一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法及其应用，是利用鹰嘴豆豆瓣、鹰嘴 豆渣为原料制备的具有抗菌活性的多肽部位，具有抗细菌、抗真菌等生物活性，在医药、食 品领域具有很好的应用前景。
【背景技术】
[0002] 抗生素的发现曾是人类医学史上的一个里程碑。然而，由于抗生素的滥用而不时 地引起耐药菌的出现，而且出现的频率超过新型抗生素的开发速度，使得许多曾经高度有 效的抗生素药物失效，以至于给感染性疾病的治疗带来诸多新的问题，传统抗生素的使用 正面临着严峻的挑战。研宄和应用无毒、无公害、无耐药的新型抗菌制剂替代抗生素已成发 展趋势。
[0003] 植物在生长过程中每天要与环境中几百万种的病原菌接触，随时都可能遭受微生 物的侵袭，而植物没有象哺乳动物那样特异的免疫系统，因而非特异的天然免疫体系对植 物起着重要的保护作用。人们发现，生物受到微生物感染后，迅速、大量产生具有抗菌活性 的小分子多肽（即抗菌肽）参与机体免疫。抗菌肽几乎是所有生物中都有的重要免疫分子， 是植物非特异天然免疫体系的重要组成部分。目前已从微生物、植物、昆虫、节肢动物、两栖 动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出上千种抗菌肽，这类抗菌肽在合成机制、氨基酸组成和作 用机制等方面不同于传统的微生物（包括细菌、真菌和链霉菌等）产生的多肽类抗生素。抗 菌肽作为传统抗生素的可能替代物以其无比优越的特性越来越成为人们关注的热点。抗菌 肽（antibacterial peptide, ABP)又称抗微生物肽（antimicrobial peptide, AMP)或肽抗 生素（peptide antibiotics)，是广泛存在于自然界生物中的一种具有抗茵、抗病毒、抗寄 生虫、提高机体免疫力等生物学功能的活性多肽，它是生物非特异性防御系统的免疫应答 产物，具有广谱抗菌活性，不仅可以抑制多种细菌或真菌，甚至可以在不伤及正常细胞的情 况下抑制动物体内的肿瘤细胞。抗菌肽是机体天然免疫系统的重要组成部分，并能够在机 体发生特异性免疫应答之前发挥抗感染作用。目前，抗菌肽的研宄和开发已成为国内外研 宄的热点之一。抗菌肽具有广谱抗菌和其它优良的特性，与它自身的结构特点密不可分。虽 然抗菌肽种类繁多，来源也不同，但它们的一级结构（即氨基酸序列）具有较强的保守性。 抗菌肽相对分子质量小（〈10KD左右）。而植物抗菌肽一般为40-90个氨基酸残基组成的多 肽，富含半胱氨酸，通常具有数个折叠和一段a-螺旋结构。不同来源、不同结构的抗 菌肽的一级结构（即氨基酸序列）具有较强的保守性，且具有以下共同特点：
[0004] ①N端富含极性氨基酸，如赖氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)等，呈强碱性，含过剩的正 电荷，使抗菌肽呈阳离子特性，这一特征使抗菌肽具有表面活性剂活性；；②C端通常酰胺 化，呈中性疏水性，富含丙氨酸（Ala)、缬氨酸（Val)、甘氨酸（Gly)等非极性氨基酸，这可能 与抗菌肽的广谱抗菌活性有关；③中间连接部分富含脯氨酸（Pro)，末端大多酰胺化，它也 直接影响抗菌肽的杀菌活性；④大部分抗菌肽在第二位上的氨基酸为色氨酸（Trp)，它对 抗菌肽的杀菌活性的高低起着至关重要的作用。
[0005] 传统抗生素是通过消除微生物生长或生存必需的功能，如阻挠细菌蛋白质的合成 或者改变酶的活性来达到杀菌目的，而细菌通过改变一种基因就足以对付抗生素的这种进 攻。抗菌肽则作用于细菌细胞膜，导致膜的通透性增大，以此穿透、杀灭细菌。细菌必须改 变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的。因此， 抗菌肽极大地减少了产生耐药性的可能，这也是与抗生素相比的一大优势。抗菌肽是动物 机体分泌的小分子短肽，也是机体成分之一，因此具有安全无毒副作用的生物学特性，从而 避免了传统抗生素类药物对机体免疫系统的损害。抗菌肽在100°c加热lOmin条件下仍能 保持活力，对pH值有较强适应性，水溶性好。抗菌肽对正常的真核细胞几乎没有杀伤作用， 只作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。其原因在于：
[0006] 由于高等动物细胞膜上有大量的胆固醇和蛋白质，特别是前者，阻碍抗菌肽的疏 水面插入磷脂双分子层中。
[0007] 哺乳动物细胞膜外层脂质为其所特有的呈电中性的两性磷脂，主要是卵磷脂和鞘 磷脂；而细菌细胞膜则含有大量的带有负电荷的磷脂（如磷脂酰甘油和心磷脂），且有时其 含量会超过50 %，使其必然暴露于细胞外膜；此外，革兰阴性菌细胞壁主要由带大量负电 荷的脂多糖组成。
[0008] 可能是由于微生物与高等动物细胞膜的膜外结构的区别：高等动物细胞膜外表面 的唾液酸与膜的距离有80 A，它可能与抗菌肽的带正电区结合而阻止抗菌肽接近细胞膜发 挥杀伤作用。
[0009] 哺乳动物的真核细胞中存在着高度发达的细胞骨架系统，其中的微丝和微管与细 胞膜内层有许多结合位点，这种结构是维持细胞特殊形状和渗透压的首要因素，高度发达 的细胞骨架系统，在哺乳动物细胞对抗菌肽溶胞作用的敏感性上发挥着重要作用。
[0010] 目前食品工业中的防腐剂主要以山梨酸、苯甲酸及其盐类等化学合成剂为主，此 类化合物容易在加工过程中超标而对人体造成危害。抗菌肽用作食品防腐保鲜剂不仅具有 广谱抗菌活性、有效杀灭霉腐微生物，而且抗菌肽分子量较小、热稳定性强、水溶性好、无 免疫原性、对人无毒副作用，另外抗菌肽在人体内还可以被蛋白酶降解，双重安全的保证使 得抗菌肽在食品工业领域逐渐显示出广阔的应用前景。
[0011] 医药工业是抗菌肽应用最为广泛和最有前途的行业，随着抗生素的长期广泛应 用，许多病源菌对它们产生了耐药性，抗生素添加剂的使用则严重破坏了动物肠道的微生 物平衡，且易在动物体内残留，严重影响畜产品质量和人类健康，而具有广谱抗菌且有独特 抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研宄中具有明显优势。随着人们对抗菌肽结构与活 性的关系、抗菌肽作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深入，将抗菌肽与病原体表 面特异受体结合的配体连接，完全有可能设计出一批能够特异作用于肿瘤、真菌或病毒的 高效肽类抗生素、抗肿瘤药物、抗病毒药物，使人类摆脱此类疾病的折磨，给医药卫生的发 展和疾病治疗带来不可估量的现实意义。
[0012] 癌症是人类疾病中的一大难题，目前使用的化疗药物能杀死癌细胞，但也同时杀 死人体内正常细胞，副作用极大。抗菌肽能抑制某些肿瘤细胞的生长而对人体正常细胞无 害，极有可能成为无毒或低毒的抗肿瘤新药，这给抗癌药物的开发带来了希望。
[0013] 抗菌肽在化妆品上用作防腐剂，鱼类抗菌肽不仅是营养成分，更重要的是它的抗 菌和美容作用，比化学防腐剂用于化妆品具有独特的优势和广泛的市场潜力。
[0014] 抗菌肽在农业和畜牧业中的应用：1、抗菌肽作为饲料添加剂普通抗生素的作用具 有专一性，而且容易使机体产生抗药性，导致产生的作用效果不佳。抗菌肽不仅具有广谱抗 菌作用，而且对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌 耐药性的一类环保型制剂，可作为畜禽饲料添加剂取代或部分取代目前饲养动物所用的抗 生素，减少抗生素对动物体的危害以及减少动物养殖中对药物的依赖。2、转基因动物借鉴 已成功的昆虫抗菌肽转基因工程，如转基因蚊子、转基因马铃薯、转基因水稻等，把特异的 抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种，开辟了一条发展畜牧生产 的新思路。3、在绿色畜牧业发展中发挥重要作用：由于抗生素在畜禽生产中的大量的使用。 药物在畜禽体内严重残留及其耐药微生物的产生使动物性食品的安全性问题日益突出，这 严重威胁着人民身体健康和整个养殖业的可持续发展，也给我国畜产品出口贸易带来了巨 大的损失。抗菌肽具有广谱抗菌活性且快速杀菌，不受传统抗生素耐药突变株影响，不易产 生耐药菌株，与传统抗生素协同作用，中和内毒素和在动物体内起有效作用等特性。所以在 绿色、安全、环保的畜牧业发展中，抗菌肽也发挥着重要的作用。
[0015] 抗菌肽在植物领域的研宄与应用:植物病害多达数百种，几乎所有作物在生长期 内都会遭到不同程度的危害，培育抗病新品种是防治植物病害的根本途径。抗菌肽具有广 谱杀菌效果及不易引起病原微生物产生耐药性等优点。因而，将抗菌肽基因转入农作物，是 培育作物抗病新品种的有效策略。
[0016] 抗氧化剂和抗氧化多肽：随着人们生活水平提高和生活方式的改变，