植物抗病性相关蛋白VrNPR1及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种植物抗病性相关蛋白VrNPRI及其 编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 绿豆（Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)，属于豆科，在中国已有两千年的栽培史。 是我国重要的粮食作物。因其具有重要的营养价值和医用价值，现已作为重要的功能型食 品进行开发。近年来，随着种植业结构的调整和人们膳食结构的改变，人们对绿豆的需求量 日益增加，种植面积逐年扩大。研宄表明病虫害严重影响绿豆种子萌发和产量等方面。鉴 于此，深入研宄绿豆NPR1参与抗病的机理，对筛选出抗病较强的品种及抗病育种材料的筛 选具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物抗病性相关蛋白 VrNPRI及其编码基因与应用。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种植物抗病性相关蛋白VrNPRI，来源于 绿豆（Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替 换和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0005] 所述一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸 残基的替换和/或缺失和/或添加。
[0006] 本发明还提供了一种与植物抗病性相关的基因VrNPRI，所述基因可编码前述植物 抗病性相关蛋白VrNPRI。
[0007] 进一步地，所述基因含有如SEQ ID No. 2中第7_1782bp所示的核苷酸序列。
[0008] 更进一步地，当所述基因用于构建重组载体、工程菌、转基因细胞系或表达盒时， 可根据本领域常规技术在其末端构建酶切位点。
[0009] 在本发明的一个【具体实施方式】中，本发明提供一个5'末端的第1-6位核苷酸是 SacI酶切位点，第1783-1788位核苷酸是Sail的酶切位点的核苷酸序列，该核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
[0010] 本发明还提供了用于扩增前述基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
[0011] 本发明还提供了含有前述基因的载体，所述载体为将前述基因插入载体 PCAMBIA2300的SacI和Sail酶切位点之间得到的重组表达载体。
[0012] 本发明还提供了含有前述基因的工程菌。
[0013] 本发明还提供了前述基因在培育转基因植物提高抗病性中的应用。
[0014] 进一步地，所述应用为利用前述重组表达载体或工程菌将所述与植物抗病性相关 的基因VrNPRI导入目的植物得到抗病性提高的转基因植物。
[0015] 其中，所述抗病性为抗白叶枯病。
[0016] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物优选禾本科植物，具体可 为稻属植物，更具体可为水稻品种"日本晴"。
[0017] 本发明的有益效果在于：
[0018] 本发明的实验证明，本发明从豆科植物绿豆中筛选到一个基因VrNPRl，通过农杆 菌转化法将VrNPRl导入水稻，经过潮霉素初筛、分子检测、接种白叶枯菌检测抗病性等手 段，筛选到抗病能力显著提高的转基因水稻株系。本发明对于培育抗病转基因豆科作物具 有重要价值。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所述载体pCAMBIA2300-VrNPRl构建流程图。
[0020] 图2为本发明1\代转基因水稻的PCR检测结果；
[0021] 其中：M :lkb DNA ladder，由下到上分别为 250bp，500bp，750bp，lOOObp，1500bp， 2000bp ;16 :阴性对照；17 :阳性对照，pCAMBIA2300-VrNPRl 载体；1、2、4-8,10 和 13-15 :PCR 鉴定阳性植株；3、9、115和12 :PCR鉴定阴性植株。
[0022] 图3为本发明代转基因水稻和野生型水稻接种白叶枯菌菲律宾6号小种PX099 两周被接种叶片的照片。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0027] pCAMBIA2300-Actin载体：公众可从中国科学院遗传与发育生物学研宄所获 得；参考文献：Kejian Wang，Ding Tang，Lilan Hong，WenyingXu，Jian Huang，Ming Li， Minghong Gu，Yongbiao Xue，Zhukuan Cheng. DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice. January 2010. Volume 6〇
[0028] 中绿5号绿豆种子：由中国农业科学院作物科学研宄所培育（该种子向公众免费 赠予）。
[0029] 农杆菌 EHA105 记载在 Days to heading 7, a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity and regional adaptation in rice, He Gao et al，PNAS，2014, 111 (46)，16337 - 16342中，公众可以从中国农业科学院作物科学研宄所获 得。
[0030] 白叶枯菌菲律宾6号小种PX099 :公众可从中国农业科学院作物科学研宄所获得； 参考文献：郑崇珂，王春连，于元杰，梁云涛，赵开军.水稻抗白叶枯病新基因Xa32(t)的鉴 定和初步定位?作物学报，2009, 35(7) :1173-1180。
[0031] 实施例lVrNPRl基因的克隆
[0032] 1、设计特异性引物对（VrNPRl _ 5'和VrNPRl _ 3'），由Invitrogen公司合成。
[0033] VrNPRl_5' ：5' -GAGCTCATGGCAGCTTATTCAGCCGAACCC-3' ；
[0034] VrNPRl - 3 ' ： 5 ' -GTCGACATTCACTTTCCTAGCCCTGTAATGTAC-3 '。
[0035] 2、提取绿豆（Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)整株植物的 RNA，反转录为 cDNA ;
[0036] 3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1的特异性引物对VrNPRl-5'和VrNPRl-3'进 行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0037] 4、将步骤3的PCR扩增产物进行测序。
[0038] 测序结果为，该PCR产物的基因的序列为序列表中的序列2,编码区为序列2的自 5'末端的第7-1782位核苷酸，自5'末端的第1-6位核苷酸是SacI酶切位点，第1783-1788 位核苷酸是Sail的酶切位点。将该基因命名为VrNPRl，该基因编码的蛋白命名为VrNPRl， 该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1所示，序列1由591个氨基酸残基组成。
[0039]5、将上述PCR产物插入pMD18T_simple载体（购自TaKaRa生物工程公司），得到 载体pMD18T-simple_VrNPRl，测序，结果为载体pMD18T-simple_VrNPRl为将序列表中的序 列2插入pMD18 T-simple载体得到的载体。
[0040] 实施例2转基因水稻的获得和功能研宄
[0041] -、转基因拟南芥的获得
[0042] 1、重组载体（pCAMBIA23〇〇-VrNPRl)的构建
[0043] 构建过程如图1所示。
[0044] (1)用限制性内切酶SacI和Sail双酶切载体pMD18 T-simple-VrNPRl，回收小片 段。
[0045] (2)用限制性内切酶 SacI 和 Sail 双酶切 pCAMBIA2300 (购自 Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture, www. cambia. org), 回收载体骨架。