重组人生长激素的制备方法及其peg化修饰物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种治疗儿童内源性重组人生长激素缺乏或不足所导致的身材矮小 症和用于损伤、严重烧伤的手术及后续治疗的基因重组人生长激素修饰物，尤其涉及生长 激素的聚乙二醇修饰物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人生长激素 （human grow th ho rmone, hGH)是人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌 的重要激素，具有促进人体生长发育和维持组织器官功能的生物功能。重组人生长激素 (rhGH)在临床上主要用于治疗儿童的身材矮小症，同时也广泛用于损伤、严重烧伤的手术 及后续治疗。人生长激素 （human growth hormone，HGH)，又称为促生长素（somatotorpin)， 是由191个氨基酸组成的亲水性单链球蛋白，其相对分子质量在22kD左右，等电点PI为 4. 9,分子中存在两对二硫键。
[0003] Genentech Inc (US)第一个克隆了 rhGH，并且其描述于专利 EP-B22242 中。2006年，在美国和欧洲（以及它们的生产商）可获得的合成的生长激素包括 Nutropin (Genentech)、Humatrope (Eli Lilly)、Genotropin (Pfizer)、Norditropin (Novo Nordisk)、Saizen(Merck Serono)和 Omnitrope(Sandoz)〇
[0004] 重组人生长激素（rhGH)是临床上广泛应用于治疗矮小症、严重烧伤、艾滋病 患者的脂肪代谢障碍等多种疾病的药物，体内的半衰期短（0.5小时）。虽然rhGH临 床应用广泛，但由于其在体内的半衰期短，需要每日注射，患者会很痛苦且会产生抗 体，急需开发rhGH长效药物制剂。解决这一问题目前较为理想的方法是用聚乙二醇 (polyethyleneglyco, I PEG)对其进行分子修饰。
[0005] 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)是一种安全的、无活性、无毒的聚合物，常 用于分子修饰。用聚乙二醇修饰蛋白质在治疗上的益处包括减少肾脏与细胞清除，延长半 衰期；增强对蛋白水解的保护；降低毒性。使生物活性蛋白质聚乙二醇化的目的是改善其 药物动力学与药效学性能，而保留天然蛋白质的内在生物学活性。为提高药理学活性和临 床疗效，需对聚乙二醇蛋白质的药物动力学与药效学进行优化，而PEG聚合物链的结构、长 度、分子量以及修饰方法等均是影响优化的因素。
[0006] 聚乙二醇修饰蛋白质技术已谈广泛应用于生物医药领域，到目前为止FDA批量准 的聚乙二醇修饰蛋白有聚乙二醇腺苷脱氨酶、聚乙二醇天冬酰氨酶、聚乙二醇干扰素等。
[0007] 传统的利用大肠杆菌表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径，一种是生产 分泌型的重组人生长激素，一种则是生产胞内型。经实践验证，生产分泌型的重组人生长激 素，虽然步骤简单，杂蛋白干扰较少，氧化型的环境利于蛋白折叠，但是其表达量很低，一般 要和胞内型要差1个数量级以上。但是生产胞内型的蛋白却又存在工艺步骤复杂、杂蛋白 干扰较多等缺点。此外，采用上述两种方法所得到的人生长激素还存在活性低、纯度低等 缺。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种重组人生长激素的制备 方法，该方法表达量相对较高、便于操作，可以提高有效药物的纯度和活性，可以在不增加 成本的条件下增加产物的纯度和活性，从而使药物有更高的活性。本发明的另外一个目的 是提供重组人生长激素 PEG化修饰物的制备方法，该方法通过聚乙二醇化来修饰药物，使 得聚乙二醇和人生长激素通过共价连接而成，增加药物的半衰期和减少药物蛋白的毒副作 用。
[0009] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0010] -种用于重组人生长激素制备的基因，该基因的序列如SEQ ID NO :2所不。
[0011] 一种用于重组人生长激素制备的表达基因片断，该基因片断为在权利要求1所述 的基因序列5'末端依次增加两段基因序列，两段基因序列分别为Factor Xa蛋白酶切位点 序列FX和HIS标签序列HIS6 ;得到表达基因片断HIS6-FX-HGH。
[0012] 一种用于重组人生长激素制备的表达基因片断，该基因片断为将分子伴侣 troponin C全长基因序列SEQ ID NO :3克隆出来并在其3'末端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp构建得到troponin C-pp ;然后将其连接到基因片断 HIS6-FX-nHGH 的 5' 末端。
[0013] 一种用于重组人生长激素制备的重组表达载体，该重组表达载体由上述任意一项 基因或表达基因片断克隆进入PET-22b载体制得。
[0014] 一种用于重组人生长激素制备的菌株，该菌株由上述的重组表达载体转入到大肠 杆菌DE3菌株中制备得到。
[0015] -种重组人生长激素的制备方法，该方法包括以下的步骤：
[0016] 1)根据人生长激素 HGH全长序列SEQ ID NO :1设计引物，获得优化的基因 HGH，基 因 HGH的序列如SEQ ID NO :2所示，基因序列5'末端依次增加两段基因序列，分别为Factor Xa蛋白酶切位点序列FX和HIS标签序列HIS6,得到表达基因片断HIS6-FX-HGH ;
[0017] 2)将基因片断HIS6-FX-HGH克隆进入PET-22b载体中即为重组表达载体 PET-22b-HIS6-hgh，相应表达出的重组蛋白为 PET-22b-HIS6-FX-hgh ;
[0018] 3)接着再将分子伴侣troponin C全长基因序列SEQ ID NO :3克隆出来并在其 3'末端加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp构建得到troponin C-pp;然 后将其连接到基因片断HIS6-FX-nHGH的5'末端，最后一起克隆进入pET-22b载体，即重 组为表达载体pET-22b_troponin C-pp-HIS6-FX_HGH，相应表达出的重组蛋白为troponin C-HIS6-FX-HGH ；
[0019] 4)将步骤3)中构建好的表达载体pET-22b-troponin C-HIS6-FX-HGH转入 到大肠杆菌DE3菌株中，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；同时将含有 Prescission Protease的质粒转入Rosseta菌株，同样用IPTG储液诱导表达，离心收集菌 体；然后将两种菌体混合在一起；
[0020] 5)用PB缓冲液重悬得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液；调整PH值为 7. 0-8. 0,低温振荡使Prescission Protease将重组蛋白酶切完全，释放出中间阶段的 HIS6-FX-nHGH蛋白，得到含有人生长激素的溶液；
[0021] 6)将含有人生长激素的溶液进行纯化处理，得到含有人生长激素的精品。
[0022] 作为优选，为了得到和天然序列完全一致的HGH蛋白，本发明利用Factor Xa蛋白 酶去除HIS6的标签，露出其本来的氨基端，这样进入人体后不会产生抗体，步骤5)得到的 含有HIS6-FX-nHGH蛋白的溶液调整到pH为8. 0,加入Factor Xa蛋白酶进一步酶切，最终 释放出和人体中天然的HGH蛋白序列完全一致的蛋白nHGH。
[0023] 对于将含有人生长激素的溶液进行纯理的方法，在现有技术中有很多中，但是大 都存在纯化率低、纯化工序复杂等缺点，本发明提供一种最简单的、纯化率较高的最佳方 法，具体如下：步骤6)中对含有人生长激素的溶液进行纯化的具体步骤为，调整上述溶 液的PH值为7. 0-8. 0,然后上镍离子亲和柱，用PB缓冲溶液上柱，50mM咪唑洗脱杂蛋白， 200mM咪唑洗脱目的蛋白；透析过夜，再进行DEAE纯化，用PB缓冲溶液上柱，用0. 2MNaCl洗 脱，即得到高纯度的重组人生长激素。纯度达到95%以上。
[0024] 与现有的技术相比，利用本发明的基因重组表达方法，首先，采用优化基因序列去 除稀有密码子来提高蛋白产量，第二加入分子伴侣蛋白来帮助目的基因在胞内的正确表达 方法；第三，加入HIS6的标签辅助纯化，保证目的蛋白快速高效的分离；第四使用Factor Xa蛋白酶去除HIS6的标签，得到与天然序列完全一致的蛋白。总之本发明所述的方法可以 兼顾表达产量，纯化工艺、产物活性和最终的氨基酸组成，具有很高的应用价值。
[0025]