水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物抗病技术领域，具体地，涉及水稻0sACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用。
【背景技术】
[0002]水稻是我国的重要粮食作物，全世界一半以上的人口以水稻为主食，病虫害浸染直接影响水稻的生长和产量。例如，由水稻黄单胞菌(Xan thomonas oryzae p v.0ryzae,ibo)引起的白叶枯病是水稻生产中的最严重的细菌性病害，在我国南北各稻区包括广东地区普遍存在，造成的损失巨大。据估计白叶枯病发生时，会导致水稻产量减产20~30%，严重的甚至导致绝收。因此，改善和提高水稻对病原菌胁迫的抗性、培育具有高抗病性的新种质，在促进水稻生产稳步发展、保障我国的粮食安全上具有重要的作用。
[0003]开发水稻抗病基因是提高水稻对病原菌胁迫的抗性、培育具有高抗病性的新种质的有效途径。目前，水稻中已定位至少30个稻瘟病抗性位点和25个白叶枯病抗性位点。其中，抗稻瘟病的Pib和P1-ta和抗白叶枯病的Xa21和Xal基因已经被克隆鉴定。但是，目前水稻的抗病基因资源还不够丰富，而且已报道的这些抗病基因大多都是针对某一特定病害起作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种水稻抗病基因0sACBP5。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种抗病基因0sACBP5在提高水稻抗病性中的应用，尤其是提尚水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病。
[0006]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的: 一种水稻抗病基因08么08?5，该基因的全长5，579 bp (如SEQ ID N0:1所示)，CDS长
I,710 bp (如 SEQ ID NO:2 所示)，编码 570 aa 的蛋白(如 SEQ ID NO:3 所示)。
[0007]发明人通过研宄发现，该基因能够提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病。
[0008]经序列比对发现，本发明水稻抗病基因0sACBP5编码的蛋白与拟南芥AtACBP3蛋白是同源蛋白，同AtACBP3 —样，0sACBP5是唯——个其ACB结构域存在于C末端的ACBP蛋白，其N末端也同样检测到了与AtACBP3相似的信号肽/转膜结构域；氨基酸序列比对分析结果显示，AtACBP3和0sACBP5蛋白中氨基酸序列的相同率为56%。
[0009]水稻0sACBP5基因在提高水稻抗病中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1或2所示ο
[0010]本发明通过比较野生型和过表达转基因(0sACBP5基因)植物对细菌性病菌的耐受性，结果表明基因可以提高植物的抗病能力，尤其是抗稻瘟病和白叶枯病，可以广泛应用于基因工程领域有着巨大的经济价值和应用前景。实施例中虽然中做了对日本晴品种的抗病情况，但是，本发明在保护基因的用途时，对于水稻的品种并不局限于日本晴这种品种。[0011 ] 水稻0sACBP5基因在提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
[0012]一种抗黄单胞菌引起的白叶枯病的水稻的构建方法，包括如下步骤:
51.将SEQID NO:1或2所述的0sACBP5基因克隆到PCXSN-MYC载体；
52.用农杆菌转化法侵染水稻，得到稳定表达的转基因植株。
[0013]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
本发明在水稻中首次发现了《^^3/^基因，该基因的全长5，579 bp，⑶S长1，710 bp,编码570 aa的蛋白。用⑶D、PFAM、SMART、Interproscan程序分析预测，该蛋白有跨膜域和ACBP结构域。通过比较突变体、野生型和过表达转基因水稻的对细菌性病菌的耐受性，发现基因可以提高水稻的抗病能力，可以广泛应用于基因工程领域有着巨大的经济价值和应用前景。
【附图说明】
[0014]图1为SMART程序预测0sACBP5蛋白的结构域，含有跨膜结构域和ACBP结构域。
[0015]图2为黄单胞菌(Xoo)处理16天后野生型、过表达转基因水稻植株的生长情况，CK为野生型水稻。
【具体实施方式】
[0016]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0017]实施例1水稻0sACBP5基因的克隆
根据拟南芥中的AtACBP3的同源蛋白的同源性，在水稻基因组数据中利用Blastp程序进行搜索，得到水稻0sACBP5蛋白，其是唯一一个其ACB结构域存在于C末端的水稻ACBP蛋白，其N末端也同样检测到了与AtACBP3相似的信号肽/转膜结构域。设计正反向引物XS258:CATGGAGCTGTTCTACGAGCTGCTCCTC ；
XS259:TCATTCAGCAGGGATGTCAGAACTCTGT ；
提取水稻叶片RNA，反转录成cDNA后，以上述引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行克隆测序。水稻基因的全长5579 bp (如SEQ ID NO:1所示)，CDS长1710 bp(如 SEQ ID NO:2 所示)，编码 570 aa 的蛋白(如 SEQ ID NO:3 所示)。用 CDD、PFAM、SMART、Interproscan程序分析预测，水稻0sACBP5蛋白有跨膜域和ACBP结构域，见图1。
[0018]实施例2水稻0sACBP5基因的功能研宄
将实施例1所述的基因连接到pCXSN-MYC载体上，具体步骤如下:将通过XS258和XS259引物克隆后的序列(即SEQ ID NO:2所示)序列)，通过TaKaRa的加“A”试剂盒，与用Xcm I进行酶切的pCXSN-MYC载体相连接，在含卡那平板上进行筛选后，通过PCR鉴定并送测序，正确后转化农杆菌。
[0019]将阳性载体利用农杆菌转化法转化到日本晴水稻中，得到稳定表达的转基因植株0sACBP5-0E，具体步骤如下: 将成熟水稻种子消毒后，经盾片诱导培养基诱导产生胚性愈伤，用含有鉴定正确的农杆菌侵染，侵染20 min后将愈伤组织转至加有一张滤纸的共培养基上，然后转入筛选培养基上进行筛选培养。生长旺盛的水稻愈伤在预分化光照培养2-3周，转移到分化培养基上培养至分化出苗，再转至壮苗生根培养基中，最后移栽到人工气候室种植。
[0020]黄单胞菌处理野生型和转基因水稻:分别将野生型(日本晴水稻，Oryzasativa japonica.cv.后续简称为CK)和转基因水稻0sACBP5_0E的成熟种子，去颖壳，用75%酒精浸泡30~45秒，无菌水洗3次，再用20%的次氯酸钠浸泡30分钟，不时摇晃，水洗5次以上；消毒完成后，将三种类型的种子分别置于含有1/2 MS液体培养液的无菌烧杯内培养。然后再种植在1/2 MS固体培养基上，并移入28°C (16-h光照/8_h黑暗)的人工气候室。
[0021]待以上三种水稻生长到20天大小的植株，分别接种黄单胞菌，具体步骤如下:采用剪叶法进行接种，利用剪出2 - 3cm的缺口，将菌龄为3 d，菌液浓度3X108 cfu，，接种后于湿度大于85%的环境中培育。
[0022]选取己完全展开的水稻野生型和转基因植株叶片，用手术剪蘸取菌液，剪切叶片2-3 cm的缺口，接种后90%的环境中培育。
[0023]接种X00 (Pxo99)处理后16天，发现转基因水稻0sACBP5_0E的叶片比对照野生型水稻的叶片病斑长度与叶片总长比值低(见图2)，这说明基因可以提高植物对黄单胞菌的抗性。
【主权项】
1.一种水稻抗病基因0SACBP5，其特征在于，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所不O2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，该基因能够提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病。3.水稻OsACBP5基因在提高水稻抗病中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:1或2所示。4.水稻OsACBP5基因在提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病中的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。5.一种抗黄单胞菌引起的白叶枯病的水稻的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.将权利要求1所述的0SACBP5基因克隆到PCXSN-MYC载体； 52.用农杆菌转化法侵染水稻，得到稳定表达的转基因植株。6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的水稻品种为日本晴。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用。本发明根据同源性分析，在水稻中克隆拟南芥AtACBP3的同源基因OsACBP5。该基因的全长5579bp，CDS长1710bp，编码570aa的蛋白。用CDD、PFAM、SMART、Interproscan程序分析预测，该蛋白有跨膜域和ACBP结构域。通过比较野生型和过表达转基因植物对细菌性病菌的耐受性，结果表明OsACBP5基因可以提高植物的抗病能力，可以广泛应用于基因工程领域有着巨大的经济价值和应用前景。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/29, A01H5/00
【公开号】CN104946666
【申请号】CN201510370321
【发明人】俞陆军, 王凤珠, 戴阳朔, 陈琴芳, 肖仕
【申请人】中山大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月30日