植物中诱导广谱的抗病性(SAR)。突变型植物用SA、INA和BTH处理，然后分析对寄生霜霉的抗性。寄生霜霉分离物“Emwa”是与Ws生态型相容的寄生霜霉分离物。相容性的分离物是那些能够在特定宿主中引起病害的分离物。寄生霜霉分离物“Noco”与Ws不相容但与Columbia生态型相容。不相容的病原体被潜在的宿主识别，引起一种阻止病害发展的宿主反应.将野生型种子和每个nim1等位基因(nim1-1，-2，-3，-4，-5，-6)的种子播种到MetroMix300生长培养基中，用透明塑料圆顶覆盖，并在4℃、黑暗处放置3天。3天4℃处理后，将植物移到人工气候室中放置2周。通过约2周种植后，萌发的幼苗产生4片真叶。然后用水、5mMSA、300μMBTH或300μMINA处理植物。化学品以细雾的形式使用，用chromister完全覆盖幼苗。将水对照植物放回到生长人工气候室中，用化学处理的植物放在一个单独的但相同的人工气候室中。施用化学品3天后，将用水和化学处理的植物用相容的“Emwa”分离物接种。仅仅在水处理的植物上用“Noco”接种。接种后，将植物用透明塑料圆顶覆盖以保持使寄生霜霉能够成功感染的高湿度，并放置在一个生长箱中，以白天19℃/夜间17℃和光照8小时/黑暗16小时为循环。为确定不同nim1等位基因的相对强度，接种后在不同时间点显微分析每个突变型在正常生长条件下和用SA、INA、或BTH处理后寄生霜霉的生长。经过放大，可以在病害发展的早期观察到真菌的孢子形成。接种后，测定每盆植物中在第5天、第6天、第7天、第11天和第14天显示孢子形成的植物的百分比，并检查孢子形成密度。表1表示对于每一个nim1突变型植物品系，用寄生霜霉Emwa种感染后在至少一片叶子上显示表面孢子的植物的百分比。寄生霜霉是在用水或化学品处理后3天接种到植物上的。表1表示感染后的天数，其中抗病性被分级。表1感染百分率-Emwa/对照突变型0天5天6天7天11天WsWT0102510090nim1-107595100100nim1-203085100100nim1-303090100100nim1-4080100100100nim1-5005100100nim1-6057080100感染百分率-Emwa/SA突变型0天5天6天7天11天WsWT053070100nim1-10595100100nim1-20595100100nim1-301090100100nim1-4075100100100nim1-5002075100nim1-6080100100100感染百分率-Emwa/INA突变型0天5天6天7天11天WsWT00000nim1-10580100100nim1-201595100100nim1-301060100100nim1-4080100100100nim1-500055nim1-6015090100感染百分率-Emwa/BTH突变型0天5天6天7天11天WsWT00000nim1-101530100nim1-2002590100nim1-301570100100nim1-4080100100100nim1-5001110nim1-60190100100如表1中所示，在正常生长时，nim1-1，nim1-2，nim1-3，nim1-4和nim1-6都支持真菌以大约相同的速度生长，其速度比Ws-0对照略快。其中的例外是nim1-5植物，其中真菌生长与其它nim1突变型和Ws-0对照相比被延迟了数天，但最终所有nim1-5植物都死于真菌。SA处理后，突变型可分为三类nim1-4和nim1-6表现相对快的真菌生长；nim1-1，nim1-2，nim1-3植物表现较慢的真菌生长；而在nim1-5植物中的真菌生长比未处理的Ws-0对照更慢。INA或BTH处理后，突变型也可分为三类，其中nim1-4是经化学品处理后限制真菌生长的能力受到最严重损害的；nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6都受到中等损害；而nim1-5仅受到轻微损害。在这些实验中，Ws-0经INA或BTH处理后不支持真菌生长。于是，从经化学品处理后抑制真菌生长来看，突变型分为三类，nim1-4受到最严重损害，nim1-1、nim1-2、nim1-3和nim1-6显示中等的对真菌的抑制，而nim1-5仅轻微损害了真菌抗性。表2表示用寄生霜霉接种后7天和11天通过不同nim1等位基因以及NahG植物的感染分级所进行的抗病性评价。WsWT表示Ws野生型亲本系，在其中发现了nim1等位基因。不同的nim1等位基因和NahG植物示于表中。NahG植物的描述在以前已经发表了(Delaney等，科学266，第1247-1250页(1994))。NahG拟南芥也在美国专利申请08/454,876中描述，在此引入作为参考。nahG是来自恶臭假单胞菌的基因，编码水杨酸羟化酶，将水杨酸转化为儿茶酚，因此消除了作为植物中SAR必需的信号传导成分的水杨酸的积累。因此，NahG拟南芥植物不表现正常的SAR，并且通常它们表现出对病原体更强的敏感性。但是，NahG植物仍对化学诱导物INA和BTH有反应。所以NahG植物可用作一种广泛的敏感性对照。表2感染严重性-Emwa/水突变型7天11天WsWT33nim1-144.5nim1-234nim1-344nim1-455nim1-513.5nim1-634.5NahG45感染严重性-Emwa/SA突变型7天11天WsWT34nim1-134.5nim1-234nim1-334nim1-445nim1-533nim1-644.5NahG45感染严重性-Emwa/INA突变型突变型7天11天WsWT00nim1-12.54nim1-244nim1-333.5nim1-445nim1-512nim1-634.5NahG33感染严重性-Emwa/BTH突变型7天11天WsWT00nim1-12.54nim1-23.54nim1-333.5nim1-445nim1-51.52nim1-634NahG00从表2可以看出，nim1-4和nim1-6的寄生霜霉感染最严重；在早期可最容易地观察到这一点。另外，nim1-5等位基因对INA和BTH表现出最强的反应，因此可被视为最弱的nim1等位基因。NahG植物对INA和BTH均表现较好的反应，看上去与nim1-5等位基因非常相似。但是，在晚期(表中的第11天)，在NahG植物中被诱导的抗病性开始减弱，并且在INA和BTH之间有复杂的区别，其在于与BTH诱导的NahG植物中的抗性相比，INA诱导的抗性减弱得更快并且更剧烈。在这些实验中还可看出，INA和BTH在Ws中诱导出对Emwa很好的抗性，而nim1-1，nim1-2和其它nim1等位基因在抗病性方面对SA或INA根本没有表现出反应。nim1植物不对SAR诱导化学品SA、INA、和BTH产生反应，这说明突变是这些化学品的信号传导级联反应中的进入点的下游，该信号传导级联反应导致系统获得性抗性。实施例4SAR基因表达的Northern分析因为SA、INA和BTH不能诱导在任何nim1植物中的SAR，或SAR基因表达，有兴趣检测病原体感染是否诱导这些植物中的SAR基因表达，就象在野生型植物中那样。所以，SAR基因mRNA的积累也被用作表征不同nim1等位基因的标准。将野生型种子和每个nim1等位基因(nim1-1，-2，-3，-4，-5，-6)的种子播种到MetroMix300生长培养基中，用透明塑料圆顶覆盖，并在4℃、黑暗处放置3天。3天4℃处理后，将植物移到人工气候室中放置2周。种植大约两周后，形成的幼苗长出4片真叶。然后用水、5mMSA、300μMBTH或300μMINA处理植物。化学品以细雾的形式使用，用chromister完全覆盖幼苗。将水对照植物放回到生长人工气候室中，用化学处理的植物放在一个单独的但相同的人工气候室中。施用化学品3天后，将用水和化学处理的植物用相容的Emwa分离物接种。仅仅在用水处理的植物上用Noco接种。接种后，将植物用透明塑料圆顶覆盖以使保持寄生霜霉能够成功感染的高湿度，并放置在一个生长箱中，以白天19℃/夜间17℃和光照8小时/黑暗16小时进行循环。从水或化学处理3天后的植物中，或从用相容性寄生霜霉Emwa分离物接种后的14天的植物中提取RNA。RNA用琼脂糖凝胶电泳进行大小分级并转移到GeneScreenPlus膜上(DuPont)。图1-3给出了各种RNA凝胶斑点，表示SA、INA和BTH在nim1植物中既不诱导SAR也不诱导SAR基因表达。在图1中，重复的点按照Uknes等，(1992)所述与拟南芥基因探针PR-1、PR-2和PR-5杂交。与野生型植物中的情况相反，化学品不能从nim1-1植物的这三个SAR基因的任何一个中诱导RNA积累。如在图2中所示，感染病原体(Emwa)的野生型Ws-O植物在被感染后4天内诱导PR-1基因表达。但是在nim1-1植物中，感染后直到6天PR-1基因才被诱导，而且其水平与同期的野生型相比也降低。因此病原体感染后，在nim1-1植物中PR-1基因表达被延迟并与野生型相比水平降低。图3中的RNA凝胶斑点显示野生型植物用SA、INA或BTH处理后或被寄生霜霉感染后，PR-1mRNA积累到高水平。在nim1-1、nim1-2、nim1-3植物中，PR-1mRNA的积累与用化学品处理后的野生型相比剧烈降低。用寄生霜霉感染后PR-1mRNA也降低，但是在这些突变型中仍有一定的积累。在nim1-4和nim1-6植物中，PR-1mRNA的积累与用化学品处理后的其它等位基因比降低更剧烈(长期暴露更明显)，并且用寄生霜霉感染后PR-1mRNA积累也明显降低，支持了它们是强的nim1等位基因的观点。PR-1mRNA的积累在nim1-5突变型中升高，但是被化学品处理或寄生霜霉感染后仅略微被诱导。根据PR-1mRNA的积累和真菌感染，突变型被确定分为三类受严重损害的等位基因(nim1-4和nim1-6)；受中等损害的等位基因(nim1-1、nim1-2和nim1-3)；以及受轻微损害的等位基因(nim1-5)。实施例5nim1植物中SA积累的检测用引起坏死反应的病原体感染野生型植物导致被感染组织中SA积累。内源性SA是SAR途径信号传导所需的，因为内源性SA的降解导致抗病性降低。这表明SA的积累可作为SAR途径中的标记(Gaffney等，1993，科学261754-756)。nim1植物的表型表明SA的下游和SAR基因诱导的上游SAR途径的一个成分被破坏。检测了nim1植物被病原体感染后积累SA的能力。携带avrRpt2基因的丁香假单胞菌番茄菌株DC3000被注射到4周龄nim1植物的叶片中。2天后收获叶片，按照Delaney等，1995，美国国家科学院院报926602-6606中所述分析SA。分析表明nim1植物在被感染叶片中积累高水平的SA，如图4所示。未受感染的叶片也积累SA，但未达到受感染叶片相同的水平，与在野生型拟南芥中观察到的相似。这说明nim突变位于信号传导途径中SA标记的下游。而且，INA和BTH(在nim1植物中无活性)已经表现出刺激SA下游的SAR途径中的一个成分(Vernooij等，(1995)；Friedrich，等，(1996)；和Lawton，等，(1996))。另外，如上面所述，外源性使用的SA不能保护nim1植物免受Emwa的感染。实施例6遗传分析为检测表现nim1表型的多种突变型的显性，将野生型植物的花粉转移到nim1-1、-2、-3、-4、-5、-6的柱头上。如果突变是显性的，那么在产生的F1植物中会观察到nim1表型。如果突变是隐性的，那么产生的F1植物将表现为野生型表型。表3中的数据说明，当nim1-1、-2、-3、-4和-6同野生型杂交时，产生的F1植物表型野生型。因此，这些突变是隐性的。相反，nim1-5×野生型的F1后代都表现出nim1表型，说明这是一个显性突变。用INA处理后，在野生型植物上没有观察到寄生霜霉孢子形成，而F1植物支持寄生霜霉的生长和一些孢子形成。但是，这些F1植物中的nim1表型不及当nim1-5为纯合时观察到的严重。为检测等位性，将卡那霉素抗性nim1-1突变型植物的花粉转移到nim1-2、-3、-4、-5、-6的柱头上。将从杂交中产生的种子种植到含有25微克/毫升卡那霉素的Murashige-SkoogB5平板上以证明种子的杂交起源。将卡那霉素抗性(F1)植物转移到土壤中并分析nim1表型。因为nim1-5突变型与Ws野生型杂交的F1后代表现nim1表型，也进行了对nim1-5×nim1-1的F2的分析。如表3所示，所有产生的F1植物表现nim1表型。因此，在nim1-2、-3、-4、-5、-6的突变未被nim1-1互补；这些植物都属于相同的互补组，因此是等位基因。nim1-5×nim1-1杂交的F2代也表现nim1表型，证明了nim1-5是nim1-1的等位基因。表3nim突变型的遗传分离表型突变型世代雌雄野生型anim1bnim1-1F1野生型cnim1-1240F29832nim1-2F1nim1-2野生型30nim1-3F1nim1-3野生型30nim1-4F1nim1-4野生型30nim1-5F1nim1-5野生型035F1野生型nim1-5018nim1-6F1nim1-6野生型30nim1-2F1nim1-2nim1-1015nim1-3F1nim1-3nin1-1010nim1-4F1nim1-4nim1-1015nim1-5F1nim1-5nim1-1014F2985nim1-6F1nim1-6nim1-1012aINA处理后PR-1mRNA的积累升高且无寄生霜霉的植物数目。bINA处理后没有PR-1mRNA积累且有寄生霜霉的植物数目。c野生型指野生型Ws-O种B.nim1突变的作图nim1突变的作图在申请人于1996年12月27日提交的美国专利申请08/773,559中有极详细的描述，在此完整引入作为参考。实施例7NIM1座位中标记物的鉴定及其遗传作图为测定NIM1的粗略图谱位置，鉴定了来自nim1-1(Ws-O)和Landsbergerecta(Ler)杂交的74株nim植物对寄生霜霉的敏感性，和INA处理后缺乏PR-1mRNA积累的情况。利用简单序列长度多态性(SSLP)标记(Bell和Ecker1994)，nim1-1被确定位于染色体1的短臂上距nga128约8.2cM、距nga1118.2cM的位置。另外，nim1-1被确定位于nga111和距SSLP标记ATHGENEA约4cM之间。(图5A)为进行精细结构作图，根据INA处理后不能积累PR-1mRNA的能力和支持真菌生长的能力，鉴定了衍生自nim1-1和LerDP23杂交的F2群体中的1138株nim植物。从这些植物中提取DNA并在ATHGENEA和nga111处检查接合性。如图5A中所示，在ATHGENEA和nim1-1之间鉴定了93个重组子染色体，遗传距离大约4.1cM(93比2276)，在nga111和nim1-1之间鉴定了239个重组子染色体，说明遗传距离约为10.5cM(239比2276)。在ATHGENEA和nga111的间隔之间具有信息的重组子进一步用扩增片段长度多态性(AFLP)分析(Vos等，1995)。ATHGENEA和nga111之间的AFLP标记被鉴定并用于构建该区域的低分辨率图谱(图5A和图5B)。AFLP标记W84.2(距nim1-11cM)和W85.1(距nim1-10.6cM)用于从CIC(Centred’EtudeduPolymorphismeHumain，INRA和CNRS)文库(Creusot等，1995)中分离酵母人工染色体(YAC)克隆。2个YAC克隆CIC12H07和CIC12F04用W84.2标记鉴定，2个YAC克隆CIC7E03和CIC10G07用W85.1标记鉴定。(图5B)为填补这两套邻近YAC克隆之间的间隔，细菌人工染色体(BAC)和与CIC12H07和CIC12F04部分重叠的P1克隆被分离并作图，并进行系列步行(Walking)步骤将BAC/P1毗连序列群向NIM1延伸(图5C；Lin等，1995；Chio等，1995)。在步行中发展了针对BAC或P1克隆的新的AFLP，它们被用于测定NIM1是否被交叉。当BAC和P1克隆被分离时NIM1被交叉，形成AFLP标记L84.6a和L84.8。在P1克隆P1-18、P1-17和P1-21上发现的AFLP标记L84.6a鉴定了三个重组子，而在P1克隆P1-20、P1-22、P1-23和P1-24上和BAC克隆BAC-04、BAC-05和BAC-06上发现的L84.8鉴定了1个重组子。因为这些克隆部分重叠形成大的毗连序列群(＞100kb)，并含有邻近nim1的AFLP标记，此基因被确定位于毗连序列群上。含有毗连序列群的BAC和P1克隆用于产生另外的AFLP标记，说明nim1位于L84.Y1和L84.8之间，代表了约0.09cM的间隔。C.NIM1基因的分离实施例8粘粒毗连序列群的构建在土壤杆菌相容性T-DNA粘粒载体pCLD04541中利用从BAC-06、BAC-04和P1-18中用CsCl纯化的DNA构建了NIM1区域的粘粒文库。将这三个克隆的DNA以等摩尔量混合并用限制酶Sau3A部分酶切。用蔗糖梯度分离20-25kb的片段，合并并用dATP和dGTP补齐(filledin)。质粒pCLD04541用作T-DNA粘粒载体。这个质粒含有一个宽宿主范围的以pRK290为基础的复制子、一个用于细菌选择的四环素抗性基因和一个用于植物选择的nptII基因。此载体用XhoI切割并用dCTP和dTTP补齐。然后将制备的片段连接到载体上。连接混合物经包装并导入大肠杆菌XL1-blueMR菌株(Stratagene)。通过用BAC04、BAC06和P1-18克隆杂交筛选产生的转化子，并分离阳性克隆。从这些克隆中分离粘粒DNA，并用EcsEcoRI/MseI和HindIII/MseI制备模板DNA。分析产生的AFLP指纹类型以确定粘粒克隆的顺序。选出了交叉nim区域的一套15个半重叠的粘粒(图5D)。粘粒DNA也用EcoRI、PstI、BssHII和SgrAI酶切。这使得能够估计粘粒插入片段的大小，并且证实了通过AFLP指纹确定的各种粘粒之间的重叠。物理图谱显示L84.Y1和L84.8之间的物理距离为＞90kb，则遗传图谱与物理距离之比约等于每cM1兆碱基。为帮助鉴定NIM1基因，测定了BAC04的DNA序列。实施例9含NIM1基因的克隆的鉴定从交NIM1区域的克隆得到的粘粒通过三亲交配接合转移，利用辅助菌株HB101(pRK2013)转移到根癌土壤杆菌AGL-1。这些粘粒用于通过真空渗透法(vacuuminfiltration)转化卡那霉素敏感的nim1-1拟南芥品系(Bechtold等，1993；Mindrinos等，1994)。收获被渗透植物的种子，使在GM琼脂平板上发芽，GM琼脂平板含50mg/ml卡那霉素作为选择剂。只有被粘粒DNA转化的小植物才能解除选择剂的毒性并存活。在种板大约两周后将存活下来的幼苗转移到土壤中并按上述检测nim1表型。不再具有nim1表型的转化植物鉴定了含有功能性NIM1基因的粘粒。实施例10nim1表型的互补将转移到土壤中的植物培养在人工气候室中约1周。3000μMINA以细雾状施用，采用chromister以完全覆盖植物。2天后，收获叶片提取RNA并进行PR-1表达分析。植物然后再用寄生霜霉(Emwa分离物)喷雾并在一个生长箱里在高湿度条件下培养，以白天19℃/夜间17℃和8小时光照/16小时黑暗为循环。真菌感染8到10天后，评价植物并检查真菌生长的阳性或阴性。以同样的方式处理Ws和nim1植物作为每次实验的对照。从收集的组织中用LiCl/酚提取缓冲液提取总RNA(Verwoerd，等，1989)。RNA样品在甲醛琼脂糖凝胶上电泳并转移到GeneScreenPlus(DuPont)膜上。斑点用32P-标记的PR-1cDNA探针杂交。将形成的斑点在胶片上曝光检测哪个转化子经INA处理后能够诱导PR-1表达。结果列于表4，显示nim1表型被粘粒克隆D5、E1和D7互补。表4NA-不适用实施例11NIM1基因区测序用于序列分析的DNA来源于BAC04DNA(25微克，来自KeyGene)，因为这个BAC是完全包括与nim1突变型互补的该区域的克隆。将BAC04DNA在喷雾器(nebulizer)中随机剪切形成平均长度约2kb的片段。剪切片段的末端被修复并纯化各片段。制备的DNA用EcoRV酶切的pBRKanF14(一种pBRK2nF1的衍生物(Bhat1993))连接。选择产生的卡那霉素抗性克隆用于质粒分离，采用WizardPlus9600微量制备系统(Promega)。采用染料终止子化学法(dyeterminatorchemistry)(应用生物系统公司，Foster市，加拿大)将质粒测序，使用设计的测序质粒两条链的引物(M13-21向前，T7向后，应用生物系统公司)。数据由ABI377DNA测序仪收集。将序列编辑并用Sequencher3.0(GeneCodes公司，AnnArbor，MI)组装到毗连序列群中，Staden基因组组装程序，phred，phrapandcrossmatch(PhilGreen，WanshingtonUniversity，St.Louis，MO)和consed(DavidGordon，WashingtonUniversity，St.Louis，MO)。粘粒中与nim1-1突变互补的DNA利用由Oligo5.0引物分析软件(国家生物科学公司，Plymouth，MN)设计的引物测序。来自Ws-O和nim1等位基因的DNA和cDNA的测序基本上按照上述进行。由粘粒E1和D7重叠确定的大约9.9kb的区域通过互补分析鉴定为含有nim1区。邻近载体插入位点的和对粘粒骨架特异的引物由Olig5.0引物分析软件(国家生物科学公司)设计。利用改进的醋酸铵方法从粘粒D7和E1中分离DNA(Traynor，P.L.，1990。生物技术9(6)676)。此DNA直接用上述染料终止子化学法测序。得到的序列允许测定互补区的末端。由粘粒E1和D7重叠确定的区域表示为SEQIDNO1。还构建了BamHI-EcoRV的被截短的版本，产生不含任何基因3区域的构件(图5D)。下列方法是必需的，因为在DNA的Bam-Spe区存在HindIII位点。BamHI-EcoRV构件用SpeI完全酶切，然后分为两个单独的反应进行双酶切。一份用BamHI酶切，另一份用HindIII酶切。从琼脂糖凝胶(QiaQuick凝胶提取试剂盒)中分离了一个2816bp的BamHI-SpeI片段和1588bp的HindIII-Spel片段，并连接到用BamHI-HindIII酶切的pSGCG01。将DH5α用连接混合物转化。通过用HindIII酶切，然后用WizardMagicMiniPreps(Promega)制备DNA筛选带有正确插入的所得克隆。将一个含有正确构件的克隆用电穿孔法导入土壤杆菌菌株GV3101用于转化拟南芥植物。实施例12NIM1区的序列分析和亚克隆用Sequencer3.0和GCG软件包分析含有NIM1基因的9.9kb区域是否在所有6个框中存在开放阅读框。4个含有大的开放阅读框的区域被鉴定为可能的基因(图5D中的基因区域1-4)。从野生型亲本和6个不同的nim1等位基因变种nim1-1、-2、-3、-4、-5和-6的DNA中用PCR扩增这4个区。用于扩增的引物是用Oligo5.0(国家生物科学公司)选择并由整合DNA技术公司(IntegratedDNATechnologiesInc)合成的。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上分离，并用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。纯化的基因组PCR产物直接测序，其中采用起始扩增所用的引物，以及另外设计的用于测序不被起始引物包含的任何序列的引物。这些基因区域的平均覆盖率大约为3.5里兹(reads)/碱基。将序列用Sequencher3.0编辑并组装。针对多种nim1等位基因的碱基改变被鉴定仅在命名为基因区2的区域，如下面表5所示，表示在所有6个nim1等位基因中的序列变化。表5<p>很明显NIM1基因位于基因区2中，因为在所有6个nim1等位基因中的基因区2之开放阅读框中发生了氨基酸改变或序列变化。同时，至少一个nim1等位基因在基因区1、3和4的开放阅读框中没有显示改变。因此，在9.9kb区域中含有NIM1基因的唯一的基因区是基因区2。表5中的Ws部分显示拟南芥的Ws生态型相对于拟南芥的哥伦比亚生态型的变化。此处列出的序列对应于拟南芥的哥伦比亚生态型，在此处所述的实验中其含有野生型基因。列出的变化是基因区2(NIM1区)的氨基酸的变化以及在其它区的碱基对的变化。含有nim1基因的粘粒区被表示为～5.3kb的BamHI-EcoRV限制片段。.D7的粘粒DNA和pBlueScriptII(pBSII)的质粒DNA用BamHI和用EcoRV(NEB)酶切。从琼脂糖凝胶中分离了D7的5.3kb片段并利用QIAquick凝胶提取试剂盒(#28796，Qiagen)纯化。将此片段过夜连接到以BamHI-EcoRV酶切的pBSII，并将连接混合物转化到大肠杆菌菌株DH5α。选择含有插入片段的克隆，分离DNA，并用HindIII酶切加以验证。再将BamHI-EcoRV片段导入双元载体(pSGCG01)用于转化拟南芥。实施例13四个基因区的Northern分析从分离自如前面Delaney，等(1995)中所述的用水、SA、BTH、和INA处理的Ws和nim1品系的RNA样品中制作相同的Northern印迹。这些印迹与从9.9kbNIM1基因区(SEQIDNO1)上鉴定的四个基因区形成的PCR产物杂交。只有含有NIM1基因(基因区2)的基因区具有与RNA样品可检测的杂交，说明只有NIM1含有可检测的转录基因(图5D和表5)。实施例14与基因区2互补通过进行另外的互补实验发现基因区2(图5D)还含有功能性NIM1基因。含有基因区2的BamHI/HindIII基因组DNA片段分离自粘粒D7，并被克隆到含有卡那霉素抗性基因的双元载体pSGCG01。产生的质粒被转化到土壤杆菌菌株GV3101，在卡那霉素上选择阳性克隆。PCR用于证明选出的克隆含有质粒。卡那霉素敏感的nim1-1植物用这种细菌按前述进行渗透。收获产生的种子并种到含有50μg/ml卡那霉素的GM琼脂板上。将经选择存活下来的植物转移到土壤中并检测互补性。被转化的植物和对照Ws及nim1植物用300μMINA喷雾。2天后，收获叶片提取RNA并分析PR-1表达。这些植物再用寄生霜霉(Emwa分离物)喷雾，并如前述加以培养。真菌感染10天后，评价植物并检查真菌生长阳性或阴性。所有15个转化植物以及Ws对照经INA处理后真菌生长均为阴性，而nim1对照真菌生长阳性。如上述提取这些转化子和对照的RNA并分析。Ws对照和所有15个转化子经INA处理后表现出PR-1基因被诱导，而nim1对照未表现出被INA诱导。实施例15NIM1cDNA的分离将在IYES表达载体中构建的拟南芥cDNA文库(Elledge等，1991，美国国家科学院院报88，1731-1735)涂布并制备噬菌斑等位滤膜。将滤膜用从基因区2(图5D)形成的32P标记的PCR产物杂交。从大约150000个噬菌斑中鉴定了14个阳性噬菌斑。将每个噬菌斑纯化，回收质粒DNA。将插入的cDNA用EcoRI从载体上切下来，琼脂糖凝胶纯化并测序。从最长的cDNA得到的序列表示在SEQIDNO2和图6中。为了证实得到了cDNA的5’末端，根据生产商的说明使用GibcoBRL5’RACE试剂盒。产生的RACE产物被测序并发现含有图6中所示的额外的碱基。存在于cDNA克隆中的转录区和在RACE中检测到的转录区在图6中以大写字母表示。等位基因中的改变表示在DNA链的上面。大写字母表示存在cDNA克隆中的或经RACEPCR后检测到的序列。在诱导研究(图3)中产生的相同的RNA样品也利用全长cDNA克隆为探针用NIM1基因进行探查。在图7中可以看出INA诱导了野生型Ws等位基因中的NIM1基因。然而，nim1-1突变等位基因显示较低的本底水平的NIM1基因表达，并且它不能被INA诱导。这与在nim1-3等位基因和nim1-6等位基因中观察到的相似。nim1-2等位基因在未处理的样品中显示大约正常水平的表达，并且显示与野生型样品相似的诱导，就象nim1-4等位基因那样。nim1-5等位基因似乎表现出较高本底水平的NIM1基因表达，并且被化学诱导物诱导时表现出更强的表达。D.NIM1同系物实施例16用NIM1序列进行搜索利用ClustalV构建了一个多重序列比较(Higgins，DesmondG.和PaulM.Sharp(1989)，微型计算机上的快速和灵敏的多重序列比较，CABIOS5151-153)作为部分DNA*(1228SouthParkStreet，MadisonWisconsin，53715)基于Macintosh的激光基因生物计算软件包(1994)。NIM1蛋白的某些区域的氨基酸序列与4种不同水稻cDNA蛋白质产物是同源的。同源性用GeneBankBLAST搜索中的NIM1序列进行鉴定。NIM1和水稻cDNA产物的同源区的比较示于图8(另参阅，SEQIDNO3和SEQIDNO4-11)。NIM1蛋白片段与4种水稻产物具有36％至48％的相同的氨基酸序列。实施例17从其它植物中分离同源基因利用NIM1cDNA作探针，通过从不同作物中筛选基因组或cDNA文库鉴定了拟南芥NIM1基因的同系物，其中不同的作物例如但并不限于在下面的实施例22中列出的那些。完成这种任务的标准技术包括杂交筛选涂布的DNA文库(或是噬菌斑或是菌落；参阅，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，(1989))以及用寡核苷酸引物通过PCR扩增(参阅，例如Innis等，《PCR技术方法与应用指南》，学院出版社(1990))。鉴定的同源区通过遗传工程导入此处的表达载体并转化到上面列出的作物中。利用所检测作物的相关病原体评价转化子增强的抗病性。在黄瓜、番茄、烟草、玉米、小麦和大麦基因组中的NIM1同源区已通过DNA印迹分析检测。从黄瓜、番茄、烟草、玉米、小麦和大麦中分离基因组DNA，用限制酶BamHI、HindIII、XbaI或SalI酶切，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离并通过毛细印迹转移到尼龙膜上。通过紫外交联结合DNA后，将膜在低度严格条件下[(1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl)，55℃杂交18-24小时]与32P标记的拟南芥NIM1cDNA杂交。杂交后将印迹在低度严格条件下洗涤(55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟；1×SSC是0.15MNaCl、15mM柠檬酸钠(pH7.0)，在X光胶片上曝光使相应于NIM1的带显见出来。另外，利用与NIM1基因的相似性鉴定的表达序列标签(EST)，例如在实施例16中描述的水稻EST，可以用于分离同系物。水稻的EST在从其它单子叶植物中分离NIM1同系物方面可能特别有用。同系物可以通过PCR得到。在这个方法中，在已知的同系物之间作比较(例如水稻和拟南芥)。氨基酸和DNA相似性高或相同性高的区域用于制备PCR引物。富含甲硫氨酸和色氨酸的区域后面最好紧随富含苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和谷氨酸的区域，因为这些氨基酸是由有限数目的密码子编码的。一旦一个合适的区域被鉴定，通过在第三位密码子位点引入不同的替换制备用于该区域的引物。在第三位点的不同的替换可能受到作为目标的区域种类的限制。例如，玉米是富含GC的，如果可能的话设计的引物在第三个位点采用一个G或是一个C。在多种不同的标准条件下，从cDNA或基因组DNA进行PCR反应。当显示出来一条带时，将它克隆和/或测序以检测它是否是NIM1同系物。E.NIM1过量表达赋予植物抗病性在转基因植物中NIM1基因过量表达赋予植物CIM表型也在申请人于1996年12月27日提交的美国专利申请08/773,554中有描述，在此完整引入作为参考。实施例18由于插入位点效应引起的NIM1的过量表达为检测是否上述实施例10/表4中的任何转化子都由于插入位点效应过量表达NIM1基因，将含有D7、D5或E1粘粒(含有NIM1基因)的初级转化子自交并收集T2种子。来自一个E1种系、4个DS种系和95个D7种系的种子播种于土壤中，如上所述生长。当T2植物长到至少4片真叶时，从每一株植物上分别单独收获一片叶子。从该组织中提取RNA并进行PR-1和NIM1表达分析。然后用寄生霜霉(Emwa)接种植物，在感染后3-14天，优选地7-12天分析真菌生长。表现高于正常的NIM1和PR-1表达水平并显示真菌抗性的植物说明NIM1的过量表达赋予了CIM表型。表6显示检测多种转化子对真菌感染的抗性的结果。从表中可以看出，许多转化子表现出低于正常水平的真菌生长，并且有几株根本没有可见的真菌生长。从收集的样品中制备RNA并如前述加以分析(Delaney等，1995)。品系D7-74、D5-6和E1-1表现PR-1基因表达的早期诱导，而真菌处理后24或48小时可见PR-1mRNA的出现。这三个品系还表现出对真菌感染的抗性。表6>植物用寄生霜霉Emwa分离物感染并在10天后检查+，正常真菌生长+/-，低于正常的真菌生长阴性，无可见真菌生长实施例19在自身启动子控制下的NIM1过量表达组成型表达NIM1基因的植物是从用BamHI-HindIIINIM1基因组片段(SEQIDNO2-碱基1249-5655)转化的Ws野生型植物中得到的，该片段含有1.4kb的启动子序列。将此片段克隆到pSGCG01并转化到土壤杆菌菌株GV3101(pMP90，Koncz和Schell(1986)，分子基因遗传学204383-396)。Ws植物如前述渗透。收集产生的种子并种到含50μg/ml卡那霉素的GM琼脂上。将存活下来的幼苗转移到土壤中并如上述检测对寄生霜霉Emwa分离物的抗性.将选择出的植物自交并进行随后两代选择以形成纯合系。将几株这些纯合系的种子播到土壤中，每个品系15-18株，生长三周，再次检测对Emwa的抗性，此前不用诱导化学品作任何处理。真菌处理后大约24小时、48小时和5天后，收集组织，合并并冷冻每个品系。接种后将植物在生长箱中保持10天，然后检查对Emwa的抗性。从所有收集的样品中制备RNA并如前述加以分析(Delaney等，1995)。将斑点与拟南芥基因探针PR-1杂交(Uknes等，1992)。13个转基因品系中的5个经分析显示PR1基因表达的早期诱导。对于这些品系，被真菌处理后24或48显示出现PR-1mRNA。并且这5个品系没有可见的真菌生长。叶片如前述用乳酚蓝染色(Dietrich等，1994)以证实在叶片中没有真菌菌丝。在其它8个品系中48小时后PR-1基因表达没有被诱导，且这些植物不表现对Emwa的抗性。还检测了抗性品系的一个亚组对细菌病原体丁香假单胞菌DC3000的增强的抗性，以评价如Uknes等(1993)描述的抗性谱。实验基本上按照Lawton等(1996)所述进行。在对Emwa表现组成型抗性的这些品系中细菌的生长也较慢。这说明在自身启动子控制下过量表达NIM1基因的植物有针对病原体基因的组成型免疫。为评价在这些品系中CIM表型的另外特征，评价未感染的植物中游离的水杨酸和结合葡萄糖的水杨酸，叶片用乳酚蓝染色以评价微观病斑的存在。抗性植物与SAR突变型如NahG和ndr1进行有性杂交以建立抗性表型对其它突变型的上位关系，并评价NIM1的这些显性负性突变型是如何影响依赖水杨酸的反馈环的。实施例2035S驱动的NIM1的过量表达将全长的NIM1cDNA(SEQIDNO21)克隆到pCGN1761ENX的EcoRI位点(Comai等，(1990)植物分子生物学15，373-381)。从产生的质粒中得到一个含有增强CaMV35S启动子的XbaI片段、处于正确转录方向的NIM1cDNA和一个tml3’终止子。将此片段克隆到双元载体pCIB200并转化到GV3101。Ws植物按前述进行渗透转化。收集产生的种子并种到含50μg/ml卡那霉素的GM琼脂上。将存活下来的幼苗转移到土壤中并如上述加以检测。将选择出的植物自交并进行随后两代选择以形成纯合系。测试的58个品系中的9个经Emwa处理后表现出抗性，Emwa处理前没有进行化学品处理。因此，NIM1cDNA的过量表达也导致了抗病性植物。实施例21在作物类植物中高水平表达NIM1将那些赋予Col-0或Ws-0以及其它作物CIM表型的构件转化到作物类植物中进行评价。尽管NIM1基因可以被插入到属于这些种类广泛的任何植物细胞中，它在作物类植物中特别有用，例如水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。评价转化子增强的抗病性。在本发明的一个优选实施方案中，NIM1基因的表达水平至少是野生型植物的NIM1基因表达水平的两倍以上，优选地是野生型表达水平的10倍以上。F.通常nim表型植物的其它应用实施例22nim突变型在病害检测上的应用nim突变型用多种病原体侵袭，发现形成比野生型植物更大更快的病斑。这种表型称为UDS(即广泛病害敏感性)，这是突变型不能表达SAR基因影响植物对病原体防卫的结果。nim突变型的UDS表型使它们可以被用作对照植物用于评价田间病原体实验的实验品系之病症，因为实验中所谓的野生型品系的天然抗性表型可能各不相同(即抵抗不同病原体或对相同病原体的不同病变型)。因此，依赖病原体自然感染的田间环境评价实验品系的抗性，适当的作物类植物品种的nim突变系实验的引入使之能够评价病原体压力的真实水平和病害谱，而不会有使用非实验品系的内在差异。实施例23转基因用于抗病性的实用性评价将nim突变型作为转基因转化的宿主植物以帮助评价它们在抗病性上的应用。例如，以其UDS表型为特征的一个拟南芥nim突变型品系，用于经抗病性候选基因的转化从而使之能够评价一个单独基因对抵抗本底水平的UDSnim突变型植物的贡献。实施例24；nim突变型作为理解植物-病原体相互作用的工具nim突变型有助于理解植物与病原体的相互作用，特别是用于理解被病原体用来侵入植物细胞的过程。这是由于nim突变型不能对病原体的进攻产生系统性反应，而且病原体的不减弱的发生是研究病原体与宿主生物学相互作用的理想的方案。更重要的是观察到宿主nim突变型植物可能对通常与该宿主结合而与不同宿主结合的病原体变得敏感。例如，一种拟南芥nim突变型如nim1-1、-2、-3、4、-5或-6受到通常只感染烟草的一系列病原体的进攻，并且发现其对它们敏感。因此，引起UDS表型的nim突变型导致病原体范围敏感性改变，这在宿主与病原体相互作用的分子、遗传和生化分析方面具有重要应用。实施例25nim突变型用于杀真菌剂筛选nim突变型在筛选具有杀真菌剂活性的新化学化合物上特别有用。在特定宿主中选择的nim突变型对于利用该宿主及其病原体筛选杀真菌剂上具有相当的用途。其优越性在于突变型的UDS表型克服了宿主对不同病原体和病变型具有不同敏感性的问题，或者甚至对一些病原体或病变型具抗性的问题。以举例的方式，小麦中的nim突变型可有效用于杀真菌剂的筛选，用于多种小麦病原体和病变型，因为突变型不能对引入的病原体产生抗性反应，故不能对不同的病变型产生不同的抗性，否则就需要使用多个小麦品系，其中每一个都对特定的供试病原体足够敏感。具有特殊兴趣的小麦病原体包括(但并不限于)禾白粉菌(Erisyphegraminis)(霜霉病的致病菌)，立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)(尖眼点病(sharpeyespot)的致病菌)，假尾孢菌(Pseudocercosporellaherpotrichoides)(眼点病的致病菌)，锈病菌(Pucciniaspp.)(锈病的致病菌)和颍枯壳针孢(Septorianodorum)。相似地，玉米的nim突变型可能对玉米病原体高度敏感，因此可用于筛选针对玉米病害具有活性的杀真菌剂中。nim突变型更可用于从异源宿主中筛选多种病原体和病变型，即通常不属于特定病原体的宿主种类范围，并且特别容易操作的宿主(例如拟南芥)中。由于其UDS表型，异源宿主对其它植物品种的病原体敏感，包括重要的经济作物品种。因此，例如，相同的拟南芥nim突变型可用小麦病原体如禾白粉菌(霜霉病的致病菌)或玉米病原体如玉蜀黍长蠕孢(Helminthosporiummaydis)感染，并用于检测候选杀真菌剂的效果。这种方法的效果在最近用于筛选个体作物品种和具有不同病原体和病变型之不同品种的过程中有了相当大的提高，不同的病原体和病变型对不同的作物品种具有不同的毒性。而且，拟南芥的应用具有优越性，因为它体积小，因此可利用有限的空间资源进行更多的实验。实施例26NIM1是IκBα的同系物进行NIM1和IκB的蛋白基因产物之间的多重序列比较，据此确定NIM1基因产物是IκBα的同系物(图9)。利用BLAST进行序列同源性搜索(Altschul等，分子生物学杂志215403-410(1990))。利用ClustalV(Higgins等，CABIOS5，151-153(1989))建立多重序列比较，ClustalV是DNASTAR的激光基因生物计算软件包的一部分(Madison，WI)。在比较中使用的序列是NIM1(SEQIDNO3)、小鼠IκBα(SEQIDNO18，GeneBank保藏号1022734)，大鼠IκBα(SEQIDNO19，GeneBank保藏号57674和X63594；Tewari等，核酸研究20，607(1992))和猪IκBα(SEQIDNO20；GeneBank保藏号Z21968；deMartin等，EMBOJ.12，2773-2779(1993))；GeneBank保藏号517193，deMartin等，基因152，253-255(1995))。用于Clustal分析的参数是罚区间10和罚区间长度10。用PAM250权重表(weighttable)计算进化分歧距离(Dayhoff等，“蛋白质中的进化变化模型，检测距离关系的矩阵”，《蛋白质序列与结构图集》，第5期，增刊3，M.O.，Dayhoff，编(国家医学研究基金会，华盛顿，D.C.)，第345-358页(1978))。残基的相似性用改进的Dayhoff表计算(Schwartz和Dayhoff，“蛋白质进化变化模型”，《蛋白质序列与结构图集》，M.O.，Dayhoff，编(国家医学研究基金会，华盛顿，D.C.)，第353-358页(1979))；Gribskov和Burgess，核酸研究14，6745-6763(1986))。同源性搜索显示NIM1与几种蛋白质的锚蛋白结构域相似，包括锚蛋白、NF-κB和IκB。对IκB及其相关分子具有最完全的同源性(图9)。NIM1在氨基酸位点55和59含有两个丝氨酸，位点59的丝氨酸处于序列(D/E×××××S)和位点(N-末端)中，其作用与依赖于磷酸化的、遍在蛋白质介导的可诱导降解的角色相符。所有IκB都具有这些N-末端丝氨酸并且它们是IκB失活及随后释放NF-IκBα所需的。NIM1具有锚蛋白结构域(氨基酸262-290和323-371)。据信锚蛋白参与蛋白质-蛋白质相互作用，并且是IκB和NF-κB分子遍在蛋白质化的特征。IκB的C-末端可以是不同的。在一些IκB的C-末端发现NIM1与富含QL的区域有一些同源性(氨基酸491-499)。实施例27NIM1变形体的形成-将丝氨酸残基55和59变成丙氨酸残基人IκBα中丝氨酸残基的磷酸化是IκBα的刺激激活降解所需的并籍此活化NF-κB。在人IκBα中丝氨酸残基(S32-S36)突变形成丙氨酸残基，抑制了由刺激诱导的磷酸化，因而阻断了IκBα蛋白体介导的降解(E.Britta-MareenTraenckner等，EMBOJ.142876-2883(1995)；Brown等，科学2671485-1488(1996)；Brockman等，分子和细胞生物学152809-2818(1995))；Wang等，科学274784-787(1996))。这个IκBα变形体作为一种显性负性形式使NF-κB保留在胞质中，从而阻断下游信号传导。根据NIM1和IκB序列的比较，NIM1的丝氨酸55(S55)和59(S59)与人IκBα的S32和S36同源。为建立NIM1的显性-负性形式，将在氨基酸位点55和59的丝氨酸诱变成丙氨酸残基。这可以通过任何为本领域的技术人员所知道的方法进行，例如，使用QuikChange定点突变盒(#200518Strategene)。使用含有42bp5’非翻译序列(UTR)和187bp3’UTR的全长NIM1cDNA(SEQIDNO21)，采用下列引物按照生产商的说明可以得到突变的构件(SEQIDNO21，位点192-226)5’-CAACAGCTTCGAAGCCGTCTTTGACGCGCCGGATG-3’(SEQIDNO32)和5’-CATCCGGCGCGTCAAAGACGGCTTCGAAGCTGTTG-3’(SEQIDNO33)，其中有下划线的碱基表示突变。策略如下将克隆至载体pSE936(Elledge等，美国国家科学院院报881731-1735(1991))的NIM1cDNA变性，将含有改变的碱基引物退火。DNA聚合酶(Pfu)通过非链置换延伸引物产生有缺刻的环状链。DNA用只切甲基化位点(非突变的模板DNA)的DpnI限制性内切酶酶切。保留的环状双链DNA转化到大肠杆菌菌株XL1-Blue。从形成的克隆中提取质粒并测序以证明突变碱基的存在和证实没有发生其它突变。用限制性内切核酸酶EcoRI酶切突变的NIM1cDNA并克隆到pCGN1761中，其受花椰菜花叶病毒的双35S启动子的转录调控。含有35S启动子、NIM1cDNA和tml终止子的转化盒是通过XbaI部分限制性酶切从pCGN1761中释放下来的，并将它连接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位点。SEQIDNO22和23分别表示这个NIM1基因变形体的DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中这样一个等位基因的编码序列在下列条件下与SEQIDNO22中的编码序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次15分钟。在这些实施方案中，在这些条件下与SEQIDNO22杂交的NIM1等位基因被改变，使得编码产物在相应于SEQIDNO22的位点55和59的氨基酸位点上的丝氨酸变成丙氨酸。.实施例28形成NIM1变形体-N-端缺失人IκBα含有K21、K22、S32和S36，其中氨基酸1-36(Brockman等；Sun等)或1-72(Sun等)的缺失导致在被转染的人细胞培养物中的显性-负性IκBα表型。NIM1cDNA编码产物的大约前125个氨基酸的N-末端缺失去除了可作为潜在遍在蛋白质化位点的8个赖氨酸残基，还去除了在S55和S59的推断的磷酸化位点(见实施例2)。这种改变的基因构件可通过任何为本领域技术人员所知的方法产生。例如，利用Ho等，基因7751-59(1989)的方法，可以产生一种NIM1形式，其中编码大约前125个氨基酸的DNA被删除了。下列引物产生一个1612-bp的PCR产物(SEQIDNO21418-2011)5’-ggaattca-ATGGATTCGGTTGTGACTGTTTTG-3’(SEQIDNO34)和5’-ggaattcTACAAATCTGTATACCATTGG-3’(SEQIDNO35)，其中合成的起始密码子加下划线(ATG)，EcoRI衔接物序列为小写字母。利用一反应混合物扩增片段，其中含有0.1-100ng模板DNA，10mMTrispH8.3/50mMKCl/2mMMgCl2/0.001％明胶/0.25mM各种dNTP/0.20mM每个引物和1个单位的rTthDNA聚合酶，终体积为50μL，使用PerkinElmerCetus9600PCR仪。PCR的条件如下94℃3分钟35×(94℃30秒52℃1分钟72℃2分钟)72℃10分钟。PCR产物被直接克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)。由PCR形成的PCR载体上的插入片段通过EcoRI限制性内切酶酶切被释放，并连接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位点，其受双35S启动子的转录调控。将构件测序以证明合成的起始ATG的存在，并证实在PCR过程中没有发生其它突变。含有35S启动子、改造的NIM1cDNA和tml终止子的转化盒是通过XbaI部分限制性酶切从pCGN1761ENX中释放下来的，并将它连接到pCIB200的XbaI位点。SEQIDNO24和25分别表示具有N-末端氨基酸缺失的NIM1基因变形体的DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中这样一个等位基因的编码序列在下列条件下与SEQIDNO24中所示的编码序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在这些条件下与SEQIDNO24杂交的NIM1的等位基因被改变，使得编码产物的N-末端缺失，去除了可作为潜在遍在蛋白质化位点的赖氨酸残基，以及在相应于野生型基因产物的位点55和59的氨基酸位点上的丝氨酸。实施例29形成NIM1变形体-C-端缺失人IκBα的氨基酸261-317的缺失据信可通过阻断C-末端的丝氨酸和苏氨酸残基的组成型磷酸化导致内在稳定性增强。一个富含丝氨酸和苏氨酸的区域存在于NIM1之C-末端的氨基酸522-593处。NIM1基因的C-末端编码区可以通过删除编码氨基酸522-593的核苷酸序列进行改造。利用Ho等，(1989)的方法，NIM1cDNA的C-末端编码区和3’UTR(SEQIDNO211606-2011)通过PCR被删除，用下列引物形成了一个1623bp的片段5’-cggaattcGATCTCTTTAATTTGTGAATTTC-3’(SEQIDNO36)和5’-ggaattcTCAACAGTTCATAATCTGGTCG-3’(SEQIDNO37)，其中合成的终止密码加下划线(在互补链上为TGA)，EcoRI衔接物序列为小写字母。PCR反应的组分如前面所述，循环参数如下94℃3分钟30×(94℃30秒52℃1分钟72℃2分钟)72℃10分钟。PCR产物被直接克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)。由PCR形成的PCR载体上的插入片段通过EcoRI限制性内切酶酶切被释放，并连接到含有双35S启动子的去磷酸化的pCGN1761之EcoRI位点。将构件测序以证明合成依读框的终止密码子的存在，并证实在PCR过程中没有发生其它突变。含有35S启动子、改造的NIM1cDNA和tml终止子的转化盒是通过XbaI部分限制性酶切从pCGN1761ENX中释放下来的，并将它连接到去磷酸化的pCIB200的XbaI位点。SEQIDNO26和27分别表示具有C-末端氨基酸缺失的NIM1基因变形体的DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中这样一个等位基因的编码序列在下列条件下与SEQIDNO26中所示的编码序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO26杂交的NIM1的等位基因被改变，使得编码产物的C-末端缺失，去除了丝氨酸和苏氨酸残基。实施例30形成NIM1变形体-N-末端/C-端缺失嵌合体一个N-末端和C-末端缺失形式的NIM1是利用位点819(SEQIDNO21)的单一KpnI限制位点形成的。N-末端缺失形式(实施例28)用EcoRI/KpnI限制性内切酶酶切，通过凝胶电泳回收相应于改造的N-末端的415bp片段。同样地，C-末端缺失形式(实施例29)用EcoRI/KpnI限制性内切酶酶切，通过凝胶电泳回收相应于改造的C-末端的790bp片段。此片段在15℃用EcoRI酶切以消除EcoRI多联体，并克隆到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位点。N/C-末端缺失形式的NIM1受双35S启动子的转录调控。类似地，形成嵌合体形式的NIM1，它含有与C-末端缺失(实施例29)融合的S55/S59突变的推断的磷酸化位点(实施例27)。此构件按上述形成。将构件测序以证明起始和终止密码的忠实性，并证实在克隆过程中没有发生突变。含有35S启动子、NIM1嵌合体和tml终止子的各自的转化盒通过XbaI部分酶切从pCGN1761中释放，并连接到去磷酸化pCIB200的XbaI位点。SEQIDNO28和29分别表示具有N-末端和C-末端氨基酸缺失的NIM1基因变形体的DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中这样一个等位基因的编码序列在下列条件下与SEQIDNO28中所示的编码序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO28杂交的NIM1的等位基因被改变，使得编码产物既具有N-末端缺失，其去除了可作为潜在遍在蛋白质化位点的赖氨酸残基和相应于野生型基因产物的位点55和59的氨基酸位点上的丝氨酸，还具有C-末端缺失，其去除了丝氨酸和苏氨酸残基。实施例31形成NIM1变形体-锚蛋白结构域大约在氨基酸103-362处NIM1表现出与锚蛋白基元件的同源性。利用Ho等，(1989)的方法，编码推断的锚蛋白结构域(SEQIDNO23093-3951)的DNA序列从NIM1cDNA(SEQIDNO21349-1128)中经PCR扩增(条件为94℃3分钟35×(94℃30秒62℃30秒72℃2分钟)72℃10分钟)，采用下列引物5’-ggaattcaATGGACTCCAACAACACCGCCGC-3’(SEQIDNO38)和5’-ggaattcTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG-3’(SEQIDNO39)。形成的产物用EcoRI限制性内切酶酶切，并连接到去磷酸化的pCGN1761的EcoRI位点，受双35S启动子转录调控。将此构件测序以证明合成的起始密码(ATG)和依读框的终止密码(TGA)的存在，并证实在PCR过程中没有发生其它突变。含有35S启动子、锚蛋白结构域和tml终止子的转化盒是通过XbaI部分限制性酶切从pCGN1761中释放，并连接到去磷酸化pCIB200的XbaI位点。SEQIDNO30和31分别表示NIM1的锚蛋白结构域的DNA编码序列和所编码的氨基酸序列。本发明还包括NIM1等位基因的变形体，其中这样一个等位基因的编码序列在下列条件下与SEQIDNO30中所示的编码序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。在这些实施方案中，在上述条件下与SEQIDNO30杂交的NIM1的等位基因被改变，使得编码产物基本上由野生型基因产物的锚蛋白结构域组成。实施例32嵌合基因的构建为了增加NIM1变形体在适当的时间和空间表达的可能性，含有NIM1启动子及基因的一个4407bpHindIII/BamHI片段(SEQIDNO2碱基1249-5655)和/或一个5655bpEcoRV/BamHI片段(SEQIDNO2碱基1-5655)被用于建立在上述实施例27-31中的NIM1变形体。尽管构建的步骤有所不同，其概念却是与前述实施例可比的。变形体强的过量表达可能是潜在地致死的。因此，在实施例27-31中描述的NIM1基因变形体被置于除内源NIM1启动子以外的启动子的调控之下，启动子包括但并不限于nos启动子或Rubisco启动子的小亚单位。同样地，NIM1变形体可以在应答病原体的启动子PR-1(美国专利5,614,395)的调控下表达。这种表达仅在受到病原体攻击或其它SAR激活条件下允许NIM1变形体强表达。而且，当用通常并不激活SAR的SAR激活化合物(即BTH或INA)的浓度处理时，在受PR-1启动子调控下表达NIM1变形体的转化子中可见抗病性，因而激活了一个反馈环(Weymann等，(1995)植物细胞72013-2022)。实施例33将NIM1变形体转化到拟南芥中将形成的构件(实施例27-32)通过电穿孔转移到根癌土壤杆菌菌株GV3101中。这些构件被用于通过真空渗透(Mindrinos等，细胞78，1089-1099(1994))或通过标准的根转化技术转化拟南芥生态型Col-0和Ws-0。收获这些植物的种子并使之在添加了作为选择剂的卡那霉素(或另一种适当的抗生素)的琼脂板上发芽。只有被粘粒DNA转化的幼苗能够解除选择剂的毒性并存活下来。将在选择中存活下来的幼苗转移到土壤中并测试CIM(组成型免疫)表型。根据与野生型相比较可见的表型差异评价植物。实施例34用NIM1变形体转化的植物的CIM表型的评价收获每个初级转化子的叶子，分离RNA(Verwoerd等，1989，核酸研究，2362)，并通过RNA印迹分析(Uknes等，1992)测试组成型PR-1表达。评价每个转化子的作为组成型SAR表达分析指示之增强的抗病性反应(Uknes等，1992)。制备两种相容性的寄生霜霉分离物，Emwa和Noco(就是说这些真菌菌株分别在野生型Ws-0和Col-0植物引起病害)的分生孢子悬液，浓度为5-10×104个孢子/ml，根据转化子的生态型用适当的分离物喷雾。接种的植物在高温下培养7天。在第7天将植物进行病害分级，收获一片叶子，利用一种提供测量真菌感染的工具的探针用于RNA印迹分析。将表现CIM表型的转化子长到T1代并鉴定纯合植物。转化子进行一组下述的抗病性测试。重复用Noco和Emwa的真菌感染，将叶片用乳酚蓝染色按照Dietrich等，(1994)中的描述鉴定真菌菌丝体的存在。将转化子用细菌病原体丁香假单胞菌DC3000感染以评价如Uknes等，(1993)中所述的抗性谱。评价未感染的植物中游离的和与葡萄糖结合的SA，将叶片用乳酚蓝染色以评价微观病斑的存在。抗性植物与SAR突变型如NahG(美国专利5,614,395)和ndr1进行有性杂交，以建立抗性表型与其它突变型的上位关系，并评价这些NIM1的显性-负性突变型是如何影响依赖于SA的反馈环的。实施例35NIM1同系物的分离使用NIM1cDNA(SEQIDNO21)作探针，通过从不同作物中筛选基因组或cDNA文库鉴定了拟南芥NIM1的同系物，不同作物例如但并不限于在下面的实施例36中列出的那些。完成此种任务的标准技术包括杂交筛选涂布的DNA文库(或是噬菌斑或是菌落；参阅，例如，Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，(1989))以及用寡核苷酸引物通过PCR扩增(参阅，例如Innis等，PCR技术方法与应用指南》，学院出版社(1990))。鉴定的同系物一般通过遗传工程导入表达载体并转化到上面列出的作物中。利用所检测作物的相应的病原体评价转化子增强的抗病性。在黄瓜、番茄、烟草、玉米、小麦和大麦基因组中的NIM1同系物已通过DNA印迹分析检测。从黄瓜、番茄、烟草、玉米、小麦和大麦中分离基因组DNA，用限制酶BamHI、HindIII、XbaI或SalI酶切，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离并通过毛细印迹转移到尼龙膜上。通过紫外交联结合DNA后，将膜在低度严格条件下[(1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl)，55℃杂交18-24小时]与32P标记的拟南芥NIM1cDNA杂交。杂交后将印迹在低度严格条件下洗涤(55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟；1×SSC是0.15MNaCl、15mM柠檬酸钠(pH7.0)在X光胶片上曝光使相应于NIM1的带显见出来。另外，利用与NIM1基因的相似性鉴定的表达序列标签(EST)鉴定同系物。例如几种水稻EST已鉴定为与NIM1基因有相似性。利用ClustalV构建了一个多重序列比较(Higgins，DesmondG.和PaulM.Sharp(1989)，快速和灵敏的多重序列比较在微型计算机上进行，CABIOS5151-153)作为部分DNA*(1228SouthParkStreet，MadisonWisconsin，53715)基于Macintosh的激光基因生物计算软件包(1994)。NIM1蛋白的某些区域的氨基酸序列与4种不同水稻cDNA蛋白产物是同源的。同源性用GeneBankBLAST搜索中的NIM1序列进行鉴定。NIM1和水稻cDNA产物的同源区的比较示于图8(另参阅，SEQIDNO3和SEQIDNO4-11)。NIM1蛋白片段与4种水稻产物具有36％至48％的相同的氨基酸序列。这种水稻的EST在从其它单子叶植物中分离NIM1同系物方面可能特别有效。同系物可以通过PCR得到。在这个方法中，在已知的同系物之间作比较(例如水稻和拟南芥)。氨基酸和DNA相似性或相同性高的区域用于制备PCR引物。富含甲硫氨酸和色氨酸的区域后面最好紧随富含苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和谷氨酸的区域，因为这些氨基酸是由有限数目的密码子编码的。一旦一个合适的区域被鉴定，通过在第三位密码子位点引入不同的替换制备该区域的引物。在第三位点的不同的替换可能受到作为目标的该区域种类的限制。例如，玉米是富含GC的，如果可能的话设计的引物在第三位点采用一个G或是一个C。在多种不同的标准条件下，从cDNA或基因组DNA进行PCR反应。当一条带显示出来时，它被克隆并/或被测序以检测它是否是NIM1同系物。实施例36在作物类植物中表达NIM1变形体将那些在Col-0或Ws-0中赋予CIM表型的构件转化到作物类植物中进行评价。或者，将从前面例子中作物中分离的改变的天然NIM1基因放回到各自作物中。尽管NIM1基因可以插入到属于这些大类的任何植物细胞中，但是在作物类植物中特别有用，例如水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、挑、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。评价转化子增强的抗病性。在本发明的一个优选实施方案中，NIM1基因变形体的表达水平至少是在野生型植物中的天然NIM1基因表达水平的2倍以上，优选地是野生型表达水平的10倍以上。参考文献下列每个文献的公开都被清楚地引入到本发明中Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.(1990)。基本的局部对比搜索工具，分子生物学杂志215，403-410。Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，和Struhl，K.，编(1987)，《现代分子生物学技术》，(纽约J.Wiley和Sons).Bechtold，N.，Ellis，J.，和Pelletier，G.(1993).作物土壤杆菌介导的基因渗透转移成年拟南芥植物。ComptesRendusdeI’AcademiedesSciencesParis，SerieSciencesDeLaVie316，494-499。Bell，C.，和Ecker，J.(1994).30个微卫星位点在拟南芥连接图上的分配。基因组学19，137-144。Bhat，K.(1993).用于通过快速多定点突变缺失克隆的质粒载体的形成，基因134，83-87。Bi，Y.M.，Kenton，P.，Mur，L.，Darby，R.，和Draper，J.(1995)，过氧化氢不能在诱导PR蛋白表达的水杨酸的下游起作用。植物杂志8，235-245。Bowling，S.A.，Guo，A.，Cao，H.，Gordon，A.S.，Klessig，D.F.，和Dong，X.I.(1994)，导致系统获得性抗性的拟南芥的一个突变，植物细胞，6，1845-1857。Cameron，R.K.，Dixon，R.A.，和Lamb，C.J.(1994)，拟南芥中的生物学诱导的系统获得性抗性。植物杂志5，715-725。Century，K.S.，Holub，E.B.，和Staskawicz，B.J.(1995).NDR1，一个为细菌和真菌病原体抗性所需的拟南芥的位点。美国国家科学院院报92，6597-6601。Chio，S.，Creelman，R.，J.，M.，和Wing，R.(1995)一个拟南芥的细菌人工染色体文库的构建和鉴定。植物分子生物学13，124-128。Creusot，F.，Fouillox，E.，Dron，M.，Lafleuriel，J.，Picard，G.，Billaut，A.，LePaslier，D.，Cohen，D.，Chaboute，M.E.，Durr，A.，Fleck，J.，Gigot，C.，Camilleri，C.，Bellini，C.，Caboche，M.，和Bouchez，D.(1995).CIC文库用于拟南芥基因组作图的一个大的插入YAC文库。植物杂志8，763-770。Delaney，T.P.(1997)获得性抗病性的遗传解析。植物生理113，5-12。Delaney，T.P.，Uknes，S.，Vernooij，B.，Friedrich，L.，Weymann，K.，Negrotto，D.，Gaffney，T.，Gutrella，M.，Kessmann，H.，Ward，E.，和Ryals，J.(1994).水杨酸在植物抗病性的中心角色。科学266，1247-1250。Delaney，T.P.，Friedrich，L.，和Ryals，J.A.(1995).化学和生物学诱导的抗病性缺陷的拟南芥信号传导突变型。美国国家科学院院报92，6602-6606。Dempsey，D.A.，和Klessig，D.F.(1995).植物抗病性中的信号。BulletindeL’institutPasteur93，167-186。Dietrich，R.A.，Delaney，T.P.，Uknes，.J.，Ward，E.R.，Ryals，J.A.，和Dangl，J.L.(1994).模拟抗病性反应的拟南芥突变型。细胞77，565-577。Friedrich，L，Lawton，K.，Ruess，W.，masner，P.，Specker，N.，GutRella，M.，Meier，B.，Dincher，S.，Metraux，J.-P.，Kessmann，H.，和Ryals，J.(1996).在烟草中诱导系统获得性抗性的一个苯并噻二唑衍生物。植物杂志10(1)，61-70.Elledge，S.，Mulligan，J.，Ramer，S.，Spottswood，M.，和Davis，R.(1991).用于酵母和大肠杆菌突变互补分离基因的一个多功能cDNA表达载体。美国国家科学院院报88，1731-1735。Gaffney，t.，Friedrich，L.，Vernooij，B.，negrotto，D.，Nye，G.，Uknes，S.，Ward，E.，Kessmann，H.，和Ryals，J.(1993).系统获得性抗性的诱导对水杨酸的需求。科学261，754-756。Greenberg，J.T.，Guo，A.L.，Klessig，D.F.，和Ausubel，F.M.(1994).植物中的程序化细胞死亡*D*D由病原体和多种防卫功能联合激发的反应。细胞77，551-563。Hebsgaard，S.，Korning，P.，Tolstrup，J.，Engelbrecht，J.，Rouze，P.，和Brunak，S.(1996).结合本地和全球序列信息预测拟南芥前体mRNA剪接位点。核酸研究24，3439-3542。Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989).微型计算机中的快速敏感的序列对比。CABIOS5，151-153。Hunt，M.，和Ryals，J.(1996).系统获得性抗性信号传导。植物科学评论15，583-606。Lawton，K.，Uknes，S.，Friedrich，L，Gaffney，T.，Alex和er，D.，Goodman，R.，Metraux，J.-P.，Kessmann，H.，Ahl-Goy，P.，GutRella，M.，WardE.，和Ryals，J.(1993).系统获得性抗性的分子生物学。见《植物中的防卫反应机制》B.Fritig和M.Legr和，编(Dordrecht，荷兰Kluwer学院出版公司)第422-432页。Lawton，K.，Uknes，S.，Friedrich，L，Hunt，M.，Weymann，K，Delaney，T.，Kessmann，H.，Staub，T.，和Ryals，J.(1996).苯并噻二唑衍生物通过激活系统获得性抗性信号传导途径诱导拟南芥抗病性。植物杂志10，71-82。Liu，Y.-G.，Mitsukawa，N.，Vazquez-tello，A.，和Whittler，R.(1995).适合染色体步行的高质量的拟南芥P1文库的建立。植物杂志7，351-358。Maher，E.A.，Bate，N.J.，Ni，W.T.，Elkind，Y.，Dixon，R.A.，和Lamb，C.J.(1994).预形成的phenylpropanoid产物水平被抑制的转基因烟草植物增强的病害敏感性。美国国家科学院院报91，802-7806。Mauch-Mani，B.，和Slusarenko，A.J.(1994).被尖镰孢菌预先感染拟南芥中的系统获得性抗性。分子植物-微生物相互作用7，378-383。Mauch-Mani，B.，和Slusarenko，A.J.(1996).水杨酸前体物的产生是拟南芥对寄生霜霉抗性中的苯丙氨酸氨解酶的一个主要功能。植物细胞8，203-212。Mindrinos，M.，Katagiri，F.，Yu，G.L.和Ausubel，F.(1994).拟南芥抗病基因rps2编码含有核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复的蛋白质。细胞78，1089-1099。Pallas，J.，Paiva，N.，Lamb，C.，和Dixon，R.(1996).在苯丙氨酸解氨酶表达中被渐成式抑制的烟草植物不能形成对烟草花叶病毒感染反应的系统获得性抗性。植物杂志10，281-293。Ryals，J.A.，Neuenschw和er，U.H.，Willits，M.G.，Molina，A.，Steiner，H.-Y.，和Hunt，M.D.(1996).系统获得性抗性。植物细胞8，1809-1819。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.(1989).《分子克隆实验手册》。(冷泉港，纽约冷泉港实验室出版)。Shulaev，V.，Leon，J.，和Raskin，I.(1995).水杨酸是烟草中的系统获得性抗性的转位信号吗。植物细胞7，1691-1701。Uknes，S.，Mauch-Mani，B.，Moyer，M.，Potter，S.，Williams，S.，Dincher，S.，Ch和ler，D.，Slusarenko，A.，WardE.，和Ryals，J.(1992).拟南芥的获得性抗性。植物细胞4，645-656。Uknes，S.，Winter，A.M.，Delaney，T.，Vernooij，B.，Morse，A.，Friedrich，L.，Nye，G.，Potter，S.，Ward，E.，和Ryals，J.(1993).拟南芥的系统获得性抗性的生物学诱导。分子植物-微生物相互作用6，692-698。Vernooij，B.，Friedrich，L.，Goy，P.A.，Staub，T.，Kessmann，H.，和Ryals，J.(1995).2，6-二氯异烟酸诱导的对病原体的不积累水杨酸的抗性。分子植物-微生物相互作用8，228-234。Vernooij，B.，Friedrich，L.，Morse，A.，Reist，R.，Kolditz-Jawhar，R.，Ward，E.，Uknes，S.，Kessmann，H,，和Ryals，J.(1994).水杨酸不是负责诱导系统获得性抗性的转位信号而是在信号衰减中所需的。植物细胞6，959-965。Verwoerd，B.，Dekker，M.，和Hoekema，A.(1989).一种小规模快速分离植物RNA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45GluIleAlaGluMetLysGlyThrCysGluPheIleValThrSerLeu450455460GluProAspArgLeuThrGlyThrLysArgThrSerProGlyValLys465470475480IleAlaProPheArgIleLeuGluGluHisGlnSerArgLeuLysAla485490495LeuSerLysThrValGluLeuGlyLysArgPhePheProArgCysSer500505510AlaValLeuAspGlnIleMetAsnCys*515520(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)长度1194个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1194(D)其它信息/产物＝“NIM1改变的形式”/注释＝“N-端/C-端嵌合体”(xi)SEQIDNO28的序列描述ATGGATTCGGTTGTGACTGTTTTGGCTTATGTTTACAGCAGCAGAGTG48MetAspSerValValThrValLeuAlaTyrValTyrSerSerArgVal151015AGACCGCCGCCTA3AGGAGTTTCTGAATGCGCAGACGAGAATTGCTGC96ArgProProProLysGlyValSerGluCysAlaAspGluAsnCysCys202530CACGTGGCTTGCCGGCCGGCGGTGGATTTCATGTTGGAGGTTCTCTAT144HisValAlaCysArgProAlaValAspPheMetLeuGluValLeuTyr354045TTGGCTTTCATCTTCAAGATCCCTGAATTAATTACTCTCTATCAGAGG192LeuAlaPheIlePheLysIleProGluLeuIleThrLeuTyrGlnArg505560CACTTATTGGACGTTGTAGACAAAGTTGTTATAGAGGACACATTGGTT240HisLeuLeuAspValValAspLysValValIleGluAspThrLeuVal65707580ATACTCAAGCTTGCTAATATATGTGGTAAAGCTTGTATGAAGCTATTG288IleLeuLysLeuAlaAsnIleCysGlyLysAlaCysMetLysLeuLeu859095GATAGATGTAAAGAGATTATTGTCAAGTCTAATGTAGATATGGTTAGT336AspArgCysLysGluIleIleValLysSerAsnValAspMetValSer100105110CTTGAAAAGTCATTGCCGGAAGAGCTTGTTAAAGAGATAATTGATAGA384LeuGluLysSerLeuProGluGluLeuValLysGluIleIleAspArg115120125CGTAAAGAGCTTGGTTTGGAGGTACCTAAAGTAAAGAAACATGTCTCG432ArgLysGluLeuGlyLeuGluValProLysValLysLysHisValSer130135140AATGTACATAAGGCACTTGACTCGGATGATATTGAGTTAGTCAAGTTG480AsnValHisLysAlaLeuAspSerAspAspIleGluLeuValLysLeu145150155160CTTTTGAAAGAGGATCACACCAATCTAGATGATGCGTGTGCTCTTCAT528LeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeuAspAspAlaCysAlaLeuHis165170175TTCGCTGTTGCATATTGCAATGTGAAGACCGCAACAGATCTTTTAAAA576PheAlaValAlaTyrCysAsnValLysThrAlaThrAspLeuLeuLys180185190CTTGATCTTGCCGATGTCAACCATAGGAATCCGAGGGGATATACGGTG624LeuAspLeuAlaAspValAsnHisArgAsnProArgGlyTyrThrVal195200205CTTCATGTTGCTGCGATGCGGAAGGAGCCACAATTGATACTATCTCTA672LeuHisValAlaAlaMetArgLysGluProGlnLeuIleLeuSerLeu210215220TTGGAAAAAGGTGCAAGTGCATCAGAAGCAACTTTGGAAGGTAGAACC720LeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGluAlaThrLeuGluGlyArgThr225230235240GCACTCATGATCGCAAAACAAGCCACTATGGCGGTTGAATGTAATAAT768AlaLeuMetIleAlaLysGlnAlaThrMetAlaValGluCysAsnAsn245250255ATCCCGGAGCAATGCAAGCATTCTCTCAAAGGCCGACTATGTGTAGAA816IleProGluGlnCysLysHisSerLeuLysGlyArgLeuCysValGlu260265270ATACTAGAGCAAGAAGACAAACGAGAACAAATTCCTAGAGATGTTCCT864IleLeuGluGlnGluAspLysArgGluGlnIleProArgAspValPro275280285CCCTCTTTTGCAGTGGCGGCCGATGAATTGAAGATGACGCTGCTCGAT912ProSerPheAlaValAlaAlaAspGluLeuLysMetThrLeuLeuAsp290295300CTTGAAAATAGAGTTGCACTTGCTCAACGTCTTTTTCCAACGGAAGCA960LeuGluAsnArgValAlaLeuAlaGlnArgLeuPheProThrGluAla305310315320CAAGCTGCAATGGAGATCGCCGAAATGAAGGGAACATGTGAGTTCATA1008GlnAlaAlaMetGluIleAlaGluMetLysGlyThrCysGluPheIle325330335GTGACTAGCCTCGAGCCTGACCGTCTCACTGGTACGAAGAGAACATCA1056ValThrSerLeuGluProAspArgLeuThrGlyThrLysArgThrSer340345350CCGGGTGTAAAGATAGCACCTTTCAGAATCCTAGAAGAGCATCAAAGT1104ProGlyValLysIleAlaProPheArgIleLeuGluGluHisGlnSer355360365AGACTAAAAGCGCTTTCTAAAACCGTGGAACTCGGGAAACGATTCTTC1152ArgLeuLysAlaLeuSerLysThrValGluLeuGlyLysArgPhePhe370375380CCGCGCTGTTCGGCAGTGCTCGACCAGATTATGAACTGTTGA1194ProArgCysSerAlaValLeuAspGlnIleMetAsnCys*385390395(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)长度398个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQIDNO29的序列描述MetAspSerValValThrValLeuAlaTyrValTyrSerSerArgVal151015ArgProProProLysGlyValSerGluCysAlaAspGluAsnCysCys202530HisValAlaCysArgProAlaValAspPheMetLeuGluValLeuTyr354045LeuAlaPheIlePheLysIleProGluLeuIleThrLeuTyrGlnArg505560HisLeuLeuAspValValAspLysValValIleGluAspThrLeuVal65707580IleLeuLysLeuAlaAsnIleCysGlyLysAlaCysMetLysLeuLeu859095AspArgCysLysGluIleIleValLysSerAsnValAspMetValSer100105110LeuGluLysSerLeuProGluGluLeuValLysGluIleIleAspArg115120125ArgLysGluLeuGlyLeuGluValProLysValLysLysHisValSer130135140AsnValHisLysAlaLeuAspSerAspAspIleGluLeuValLysLeu145150155160LeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeuAspAspAlaCysAlaLeuHis165170175PheAlaValAlaTyrCysAsnValLysThrAlaThrAspLeuLeuLys180185190LeuAspLeuAlaAspValAsnHisArgAsnProArgGlyTyrThrVal195200205LeuHisValAlaAlaMetArgLysGluProGlnLeuIleLeuSerLeu210215220LeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGluAlaThrLeuGluGlyArgThr225230235240AlaLeuMetIleAlaLysGlnAlaThrMetAlaValGluCysAsnAsn245250255IleProGluGlnCysLysHisSerLeuLysGlyArgLeuCysValGlu260265270IleLeuGluGlnGluAspLysArgGluGlnIleProArgAspValPro275280285ProSerPheAlaValAlaAlaAspGluLeuLysMetThrLeuLeuAsp290295300LeuGluAsnArgValAlaLeuAlaGlnArgLeuPheProThrGluAla305310315320GlnAlaAlaMetGluIleAlaGluMetLysGlyThrCysGluPheIle325330335ValThrSerLeuGluProAspArgLeuThrGlyThrLysArgThrSer340345350ProGlyValLysIleAlaProPheArgIleLeuGluGluHisGlnSer355360365ArgLeuLysAlaLeuSerLysThrValGluLeuGlyLysArgPhePhe370375380ProArgCysSerAlaValLeuAspGlnIleMetAsnCys*385390395(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)长度786个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..786(D)其它信息/产物＝“NIM1改变的形式”/注释＝“NIM1的锚蛋白结构域”(xi)SEQIDNO30的序列描述ATGGACTCCAACAACACCGCCGCCGTGAAGCTCGAGCTTAAGGAGATT48MetAspSerAsnAsnThrAlaAlaValLysLeuGluLeuLysGluIle151015GCCAAGGATTACGAAGTCGGTTTCGATTCGGTTGTGACTGTTTTGGCT96AlaLysAspTyrGluValGlyPheAspSerValValThrValLeuAla202530TATGTTTACAGCAGCAGAGTGAGACCGCCGCCTAAAGGAGTTTCTGAA144TyrValTyrSerSerArgValArgProProProLysGlyValSerGlu354045TGCGCAGACGAGAATTGCTGCCACGTGGCTTGCCGGCCGGCGGTGGAT192CysAlaAspGluAsnCysCysHisValAlaCysArgProAlaValAsp505560TTCATGTTGGAGGTTCTCTATTTGGCTTTCATCTTCAAGATCCCTGAA240PheMetLeuGluValLeuTyrLeuAlaPheIlePheLysIleProGlu65707580TTAATTACTCTCTATCAGAGGCACTTATTGGACGTTGTAGACAAAGTT288LeuIleThrLeuTyrGlnArgHisLeuLeuAspValValAspLysVal859095GTTATAGAGGACACATTGGTTATACTCAAGCTTGCTAATATATGTGGT336ValIleGluAspThrLeuValIleLeuLysLeuAlaAsnIleCysGly100105110AAAGCTTGTATGAAGCTATTGGATAGATGTAAAGAGATTATTGTCAAG384LysAlaCysMetLysLeuLeuAspArgCysLysGluIleIleValLys115120125TCTAATGTAGATATGGTTAGTCTTGAAAAGTCATTGCCGGAAGAGCTT432SerAsnValAspMetValSerLeuGluLysSerLeuProGluGluLeu130135140GTTAAAGAGATAATTGATAGACGTAAAGAGCTTGGTTTGGAGGTACCT480ValLysGluIleIleAspArgArgLysGluLeuGlyLeuGluValPro145150155160AAAGTAAAGAAACATGTCTCGAATGTACATAAGGCACTTGACTCGGAT528LysValLysLysHisValSerAsnValHisLysAlaLeuAspSerAsp165170175GATATTGAGTTAGTCAAGTTGCTTTTGAAAGAGGATCACACCAATCTA576AspIleGluLeuValLysLeuLeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeu180185190GATGATGCGTGTGCTCTTCATTTCGCTGTTGCATATTGCAATGTGAAG624AspAspAlaCysAlaLeuHisPheAlaValAlaTyrCysAsnValLys195200205ACCGCAACAGATCTTTTAAAACTTGATCTTGCCGATGTCAACCATAGG672ThrAlaThrAspLeuLeuLysLeuAspLeuAlaAspValAsnHisArg210215220AATCCGAGGGGATATACGGTGCTTCATGTTGCTGCGATGCGGAAGGAG720AsnProArgGlyTyrThrValLeuHisValAlaAlaMetArgLysGlu225230235240CCACAATTGATACTATCTCTATTGGAAAAAGGTGCAAGTGCATCAGAA768ProGlnLeuIleLeuSerLeuLeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGlu245250255GCAACTTTGGAAGGTTGA786AlaThrLeuGluGly*260(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)长度262个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)SEQIDNO31的序列描述MetAspSerAsnAsnThrAlaAlaValLysLeuGluLeuLysGluIle151015AlaLysAspTyrGluValGlyPheAspSerValValThrValLeuAla202530TyrValTyrSerSerArgValArgProProProLysGlyValSerGlu354045CysAlaAspGluAsnCysCysHisValAlaCysArgProAlaValAsp505560PheMetLeuGluValLeuTyrLeuAlaPheIlePheLysIleProGlu65707580LeuIleThrLeuTyrGlnArgHisLeuLeuAspValValAspLysVal859095ValIleGluAspThrLeuValIleLeuLysLeuAlaAsnIleCysGly100105110LysAlaCysMetLysLeuLeuAspArgCysLysGluIleIleValLys115120125SerAsnValAspMetValSerLeuGluLysSerLeuProGluGluLeu130135140ValLysGluIleIleAspArgArgLysGluLeuGlyLeuGluValPro145150155160LysValLysLysHisValSerAsnValHisLysAlaLeuAspSerAsp165170175AspIleGluLeuValLysLeuLeuLeuLysGluAspHisThrAsnLeu180185190AspAspAlaCysAlaLeuHisPheAlaValAlaTyrCysAsnValLys195200205ThrAlaThrAspLeuLeuLysLeuAspLeuAlaAspValAsnHisArg210215220AsnProArgGlyTyrThrValLeuHisValAlaAlaMetArgLysGlu225230235240ProGlnLeuIleLeuSerLeuLeuGluLysGlyAlaSerAlaSerGlu245250255AlaThrLeuGluGly*260(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO32的序列描述CAACAGCTTCGAAGCCGTCTTTGACGCGCCGGATG35(2)SEQIDNO33的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO33的序列描述CATCCGGCGCGTCAAAGACGGCTTCGAAGCTGTTG35(2)SEQIDNO34的信息(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO34的序列描述GGAATTCAATGGATTCGGTTGTGACTGTTTTG32(2)SEQIDNO35的信息(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO35的序列描述GGAATTCTACAAATCTGTATACCATTGG28(2)SEQIDNO36的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO36的序列描述CGGAATTCGATCTCTTTAATTTGTGAATTTC31(2)SEQIDNO37的信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO37的序列描述GGAATTCTCAACAGTTCATAATCTGGTCG29(2)SEQIDNO38的信息(i)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO38的序列描述GGAATTCAATGGACTCCAACAACACCGCCGC31(2)SEQIDNO39的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑类型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)SEQIDNO39的序列描述GGAATTCTCAACCTTCCAAAGTTGCTTCTGATG3权利要求1.一种编码NIM1蛋白变形体的DNA分子。2.权利要求1的DNA分子，它在SAR信号传导途径中作为一种显性-负性调节子。3.权利要求1的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体在相应于SEQIDNO3的55和59氨基酸位点上以丙氨酸替换丝氨酸。4.权利要求3的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体含有在SEQIDNO23中所示的氨基酸序列。5.权利要求4的DNA分子，其中所说的DNA分子含有在SEQIDNO22和所有DNA中所示的核苷酸序列。6.权利要求1的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体是NIM1基因产物被截短了的版本。7.权利要求1的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体在相应于SEQIDNO3的大约氨基酸位点1-125的N-末端氨基酸被截短。8.权利要求7的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体含有SEQIDNO25中所示的氨基酸序列。9.权利要求8的DNA分子，其中所说的DNA分子含有在SEQIDNO24中所示的核苷酸序列。10.权利要求1的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体在相应于SEQIDNO3的大约氨基酸位点522-593的C-末端氨基酸被截短。11.权利要求22的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体含有SEQIDNO27中所示的氨基酸序列。12.权利要求23的DNA分子，其中所说的DNA分子含有在SEQIDNO26中所示的核苷酸序列。13.权利要求1的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体在相应于SEQIDNO2的大约氨基酸位点1-125的N-末端氨基酸被截短，且在相应于SEQIDNO3的大约氨基酸位点522-593的C-末端氨基酸被截短。14.权利要求13的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体含有SEQIDNO29中所示的氨基酸序列。15.权利要求14的DNA分子，其中所说的DNA分子含有在SEQIDNO28中所示的核苷酸序列。16.权利要求1的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体基本上由相应于SEQIDNO3的大约氨基酸位点103-362的锚蛋白基元组成。17.权利要求16的DNA分子，其中所说的NIM1蛋白变形体含有SEQIDNO31中所示的氨基酸序列。18.权利要求17的DNA分子，其中所说的DNA分子含有在SEQIDNO30中所示的核苷酸序列。19.权利要求1的DNA分子，其中所说的DNA分子在下列条件下与选自SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28和SEQIDNO30的核苷酸序列杂交在1％BSA；520mMNaPO4，pH7.2；7％十二烷基硫酸钠；1mMEDTA；250mMNaCl，55℃杂交18-24小时，55℃下在6×SSC中洗3次，每次15分钟，在3×SSC中洗1次，15分钟。20.一种嵌合基因，它含有一个有效地连接到权利要求1-19中任何一个权利要求的DNA分子上的植物中有活性的启动子。21.一种含有权利要求20的嵌合基因的重组载体，其中所说的载体能够被稳定地转化到宿主细胞中。22.一种在植物中激活SAR的方法，包括用权利要求21的重组载体转化植物，其中所说的NIM1蛋白变形体在所述经转化的植物中表达，且在该植物中激活SAR。23.一种赋予植物广谱抗病性的方法，包括用权利要求21的重组载体转化植物，其中所说的NIM1蛋白变形体在所述经转化的植物中表达，并赋予该植物广谱的抗病性。24.一种赋予植物CIM表型的方法，包括用权利要求21的重组载体转化植物，其中所说的NIM1蛋白变形体在所述经转化的植物中表达，并赋予该植物CIM表型。25.一种用权利要求21的载体稳定地转化的宿主细胞。26.权利要求25的宿主细胞，它是植物细胞。27.一种含有权利要求19的嵌合基因的植物、植物细胞及其后代，它们具有广谱的抗病性。28.一种植物、植物细胞及其后代，其中参与导致植物中系统获得性抗性的信号传导级联反应的NIM1蛋白在所述经转化的植物中以高于野生型植物的水平表达。29.一种权利要求27或28的植物、植物细胞及其后代，其中所说的植物选自裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。30.一种权利要求27或28的植物、植物细胞及其后代，其中所说的植物是作物类植物。31.一种权利要求27或28的植物、植物细胞及其后代，其中所说的植物选自水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、马铃薯、胡萝卜、甜马铃薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、白菜、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、温孛、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜树、芒果、香蕉、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。32.一种赋予植物细胞、植物及其后代CIM表型的方法，其包括用含有嵌合基因的重组载体转化植物，嵌合基因含有一个有效地连接到一种DNA分子的在植物中有活性的启动子，该DNA分子编码参与导致植物中系统获得性抗性的信号传导级联反应的NIM1蛋白，其中所说的载体能够稳定地转化到宿主细胞，其中所说的NIM1蛋白在所述经转化的植物中以高于野生型植物的水平表达。33.一种在植物细胞、植物及其后代中激活系统获得性抗性的方法，其包括用含有嵌合基因的重组载体转化植物，嵌合基因含有一个有效地连接到一种DNA分子的在植物中有活性的启动子，该DNA分子编码参与导致植物系统获得性抗性的信号传导级联反应的NIM1蛋白，其中所说的载体能够稳定地转化到宿主细胞，其中所说的NIM1蛋白在所述经转化的植物中以高于野生型植物的水平表达。34.一种赋予植物细胞、植物及其后代广谱抗病性的方法，其包括用含有嵌合基因的重组载体转化植物，嵌合基因含有一个有效地连接到一种DNA分子的在植物中有活性的启动子，该DNA分子编码参与导致植物系统获得性抗性的信号传导级联反应的NIM1蛋白，其中所说的载体能够稳定地转化到宿主细胞，其中所说的NIM1蛋白在所述经转化的植物中以高于野生型植物的水平表达。35.一种含有权利要求20的嵌合基因的转基因植物或其后代在农业方法中的用途。36.一种含有转基因植物种子的商业袋，其中含有至少一种在所述经转化的植物中以高于野生型植物的水平表达的NIM1蛋白变形体或NIM1蛋白，以及数量足够作为SAR信号传导途径的显性-负性调节子的适当的载体，以及用于其赋予植物广谱抗病性的应用的标签说明。全文摘要本发明涉及一个基因(命名为NIM1)的定位和表征,该基因是SAR途径的重要成分,并与化学和生物诱导因子联合作用诱导SAR基因的表达,并赋予植物广谱的抗病性。NIM1基因产物是哺乳动物信号传导因子IκB的α亚类的结构同系物。本发明利用此发现以提供NIM1的变形体,其作为系统获得性抗性(SAR)信号传导途径的显性—负性调节子。在用这些NIM1变形体转化的植物中,这些NIM1变形体赋予与nim1突变型相反的表型,即转基因植物表现为组成型SAR基因表达和组成型免疫(CIM)表型。本发明进一步涉及在植物中过量表达NIM1基因的转化载体和方法。这样建立的转基因植物具有广谱的抗病性。本发明进一步涉及编码NIM1基因变形体的DNA分子、含有此DNA分子的表达载体以及由其转化的植物和植物细胞。本发明进一步涉及在植物中过量表达NIM1基因的的转化载体和方法。公开了用于在植物中产生过量表达NIM1基因的载体和方法。本发明还涉及在植物中激活SAR,以及通过用编码NIM1基因产物变形体的DNA分子转化植物以赋予植物CIM表型和广谱抗病性的方法。文档编号C12N15/82GK1241215SQ97180553公开日2000年1月12日申请日期1997年12月12日优先权日1997年12月12日发明者J·A·赖亚尔斯,K·A·劳顿,S·J·尤肯斯,H－Y·斯坦纳,M·D·亨特,L·B·弗里德里克申请人:诺瓦提斯公司